確定或預(yù)測細胞特征的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及確定或預(yù)測細胞特征的方法。特別是，本發(fā)明涉及一種確定細胞身份 或預(yù)測細胞分批補料性能的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 許多生物藥劑采用轉(zhuǎn)基因的單細胞生物(稱為生產(chǎn)者細胞)制備。人們已經(jīng)建立了 采用哺乳動物生產(chǎn)者細胞制備生物藥劑的完善體系。第一步包括獲得適合大規(guī)模生產(chǎn)的高 產(chǎn)細胞系，這是一個首先進行轉(zhuǎn)染、克隆，然后對大量細胞系進行表征的過程。該過程成本 高，勞動強度大，耗時長，持續(xù)時間高達12個月。一旦轉(zhuǎn)染感興趣的基因，并采用選擇性表達 系統(tǒng)施加選擇壓力，接下來的步驟涉及以可以接受的生長和重組蛋白生產(chǎn)率開展細胞的選 擇和分離。對細胞進行培養(yǎng)和擴增，得到克隆細胞群，一般說來，一旦得到數(shù)百個克隆細胞 群，即需要開始對細胞系進行表征。使用這么多的克隆細胞，要求必須對每個克隆細胞都單 獨儲存和記錄，以便將來使用之前容易識別。目前，需要對克隆細胞的儲存容器進行標記， 確?？寺〖毎徽_識別。但是，如果登記克隆細胞時出現(xiàn)問題，一個或多個克隆容器標記 不正確，則無法確定那些克隆細胞的身份。除進行測序(該方法成本高、耗時長)或者相信文 字/標簽之外，無法采用別的方法確定冷凍小瓶的身份。
[0003] 細胞系表征過程的一個步驟是確定每個克隆的分批補料性能，涉及在通常10天以 上的一段時間內(nèi)對培養(yǎng)中的每個克隆進行監(jiān)測，測定一些分批補料性能指標，如試驗平板 中每個克隆的產(chǎn)品收率和IVCD50%，后者定義為平均細胞存活率下降到50%以下時培養(yǎng)點 活細胞密度的積分。這是一個費時費力的過程。
[0004] 本發(fā)明的一個目的是克服上面提到的至少一個問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn):細胞對多種單一細胞應(yīng)激原分子的生長響應(yīng)可以作為指紋 或簽名，即應(yīng)激反應(yīng)指紋，這些指紋是細胞獨一無二的，可作為確定或預(yù)測細胞特征的手 段，例如，細胞的身份、克隆細胞的遺傳或功能穩(wěn)定性、分批補料培養(yǎng)中細胞的預(yù)測生長性 能(預(yù)測分批補料性能)或其它特征。細胞可以是任何類型的細胞，例如，克隆細胞或非克隆 細胞。在本發(fā)明的一個應(yīng)用中，可以這樣處理一組細胞(克隆或非克隆細胞）：用多種細胞應(yīng) 激原分子培養(yǎng)每個細胞，測量每個細胞對每種細胞應(yīng)激原的生長響應(yīng)，得到每個細胞包含 多種生長響應(yīng)的獨特簽名或指紋。這些簽名或指紋(下文稱為"參考細胞特異性生長響應(yīng)指 紋"）可以儲存，然后作為識別組內(nèi)未識別細胞的手段，或作為質(zhì)量控制中的補充檢查點，用 于確認以前識別細胞的身份。為了識別或確認細胞的身份，采用多種相同的細胞應(yīng)激原分 子培養(yǎng)細胞，得到該細胞的查詢細胞特異性生長響應(yīng)指紋。然后，將查詢指紋與參考細胞特 異性生長響應(yīng)指紋進行比較，識別或確認該細胞的身份。在另一個應(yīng)用中，其中參考細胞特 異性生長響應(yīng)指紋是從特征已知的細胞(例如，已知在分批補料培養(yǎng)中表現(xiàn)良好或很差的 細胞)獲得的，將查詢細胞的生長響應(yīng)指紋與參考生長響應(yīng)指紋進行比較，可以預(yù)測查詢細 胞在生長和生產(chǎn)率方面的分批補料性能。
[0006] -方面，本發(fā)明提供一種確定或預(yù)測細胞特征的方法，包括以下步驟：
[0007] -采用多種單一化學(xué)細胞應(yīng)激原培養(yǎng)細胞；
[0008] -確定細胞在每種化學(xué)細胞應(yīng)激原存在下的生長響應(yīng)，得到查詢細胞-特異性生長 響應(yīng)指紋；
[0009] -將查詢細胞-特異性生長響應(yīng)指紋與一種或多種參考細胞特異性生長響應(yīng)指紋 進行比較，其中一種或多種參考細胞特異性生長響應(yīng)指紋與特征已知的一個或多個細胞對 應(yīng);及
