一種測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法及測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種乳制品的污染物測定方法，特別涉及一種測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法及測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磺胺類藥物，如磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶等，已用作獸藥。由于科技的進(jìn)步和人民生活水平的提高，對(duì)食品中殘留的抗微生物藥物越來越重視。歐盟、美國FDA以及日本等許多國家和監(jiān)管機(jī)構(gòu)都已經(jīng)對(duì)該類抗生素在食品中的殘留限量都作了明確的規(guī)定。我國也加強(qiáng)了該類抗生素在牛奶以及其它動(dòng)物源性食品中的殘留監(jiān)控。
[0003]目前，牛奶中磺胺類藥物檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。酶聯(lián)免疫法應(yīng)用局限于原奶等白奶類樣本，不適合檢測配方調(diào)制牛奶樣本?，F(xiàn)有的牛奶中磺胺類藥物含量測定方法是GB/T 22966-2008《牛奶和奶粉中16種磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。但使用該方法處理朱古力牛奶、咖啡牛奶、花生牛奶等配方調(diào)制奶樣本時(shí)，這些顏色深、基質(zhì)復(fù)雜的樣本經(jīng)過pH=2高氯酸溶液提取后，提取液中的雜質(zhì)不能完全沉淀，致使樣本溶液難以通過HLB萃取柱，很難進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作，導(dǎo)致不能滿足此類樣本的日常檢測。此外，該方法中使用高氯酸，操作和儲(chǔ)存都具有一定危險(xiǎn)，不利于使用者的安全。
[0004]《動(dòng)物源食品磺胺類藥物殘留GPC法測定》(中國公共衛(wèi)生2009年5月第25卷第5期)公開了一種以乙酸乙酯提取肉類樣品的前處理方法和測定方法。但是此方法的檢測對(duì)象是鴨肉等，若用該方法處理牛奶樣品，會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象，實(shí)際樣品回收率低于60% ；且GPC法前處理操作步驟繁瑣，檢測耗時(shí)，不利于工廠樣品批量性檢驗(yàn)；此外，該方法有機(jī)溶劑用量很大，還使用三氟乙酸溶液作為流動(dòng)相，使用三氟乙酸作為流動(dòng)相的色譜柱，需用大量的水和有機(jī)相進(jìn)行清洗維護(hù)，不利于環(huán)境保護(hù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法，簡單快捷，而且對(duì)環(huán)境污染小。
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種配方奶中磺胺類藥物的測定方法，其操作簡單快速，且回收率和精密度較高。
[0007]本發(fā)明提供了一種測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法，包括以下步驟:稱取配方奶樣品，先按每2g配方奶樣品加入2-4mL體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸水溶液，混勻，再按每2g配方奶樣品加入10-15mL甲醇，混勻后離心；取離心后的上清液并蒸發(fā)除去甲醇，再按每2g配方奶樣品加入5-7mL體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸水溶液，得到稀釋提取液；凈化稀釋提取液，凈化的步驟為:將稀釋提取液通過已活化的固相萃取柱，再用水淋洗固相萃取柱并棄去流出液；然后用甲醇洗脫，收集即得到凈化液；以及將凈化液蒸干，再按每2g配方奶樣品加入0.5-2mL體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇水溶液，即得復(fù)溶液，將復(fù)溶液經(jīng)濾膜過濾，即得到待測液。
[0008]在本發(fā)明的測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法中，將上清液蒸發(fā)除去甲醇步驟，當(dāng)上清液的體積小于加入甲醇之前樣品溶液的體積時(shí)，即可認(rèn)為甲醇已經(jīng)通過蒸發(fā)除去。
[0009]在測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中，離心的轉(zhuǎn)速為5000r/min-8000r/min，離心時(shí)長為5-10分鐘。
[0010]在測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中，將上清液蒸發(fā)除去甲醇步驟，采用50°c水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
[0011]在測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中，固相萃取柱為HLB固相萃取柱，其活化方法為AXHLB固相萃取柱，用3-5mL甲醇過柱，再用3_5mL水過柱，得到已活化的HLB固相萃取柱；凈化的步驟為:稀釋提取液以I滴/秒的流速通過已活化的HLB交換固相萃取柱，再用3mL水淋洗固相萃取柱并棄去流出液；然后用3_5mL甲醇洗脫，收集即得到凈化液。
