采用hplc同時(shí)測(cè)定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥、食品、保健品等行業(yè)領(lǐng)域，具體是一種同時(shí)測(cè)定具有生物活性的天然產(chǎn)物的HPLC方法，特別是涉及一種應(yīng)用于HPLC中的波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換技術(shù)，用于同時(shí)檢測(cè)金銀花中綠原酸，木犀草素，木犀草苷3種抗氧化活性成分。
【背景技術(shù)】
[0002]金銀花是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，為忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或待初開(kāi)的花。其味甘，性寒，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱，疏利咽喉、消暑除煩的作用，可治療暑熱癥、瀉痢、流感、瘡癤腫毒、急慢性扁桃體炎、牙周炎等病。金銀花主要含有揮發(fā)油、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)等生物活性成分。其中，以木犀草苷及其代謝前體木犀草素為代表的黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多種藥理作用。
[0003]目前天然產(chǎn)物的檢測(cè)方法有很多，主要有:紫外分光光度法、可見(jiàn)分光光度法、二階導(dǎo)數(shù)光譜法、系數(shù)倍率法薄層色譜掃描法(TLC法)、高效液相色譜法(HPLC法)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC法)、導(dǎo)數(shù)極譜法和HPLC法與其它方法的聯(lián)用。目前，隨著分析檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比如薄層色譜、分光光度法等逐漸地被精確的檢測(cè)方法所取代。高效液相色譜法、氣相色譜法等已經(jīng)成為主流的檢測(cè)方法。這些方法相對(duì)于傳統(tǒng)方法，能夠檢測(cè)到天然產(chǎn)物單體化合物的含量，得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)更精確。
[0004]綠原酸和木犀草苷是藥材金銀花中的代表性藥效成分，中國(guó)藥典2000年版公布了用高效液相法測(cè)定金銀花中綠原酸含量的方法，2005年版新增并建立了用高效液相色譜法(HPLC法)來(lái)測(cè)定木犀草苷含量的標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于綠原酸與木犀草苷分子結(jié)構(gòu)差異較大，要采用不同的HPLC分析方法對(duì)兩種物質(zhì)含量進(jìn)行分別測(cè)定，需要用到兩種不同的色譜柱及檢測(cè)條件，工作量大，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，不利于快速分析和大批量樣品質(zhì)量控制的需要。
[0005]中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利201110031466.4提出一種HPLC波長(zhǎng)切換同時(shí)測(cè)定白芍及炮制品中9種成分含量方法，該方法利用同一種檢測(cè)條件和波長(zhǎng)切換的方法，既可以達(dá)到增加質(zhì)量覆蓋面的目的，又可以保證每種成分在最大吸收波長(zhǎng)處被檢測(cè)，提高檢測(cè)靈敏度。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利201210079072.0提出一種HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定牡丹皮、大黃牡丹皮藥對(duì)及含大黃牡丹皮藥對(duì)的制劑中多種成分含量的方法，該方法利用多不同時(shí)間段的不同梯度洗脫條件以及不同的檢測(cè)波長(zhǎng)，可依次測(cè)定樣品中1-6種成分的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)目前對(duì)于金銀花中多種有效成分同時(shí)檢測(cè)方法的存在空白缺失，以及HPLC檢測(cè)方法在多種中藥材成分檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種靈敏度和精確度高，工作流程簡(jiǎn)便的采用HPLC同時(shí)測(cè)定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法。
[0007]本發(fā)明建立一種基于HPLC的檢測(cè)方法，首次提出基于HPLC轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)技術(shù)及梯度洗脫技術(shù)應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)金銀花中的3種標(biāo)志性有效成分綠原酸、木犀草素和木犀草苷的方法。本發(fā)明方法根據(jù)金銀花中3種有效成分分子性質(zhì)的差異，運(yùn)用HPLC梯度洗脫技術(shù)控制其洗脫時(shí)間，以及根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)及波譜性質(zhì)差異，運(yùn)用波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換技術(shù)，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)的目的；采用梯度洗脫和檢測(cè)器波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換技術(shù)，通過(guò)調(diào)節(jié)色譜條件(流動(dòng)相、柱溫、流速、波長(zhǎng)等)，實(shí)現(xiàn)金銀花中綠原酸、木犀草素和木犀草苷3種抗氧化活性成分的同時(shí)定量檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]采用HPLC同時(shí)測(cè)定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步驟:
[0010]1)測(cè)試樣溶液的配制:取干燥的金銀花或其植物葉莖0.5?2.0g，切細(xì)并攪碎后放置容器中，加質(zhì)量濃度為50?80%乙醇5?20ml，超聲處理，過(guò)0.45μπι的濾膜，添加乙醇定容，得測(cè)試樣溶液；
[0011]2)測(cè)定金銀花中3種有效成分綠原酸、木犀草素和木犀草苷的含量:取步驟1)的測(cè)試樣溶液，上0DS色譜柱，梯度洗脫:洗脫液為乙腈與磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的質(zhì)量濃度為0.1?1.0% ;流動(dòng)相中乙腈的濃度梯度隨時(shí)刻的變化情況如下:
[00?2] (1)第一梯度，從起始時(shí)刻O(píng)min至?xí)r刻ti，質(zhì)量百分比計(jì)，乙腈由初始的Caq上升到CAi;ti = 5?13min;CAo = 0.1 ?10% ;Cai=13?18% ；
[0013](2)第二梯度，從起始時(shí)刻乜至?xí)r刻t2，乙腈A由CA1上升到CA2 ； t2= 15?22min ； CA2 =20?26% ；
