一種口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法。屬于動物用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫在許多發(fā)展中國家仍然肆虐，引起豬牛羊等主要家畜發(fā)病，造成巨大的經(jīng) 濟損失。發(fā)達國家通過撲殺為主的防控措施有效控制了 口蹄疫，對于流行地區(qū)和國家主要 采取免疫結(jié)合撲殺的綜合防控措施，其中疫苗免疫是關(guān)鍵一環(huán)，疫苗質(zhì)量是重中之重。檢驗 口蹄疫滅活疫苗質(zhì)量控制的主要指標(biāo)有內(nèi)毒素含量，總蛋白含量，有效抗原含量（146S含 量），在我國已有內(nèi)毒素含量及總蛋白含量的檢測標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 有效抗原含量(146S)被認為是一個比較能夠客觀反映疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)，當(dāng)前 146S含量檢測可通過蔗糖密度梯度離心法及高效液相色譜法測定，但無法區(qū)分多價疫苗 (不同血清型口蹄疫毒株），因此需研究能反映不同血清型146S含量的檢測方法，可通過建 立抗原ELISA或使用標(biāo)準(zhǔn)動物免疫檢測146S含量。
[0004] 效力檢驗的目的是檢測疫苗的免疫效果，其實質(zhì)主要反映的是146S含量的高低。 效力檢驗需要使用本動物豬或牛，我國有6家口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)企業(yè)，每家企業(yè)每年生產(chǎn) 幾十批至百余批疫苗，每批疫苗效力檢驗使用動物數(shù)18~50頭不等，每年總共使用豬和牛 數(shù)以萬計。由于在我國口蹄疫是強制免疫動物疫病，口蹄疫陰性動物極少，造成效力檢驗動 物極度缺乏；同時口蹄疫免疫攻毒還存在生物安全風(fēng)險，可能造成散毒引起疫病暴發(fā);動物 之間個體差異大，對結(jié)果影響明顯，不能客觀的反應(yīng)疫苗中有效抗原含量;此外要處理大量 的動物尸體會造成環(huán)境污染;動物實驗引發(fā)動物福利問題，總之，使用本動物免疫攻毒效力 檢驗方法存在諸多缺點，耗費大量人力財力。因此，口蹄疫滅活疫苗效力替代方法的研究迫 在眉睫，國際上阿根廷建立了牛免疫血清抗體水平與免疫攻毒保護之間的相互關(guān)系，替代 了本動物攻毒檢驗，并獲得了0ΙΕ的認可。
[0005] 綜合目前口蹄疫滅活疫苗146S含量檢測及效力檢驗存在的問題，進行了相應(yīng)的研 究，并發(fā)明了一種替代本動物免疫攻毒的效力檢驗方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對口蹄疫滅活疫苗效力檢驗存在的缺點，本發(fā)明提供了一種口 蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法，使用該方法可對口蹄疫滅活疫苗進行效力檢驗，反映口蹄疫 滅活疫苗的免疫效果，本法用于替代口蹄疫滅活疫苗傳統(tǒng)效力檢驗方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0008] 1. -種口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法，其特征在于本發(fā)明所述的方法是通過口蹄 疫阻斷ELISA方法檢測血清特異性抗體替代本動物免疫攻毒進行口蹄疫滅活疫苗效力檢 驗。
[0009] 2.如權(quán)利要求1所述口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法，其特征在于該方法包括：（1) 每批疫苗每個劑量免疫4~8只Balb/c系小鼠，疫苗免疫劑量可分為1頭份，1/2頭份，1/4頭 份三個劑量組，第28天采血，分離血清；（2)通過口蹄疫阻斷ELISA方法檢測血清特異性抗 體，抗體阻斷ELISA效價-l〇g1QX高于2.0以上，變異系數(shù)低于12%，即判為合格。
[0010] 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法，步驟(1)中Balb/c系 小鼠為8_9周齡。
[0011] 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法，步驟（1)中疫苗可為0型、 亞洲I型、A型單價疫苗或二價疫苗或三價疫苗。
[0012] 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種一種口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法，步驟(2)中血清 特異性抗體分為〇型，Asia 1型，A型。
【具體實施方式】
[0013] 1.不同146S含量口蹄疫0型滅活抗原與小鼠免疫血清抗體關(guān)系