[0012]在測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中，固相萃取柱為C18固相萃取柱，其活化方法為:取C18固相萃取柱，用3-5mL甲醇過柱，再用3_5mL水過柱，得到已活化的C18固相萃取柱；凈化的步驟為:稀釋提取液以I滴/秒的流速通過已活化的C18交換固相萃取柱，再用3mL水淋洗固相萃取柱并棄去流出液；然后用3-5mL甲醇洗脫，收集即得到凈化液。
[0013]在測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中，凈化液蒸干的方法為，將凈化液在50°C水浴中氮?dú)獯蹈伞?br>[0014]在測定配方奶中磺胺類藥物的樣品前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中，復(fù)溶液經(jīng)0.22 μ m有機(jī)系濾膜過濾。
[0015]本發(fā)明還提供了一種配方奶中磺胺類藥物的測定方法，通過本發(fā)明的樣品前處理方法得到待測液，再以UPLC-MS (超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)法檢測。
[0016]在配方奶中磺胺類藥物的測定方法的一種示意性實(shí)施方式中，UPLC-MS的色譜參數(shù)為:色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3柱(Φ2.1X100毫米，1.8微米);柱溫:30°C ;進(jìn)樣體積:5 μ L ;流動(dòng)相:流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液；梯度洗脫:O分鐘，25%流動(dòng)相Α，其余部分為流動(dòng)相B ;0至1.0分鐘，25%至60%流動(dòng)相Α，其余部分為流動(dòng)相B，曲線6 ; 1.0至3.0分鐘，60%流動(dòng)相Α，其余部分為流動(dòng)相B，曲線6 ;3.0至5.0分鐘，25%流動(dòng)相Α，其余部分為流動(dòng)相B，曲線I ;洗脫液流速:0.3毫升/分鐘。其中曲線6和曲線I是表示液相色譜質(zhì)譜儀器流動(dòng)相比例變化的方式:曲線6指A、B兩相由一個(gè)梯度呈45°角線性變化到另一個(gè)梯度，曲線I則為由一個(gè)梯度瞬時(shí)變化到另一個(gè)梯度。
[0017]在配方奶中磺胺類藥物的測定方法的一種示意性實(shí)施方式中，UPLC-MS的質(zhì)譜條件為:液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件為:離子化模式:電噴霧正離子模式；質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓:3.00千伏；離子源溫度:120°C ;去溶劑氣溫度:380°C ;去溶劑氣:氮?dú)?；流?650升/小時(shí)；碰撞氣:高純Ar ;流量:20升/小時(shí)。
[0018]在配方奶中磺胺類藥物的測定方法的一種示意性實(shí)施方式中，本發(fā)明的樣品前處理方法得到待測液，以HPLC法檢測，使用紫外檢測器或熒光檢測器。
[0019]牛奶若采用《動(dòng)物源食品磺胺類藥物殘留GPC法測定》(中國公共衛(wèi)生，2009)的方法，即使用乙酸乙酯提取時(shí)，比較容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，從而影響樣品的提取效率。尤其是磺胺嘧啶，其回收率達(dá)不到60%，不能滿足分析工作的要求；若采用本發(fā)明的測定方法，磺胺嘧啶的平均回收率可提高至70%-110%，能夠滿足GB/T 27404-2008附錄F.1中關(guān)于回收率的相關(guān)規(guī)定(60%-120%)。
[0020]不僅如此，根據(jù)《動(dòng)物源食品磺胺類藥物殘留GPC法測定》(中國公共衛(wèi)生，2009)中介紹的方法，其溶劑配制約30分鐘，稱樣約10分鐘，加入乙酸乙酯勻漿5分鐘，超聲提取10分鐘(提取2次)，離心5分鐘，旋轉(zhuǎn)濃縮約10分鐘(濃縮2次)，凝膠滲透色譜柱的制備約30分鐘，凝膠滲透色譜柱洗脫凈化40分鐘，上機(jī)檢測時(shí)間約24分鐘。該方法共9個(gè)步驟，其中，前處理最少需要2小時(shí)45分鐘，上機(jī)檢測約24分鐘，共耗時(shí)189分鐘。本發(fā)明的方法，若由相同技能程度的人員進(jìn)行操作:溶液配制約30分鐘，稱樣約10分鐘，加入乙酸漩渦提取I分鐘，加入甲醇漩渦提取I分鐘，離心5分鐘，取上清液濃縮10分鐘，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化約30分鐘，洗脫固相萃取柱并氮?dú)獯蹈杉s20分鐘，最后溶解樣品上機(jī)檢測5分鐘。本發(fā)明的測定方法共9個(gè)步驟，其中，樣品前處理時(shí)間約I小時(shí)49分鐘，上機(jī)檢測時(shí)間5分鐘，共124分鐘。與上述現(xiàn)有技術(shù)方法相比較，本發(fā)明可節(jié)約34%的時(shí)間，大大提高了工作效率。
【具體實(shí)施方式】
[0021]為了對(duì)發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。雖然本發(fā)明實(shí)施例只使用了磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶三種藥物，但也適用于其他磺胺藥物。
[0022]實(shí)施例1:前處理方法。
[0023]稱取2g配方奶(分別為朱古力牛奶、咖啡牛奶和花生牛奶)樣品，先加入2mL體積分?jǐn)?shù)為1%乙酸水溶液，混勻；再加入1mL甲醇，混勻后離心(離心的轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心時(shí)間5min);將上清液50°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，再加入5mL 1%乙酸水溶液，即得到稀釋提取液；將稀釋提