[0014](3)第三梯度，從時(shí)刻t2至?xí)r刻t3，乙腈A由Ca2上升到Ca3; t3 = 23?30min;CA3 = 28?35% ；
[0015](4)第四梯度，從t3至?xí)r刻t4，乙腈A由Ca3下降至Caq; t4=35?45min;
[0016]控制洗脫液流速為0.5?1.0mL/min，柱溫為20?40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)在初始時(shí)刻to至?xí)r刻丨5期間采用320?340nm，然后轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)為345?365nm進(jìn)行檢測(cè)；t5 = 10?18min;依次測(cè)定，計(jì)算出金銀花中3種有效成分綠原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。
[0017]優(yōu)選地，所述超聲處理的時(shí)間為10?50分鐘。
[0018]優(yōu)選地，所述超聲處理重復(fù)2次，合并2次超聲處理的提取液。
[0019]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0020]1)本發(fā)明首次提出基于HPLC轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)技術(shù)及梯度洗脫技術(shù)，應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)金銀花中的3種標(biāo)志性有效成分綠原酸、木犀草素、木犀草苷的方法，該方法與傳統(tǒng)檢測(cè)手段相比具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、精密度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，對(duì)金銀花藥材及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
[0021]2)減少工作流程。與中國(guó)藥典(2010年版)中所錄方法相比，本發(fā)明方法運(yùn)用波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換技術(shù)，能在同一色譜柱、同一色譜條件下上完成3種標(biāo)志性有效成分的檢測(cè)，縮短了一半以上的檢測(cè)工作流程；
[0022]3)提高檢測(cè)的靈敏度和精確度。本發(fā)明方法采用梯度洗脫，洗脫過(guò)程中調(diào)整流動(dòng)相乙腈與磷酸水的混合比例，使極性小的組分加快洗脫流出，使三個(gè)組分出峰時(shí)間分得較開(kāi)，峰形好，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和精確度。
[0023]4)增加金銀花樣品質(zhì)量覆蓋面。中國(guó)藥典(2010年版)把綠原酸與木犀草苷的含量作為金銀花的檢測(cè)指標(biāo)，而實(shí)際上木犀草素作為木犀草苷的代謝前體或代謝產(chǎn)物，同樣存在在植物體內(nèi)，并且木犀草苷進(jìn)入人體后經(jīng)代謝成木犀草素后發(fā)揮其生物活性。因此同時(shí)測(cè)定綠原酸、木犀草素、木犀草苷3種有效成分有利于增加金銀花樣品質(zhì)量的檢測(cè)指標(biāo)，擴(kuò)大其有效成分檢測(cè)的覆蓋面。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限如此。
[0025]實(shí)施例1
[0026]采用HPLC同時(shí)測(cè)定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步驟:
[0027]1.測(cè)試樣溶液的配制:取干燥金銀花0.5g，精密稱(chēng)定，切細(xì)并置具塞錐形瓶中，加入10m質(zhì)量濃度為60 %乙醇，超聲處理20min，倒出上清液，再加入10ml質(zhì)量濃度為60 %乙醇，重復(fù)超聲提取20min，合并提取液，過(guò)0.45μηι的濾膜，添加乙醇定容至50ml，得到金銀花測(cè)試樣溶液。
[0028]2.對(duì)照樣溶液的配制:分別精確稱(chēng)取一定量的綠原酸、木犀草素、木犀草苷對(duì)照品，于三個(gè)燒杯中充分溶解，用乙醇制成分別含綠原酸20yg/mL、木犀草素15yg/mL、木犀草苷15yg/mL的對(duì)照樣溶液。
[0029]3.測(cè)定金銀花中3種有效成分綠原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色譜法，應(yīng)用波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換及梯度洗脫技術(shù):取一份步驟1制備得到的測(cè)試樣溶液，上0DS色譜柱(150X4.6πιπι，2μπι)，梯度洗脫，以質(zhì)量百分比計(jì)，洗脫液為乙腈-0.2%磷酸水混合液；第一梯度洗脫，由初始Omin時(shí)刻乙腈3 % (0.2 %磷酸水占97 % )上升至9min時(shí)乙腈13 % (0.2 %磷酸水占87%);第二梯度洗脫間，由9min乙腈13%上升至18min時(shí)乙腈22% (0.2%磷酸水占78%)；第三梯度洗脫由18min時(shí)乙腈22 %上升至27min時(shí)乙腈占32 % (0.2 %磷酸水68 % )；第四梯度洗脫由27min時(shí)乙腈32 %下降至42min時(shí)乙腈占3 % (0.2 %磷酸水97 % )。洗脫液流速控制為0.5mL/min，柱溫為25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)初始為325nm，在12min后轉(zhuǎn)換為350nm;理論塔板數(shù)不低于3000。
[0030]4.對(duì)步驟2的三個(gè)對(duì)照品混合溶液分別搖勻，過(guò)0.45μπι的濾膜，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，在步驟3的色譜條件下分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定；以進(jìn)樣量(X，yg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。
[0031]5.將步驟3測(cè)得的測(cè)試結(jié)果與步驟4得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比。
[0032]精密度考察
[0033]精密吸取測(cè)試樣溶液lOyL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得綠原酸、木犀草素、木犀草苷峰面積的1?0均小于3%。
[0034]穩(wěn)定性考察
[0035]取測(cè)試樣溶液，分別在12小時(shí)內(nèi)進(jìn)樣10yL，測(cè)得綠原酸、木犀草素、木犀草苷峰面積的1?0均小于3%。
[0036]重復(fù)性考察
[0037]取金銀花樣品5份，每份0.5?2.0g，精密稱(chēng)定，按步驟1方法平行制備5份測(cè)試樣溶液，分別進(jìn)樣10yL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)得綠原酸、木犀草素、木犀草苷峰面積的RSD均小于3%。
[0038]加樣回收率考察
[0039]取已知綠原