[0010] -根據(jù)查詢細胞-特異性生長響應(yīng)指紋與一種或多種參考細胞-特異性生長響應(yīng)指 紋之間的相關(guān)性水平，確定或預(yù)測細胞的特點。
[0011] 細胞的特點適當(dāng)?shù)剡x自細胞身份、分批補料性能或遺傳或功能穩(wěn)定性。因此，本發(fā) 明的方法適當(dāng)?shù)厣婕按_定細胞的身份，預(yù)測細胞的分批補料性能，預(yù)測一組克隆細胞(最好 是源自單一親代宿主細胞群的一組克隆細胞）的相對分批補料性能，預(yù)測或確定細胞的遺 傳或功能穩(wěn)定性。
[0012] 在更具體的方面，本發(fā)明提供一種識別細胞的方法，包括：
[0013] -采用多種化學(xué)細胞應(yīng)激原培養(yǎng)細胞；
[0014] _確定細胞在每種化學(xué)細胞應(yīng)激原存在下的生長響應(yīng)，得到查詢細胞-特異性生長 響應(yīng)指紋；
[0015] -將查詢細胞-特異性生長響應(yīng)指紋與一種或多種參考細胞特異性生長響應(yīng)指紋 進行比較，從而識別細胞，其中一種或多種參考細胞特異性生長響應(yīng)指紋與一個或多個已 知細胞對應(yīng);及
[0016] -當(dāng)查詢細胞-特異性生長響應(yīng)指紋與參考細胞-特異性生長響應(yīng)指紋相匹配或相 關(guān)時，識別查詢細胞。
[0017] 在優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及一種識別查詢克隆細胞的方法，包括以下步驟：
[0018] -采用多種化學(xué)細胞應(yīng)激原培養(yǎng)查詢克隆細胞；
[0019] -確定查詢克隆細胞在每種化學(xué)細胞應(yīng)激原存在下的生長響應(yīng)，得到查詢克隆細 胞-特異性生長響應(yīng)指紋；
[0020] -將查詢克隆細胞-特異性生長響應(yīng)指紋與多種參考細胞特異性生長響應(yīng)指紋進 行比較，其中多種參考細胞特異性生長響應(yīng)指紋與一組克隆細胞對應(yīng)。
[0021 ]第二方面，本發(fā)明涉及一種得到與特定細胞對應(yīng)的參考生長響應(yīng)指紋的方法，包 括以下步驟：
[0022] -采用多種單一化學(xué)細胞應(yīng)激原培養(yǎng)細胞;及
[0023] -確定細胞在每種化學(xué)細胞應(yīng)激原存在下的生長響應(yīng)，得到參考生長響應(yīng)指紋。
[0024] 第三方面，本發(fā)明涉及一種得到與一組不同細胞對應(yīng)的一組參考生長響應(yīng)指紋的 方法，包括以下步驟：
[0025] -得到該組細胞內(nèi)每個細胞的參考生長響應(yīng)指紋;及
[0026] -儲存該組參考生長響應(yīng)指紋，
[0027] 其中每種參考生長響應(yīng)指紋是通過以下步驟得到的：
[0028] -采用多種化學(xué)細胞應(yīng)激原培養(yǎng)細胞;及
[0029] -確定細胞在每種化學(xué)細胞應(yīng)激原存在下的生長響應(yīng)，得到參考生長響應(yīng)指紋。
[0030] 第四方面，本發(fā)明提供一種識別細胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：
[0031 ]-一種包括多個反應(yīng)室的裝置；
[0032] -任選多種化學(xué)細胞應(yīng)激原優(yōu)選單獨置于反應(yīng)室內(nèi)；
[0033] --種檢測系統(tǒng)，用于測定細胞在每種化學(xué)細胞應(yīng)激原存在時的生長響應(yīng)；
[0034] -任選一種儲存系統(tǒng)，用于儲存與細胞的多個生長響應(yīng)對應(yīng)的細胞特異性生長響 應(yīng)指紋；
[0035] --種比較系統(tǒng)，經(jīng)配置用于將細胞特異性的生長響應(yīng)指紋與一種或多種參考細 胞特異性生長響應(yīng)指紋進行比較;及
[0036] -任選一種輸出系統(tǒng)，用于顯示比較步驟的輸出。
[0037] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種預(yù)測源自單一親代宿主細胞群的一組克隆細 胞相對分批補料性能的計算機實施方法，該方法包括以下步驟：
[0038] -檢測每個克隆在存在和不存在多種化學(xué)細胞應(yīng)激原條件下的生長水平；
