一種觀察微納尺度蛋白質(zhì)晶體從溶液中析出的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種觀察蛋白質(zhì)晶體從溶液中析出的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，獲取高質(zhì)量晶體是利用X-射線衍射技術(shù)解析蛋白質(zhì)精細三維結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，也是此技術(shù)的瓶頸問題。由于很多蛋白質(zhì)難以結(jié)晶或難以獲得尺寸適當?shù)膯尉?，因此，突破傳統(tǒng)X射線單晶衍射技術(shù)解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)成為新的研究熱點。最近，利用自由電子激光(free electron lasers,XFELs)對大量微納尺度的蛋白質(zhì)晶體進行衍射，進而獲得衍射數(shù)據(jù)解析結(jié)構(gòu)的方法，已成為X射線衍射技術(shù)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最前沿的研究方向。為了實現(xiàn)該技術(shù)，必須獲取微納尺度的蛋白質(zhì)晶體。由于該晶體尺寸太小，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡很難或根本觀察不到晶體的出現(xiàn)或存在，因此對微小晶體的觀察和檢測成為了技術(shù)的關(guān)鍵。
[0003]文獻I “Selective detect1n of protein crystals by second harmonicmicroscopy,2008,Journal of the American Chemical Society,130(43):14076-14077，”D Ronald等發(fā)現(xiàn)二次諧波技術(shù)可以有選擇的探測蛋白質(zhì)晶體形成的初期階段。文獻2“Efficient UV detect1n of protein crystals enabled by fluorescenceexcitat1n at wavelengths longer than 300nm,2010,Acta CrystallographicaSect1n F,66(4),478-484^ Dierks等發(fā)現(xiàn)紫外熒光法可用于檢測聚乙二醇和鹽溶液中是否有蛋白質(zhì)晶體出現(xiàn)，該方法還可用于區(qū)分蛋白質(zhì)晶體和鹽晶。然而，二次諧波技術(shù)只能用于探測低對稱性或大尺寸的晶體;紫外熒光法中熒光的強度依賴于芳香殘基或高分子內(nèi)二硫鍵的數(shù)目。原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)可實現(xiàn)在微納尺度的成像、控制和分子間相互作用力的測量，缺點在于不能實時監(jiān)控，且操作繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于觀察微小晶體從溶液中析出的方法，通過把結(jié)晶溶液直接放置于光學(xué)系統(tǒng)，通過觀察光強值的變化，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)結(jié)晶過程的實時觀察。本發(fā)明方便靈活，一旦有晶核形成，測量值會立刻發(fā)生變化，從而確定晶核開始形成的時間，進而通過控制結(jié)晶的時間，得到微納尺度的蛋白質(zhì)晶體。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0006]第一步，把蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴加到石英結(jié)晶池中，密封石英結(jié)晶池；
[0007]第二步，將石英結(jié)晶池放在兩個線偏振片之間，激光依次穿過第一線偏振片、石英結(jié)晶池和第二線偏振片，調(diào)節(jié)兩個線偏振片，直至光強測試儀測得的光強度為O?0.02mV;
[0008]第三步，觀測光強測試儀測得的光強度，當光強度>0.02mV，判定有晶體出現(xiàn)。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:可以實時觀測結(jié)晶溶液中是否有微小晶體的形成，為制備微納尺度的晶體提供指導(dǎo)。本發(fā)明具有操作簡單、實時觀察、高效等特點，可以應(yīng)用于所有進行微小晶體研究的實驗室。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實施例。
[0011]本發(fā)明主要是基于激光光路通過結(jié)晶純?nèi)芤汉蟛粫l(fā)生變化，通過有晶體的溶液后，由于晶體的各向異性，激光會發(fā)生折射和反射，即光路會發(fā)生變化，進而用于檢測溶液中是否有晶體出現(xiàn)。實驗中，激光光源、第一個線偏振片、結(jié)晶池、第二個線偏振片、光強測試儀依次固定在防震光學(xué)平臺，高度保持一致，光學(xué)元件之間的距離盡量小。
[0012]本發(fā)明主要包括以下步驟:
[0013]第一步:滴加結(jié)晶溶液:把蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴加到結(jié)晶池中，密封；
[0014]第二步:調(diào)節(jié)兩個偏振片相互消光:打開激光光源，調(diào)節(jié)兩個線偏振片完全消光，直至光強測試儀上光強度到O?0.02mV;
[0015]第三步:觀察是否有晶體出現(xiàn):在有晶體析出前，激光依次穿過線偏振片-石英池-結(jié)晶溶液-石英池-線偏振片，光強度是O?0.02mV。當有晶體開始析出，激光穿過線偏振片-石英池-結(jié)晶溶液時，由于晶體的各向異性，光會發(fā)生折射和散射，當通過另一個線偏振片后，光強度>0.02mV。隨著結(jié)晶時間的增加，溶液內(nèi)晶體不斷增大增多，光強度值越來越大。由此來判斷是否有晶體出現(xiàn)，以及晶體大小和數(shù)目的變化趨勢。
[0016]本發(fā)明具有技術(shù)成本低，易操作，可用于觀察蛋白質(zhì)晶體的初始結(jié)晶時間和結(jié)晶過程。
[0017]本發(fā)明主要是基于當結(jié)晶溶液中有晶體出現(xiàn)時，由于晶體的折射和散射作用，激光光路會發(fā)生變化。光路的搭建包括下述步驟:首先把激光光源固定在防震光學(xué)平臺上;然后順著光源方向，固定第一個線偏振片，要求線偏振片的高度與激光方向齊平;其次，固定結(jié)晶池，要求結(jié)晶池的高度與第一個線偏振片方向齊平;接著，固定第二個線偏振片，要求第二個線偏振片的高度與結(jié)晶池方向齊平;最后，固定光強測試儀，要求激光光斑正好在測試儀屏幕的中間。為了盡可能的減少外界環(huán)境對光路產(chǎn)生干擾，各元器件盡量緊湊的排布。
[0018]觀察微納尺度蛋白質(zhì)晶體從結(jié)晶溶液中析出的方法，包括下述步驟:
[0019]第一步:滴加結(jié)晶溶液;首先，把蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴加到結(jié)晶池中，密封。實驗用的結(jié)晶池包括:不同壁厚的石英池、有機玻璃、毛細管；實驗溫度包括室溫和精確控溫(0-20°C)兩種;
[0020]第二步:調(diào)節(jié)兩個偏振片相互消光:首先，打開激光光源，其發(fā)出的激光經(jīng)過第一個偏振片變成線偏振光;然后，偏振光經(jīng)過石英結(jié)晶池到達第二個線偏振片，觀察光強度是不是O?0.02mV。如果光強度是O?0.02mV，說明兩個偏振片已完全消光；如果光強度不是O?0.02mV，調(diào)節(jié)第二個線偏振片，直至光強度為O?0.02mV;
[0021]第三步:觀察是否有晶體出現(xiàn):在有晶體析出前，激光穿過線偏振片-石英池-結(jié)晶溶液-石