[0014] 將已知146S含量(64μg/ml)的0型口蹄疫滅活抗原(金宇保靈生物藥品有限公司提 供)作2倍系列稀釋至0.25μg/ml，加入等體積206佐劑（中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥 廠提供)配制疫苗(疫苗抗原含量一32μg/ml)，每只Balb/c皮下注射免疫0.5ml，每個抗原含 量疫苗注射5只小鼠，28天采血分離血清，用液相ELISA試劑盒測定血清效價。血清效價用-loglOX表示，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果如圖1所示。
[0015] 每毫升疫苗中抗原含量和抗體產(chǎn)生有相關(guān)性，隨著抗原含量降低，抗體水平也降 低。每毫升疫苗抗原含量大于lyg時，不同免疫小鼠抗體差異小，標(biāo)準(zhǔn)差小于統(tǒng)計學(xué)可以接 受的12%，但當(dāng)每毫升疫苗中抗原含量小于0.5yg時，標(biāo)準(zhǔn)差大于12%，不同動物之間離散 度加大，測定準(zhǔn)確性降低。該方法不僅可以評價抗原，也可以評價佐劑，綜合反應(yīng)疫苗的免 疫應(yīng)答效果。也可以解決不同血清型的問題。
[0016] 2.不同146S含量口蹄疫二價滅活抗原(0型+亞洲I型）與小鼠免疫血清抗體關(guān)系 [00 17]疫苗配制：將〇型和亞洲I型抗原（均由金宇保靈生物藥品有限公司提供）等量混 合，分別配制成總抗原含量分別為32以8/1111、16以8/1111、8以8/1111、4以8/1111和2以8/1111的疫苗。每個 含量的疫苗免疫5只小鼠，每只0.5ml，免疫后28天采血分離血清，采用液相阻斷ELISA測定 血清抗體效價。
[0018]不同抗原濃度的二價疫苗免疫小鼠，分別測定亞洲I型抗體和0型抗體，亞洲I型隨 著抗原濃度降低，抗體效價逐漸下降，小鼠間變異系數(shù)增加。但總抗原含量為4yg或亞洲I型 抗原達到2yg，抗體效價位于2.0上下(結(jié)果見圖2)。
[0019] 3.不同146S含量口蹄疫三價滅活抗原(0型+亞洲I型+A型）與小鼠免疫血清抗體關(guān) 系
[0020] 口蹄疫三價滅活抗原（0型、亞洲I型和A型）均為金宇保靈生物藥品有限公司提 供）。按照〇型抗原40%，A型抗原30%，Asial型抗原30%的比例，配制總抗原含量分別為32μ g/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml和2μg/ml的疫苗。例如疫苗中總抗原含量為32μg/ml的疫苗， 其0型抗原12.8μg/ml疫苗，A型抗原9.6μg/ml疫苗，Asial抗原9.6μg/ml疫苗。分別免疫5只 小鼠，每只0.5ml，免疫后28天采血分離血清，采用液相阻斷ELISA測定血清抗體效價。
[0021] 總抗原含量大于4μg/ml疫苗時，抗體可以達到約2.0以上，不同小鼠之間變異系數(shù) 小于12%，總抗原含量小時，不同小鼠之間抗體變異加大，沒有規(guī)律性，變異系數(shù)超過12% (結(jié)果見圖3)。
[0022] 本發(fā)明為口蹄疫滅活疫苗效力檢驗提供了一種新的方法，通過上述方法免疫 Balb/c系小鼠，檢測血清可較好的反映疫苗中有效抗原含量，可替代本動物免疫攻毒試驗。
[0023] 本發(fā)明提供了一種口蹄疫滅活疫苗效力檢驗的替代方法，其方法包括如下：
[0024] 1)每批疫苗每個劑量免疫4~8只Balb/c系小鼠，疫苗免疫劑量可分為1頭份，1/2 頭份，1 /4頭份三個劑量組，第28天采血，分離血清；
[0025] 2)通過口蹄疫阻斷ELISA方法檢測血清特異性抗體，抗體阻斷ELISA效價-l〇g 1QX高 于2.0以上，變異系數(shù)低于12%，即判為合格。
[0026] 本發(fā)明的積極意義
[0027] 本發(fā)明涉及一種口蹄疫滅活疫苗效力檢驗方法。本發(fā)明所述的方法包括：（1)每批 疫苗每個劑量免疫4~8只Balb/c系小鼠，疫苗免疫劑量可分為1頭份，1/2頭份，1/4頭份三 個劑量組，第28天采血，分離血清；（2)通過口蹄疫阻斷ELISA方法檢測血清特異性抗體，抗 體阻斷ELISA效價-l 〇g1QX高于2.0以上，變異系數(shù)低于12%，即判為合格。本發(fā)明為口蹄疫滅 活疫苗效力檢驗提供了一種新的方法，通過上述方法免疫Balb/c系小鼠，檢測血清可較好 的反映疫苗中有效抗原含量，替代本動物免疫攻毒試驗。
【附圖說明】
[0028]圖1不同146S含量口蹄疫0型滅活抗原與免疫血清抗體的關(guān)系
[0029]圖2不同146S含量口蹄疫二價滅活抗原(0型+亞洲I型）與免疫血清抗體的關(guān)系
[0030]圖3不同146S含量口蹄疫三價滅活抗原（0型+亞洲I型+A型）與免疫血清抗體的關(guān) 系
[0031] 實施例
[0032] 下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步說明：
[0033] 實施例一0型口蹄疫滅活疫苗的小鼠免疫血清學(xué)檢測
[0034] 1.實驗動物:選取8~10周齡SPF級Balb/c系小鼠，分為4組，其中3個實驗組，1組對 照組，每組5只小鼠。
[0035] 2.疫苗及疫苗免疫:0型口蹄疫滅活疫苗;選取3組動物為實驗組，分別免疫1頭份 劑量，1/2頭份劑量，