[0039] -比較每個克隆在存在和不存在每種化學(xué)細胞應(yīng)激原條件下的生長水平，提供每 個克隆在每種應(yīng)激微環(huán)境中的標準化生長響應(yīng)值；
[0040] -在計算模型中輸入克隆的特異性生長響應(yīng)指紋，包括每個克隆在每種應(yīng)激微環(huán) 境中的標準化生長響應(yīng)值，其中計算模型是根據(jù)分批補料性能已知的一組校正克隆的生長 響應(yīng)指紋建立的，其中計算模型經(jīng)配置，用于輸出每個克隆的預(yù)測分批補料性能，預(yù)測該組 克隆細胞的相對分批補料性能。
[0041] 當(dāng)一批新克隆是從親代細胞系產(chǎn)生時，采用本發(fā)明的方法可以快速對大量克隆進 行檢測，根據(jù)預(yù)測的分批補料性能，快速高效地進行排序，而不需要對所有克隆或選擇其中 很少的克隆在生物反應(yīng)器內(nèi)進行昂貴、耗時長的生長研究。這樣就可以確定將哪些克隆提 交進行放大/微-生物反應(yīng)器研究，例如，僅下文圖3所示的優(yōu)良克隆進行放大/微-生物反應(yīng) 器研究。
[0042]本發(fā)明這方面的方法采用來自一組預(yù)-驗證克隆(分批補料性能已知的克?。┑臄?shù) 據(jù)(細胞特異性生長響應(yīng)指紋)和基于這些數(shù)據(jù)的計算模型，理想的情況是多元線性計算模 型，根據(jù)迅速得到的新克隆組的化學(xué)指紋，對新克隆組的相對分批補料性能進行預(yù)測。
[0043] 優(yōu)選該方法包括根據(jù)預(yù)測的分批補料性能值對克隆進行排序的步驟。
[0044] 本發(fā)明的方法通常采用微量滴定板(多孔板)開展，其中每個檢測均在微量滴定板 的一個孔內(nèi)執(zhí)行。適合的情況是，每個孔的生長均在多孔板的孔內(nèi)進行檢測。
[0045] -般說來，檢測涉及將克隆樣本與化學(xué)細胞應(yīng)激原混合，培養(yǎng)該混合物1至4天，檢 測細胞的生長水平。適合的情況是，克隆樣本的濃度是0.1-1.〇x 1〇6個細胞/ml混合物。一 般說來，生物反應(yīng)器-相關(guān)化學(xué)細胞應(yīng)激原的濃度是〇.5-2x IC50,理想的情況是大約lx IC50。
[0046] 適合的情況是，在培養(yǎng)時間小于5天后，檢測每個克隆的生長情況。理想的情況是， 在培養(yǎng)1-4天后，尤其是2天和3天后檢測每個克隆的生長情況。
[0047] 優(yōu)選同時檢測每個克隆的生長情況。
[0048] 化學(xué)細胞應(yīng)激原是通過一種或多種細胞途徑減少細胞生長的化學(xué)物質(zhì)。適合的情 況是，多種化學(xué)細胞應(yīng)激原包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24或 25種應(yīng)激原。一般說來，多種化學(xué)細胞應(yīng)激原選自氨基酸轉(zhuǎn)運抑制劑、細胞周期抑制劑、碳 源、滲透應(yīng)激原、氧化應(yīng)激原、凋亡誘導(dǎo)劑、代謝效應(yīng)子、pH調(diào)節(jié)劑、糖酵解抑制劑和毒素。一 般說來，多種化學(xué)細胞應(yīng)激原包括選自氨基酸轉(zhuǎn)運抑制劑、細胞周期抑制劑、碳源、滲透應(yīng) 激原、氧化應(yīng)激原、凋亡誘導(dǎo)劑、代謝效應(yīng)子、pH調(diào)節(jié)劑、糖酵解抑制劑和毒素中的至少4、5、 6或7種。
[0049] 另一方面，本發(fā)明提供適合生成細胞生長響應(yīng)指紋的微量滴定板，微量滴定板具 有至少24、48或96個孔，至少其中一些孔內(nèi)分別放置多種化學(xué)細胞應(yīng)激原。一般說來，微量 滴定板包括至少6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24或25種化學(xué)細胞應(yīng)激原。適合 的情況是，每種化學(xué)細胞應(yīng)激原放置在微量滴定板的至少兩個或三個孔內(nèi)（即二次或三次 重復(fù)實驗）。
[0050] 多種化學(xué)細胞應(yīng)激原優(yōu)選選自2-雙環(huán)氨基_(2,2，1)_庚烷-羧酸(BCH)、D_苯丙氨 酸、α_(甲基氨基)異丁酸(MeAIB)、丁酸鈉 (NaBu)、環(huán)己酰亞胺、氯化銨、二水乙酸鎘、氯化鈷 (CoCl2)、氯化鈉 (