改進(jìn)抗體穩(wěn)定性的方法
【專利說明】改進(jìn)抗體穩(wěn)定性的方法
[0001]本文報(bào)道了改進(jìn)抗體穩(wěn)定性的方法，其中根據(jù)基于結(jié)構(gòu)的方法，識(shí)別和去除抗體 氨基酸序列中的天冬酰胺和天冬氨酸降解位點(diǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 單克隆抗體和基于抗體結(jié)構(gòu)域的分子組成臨床研究中的主要蛋白質(zhì)治療劑（1， 2)。單克隆抗體在多種范圍的治療適應(yīng)癥中是有效的，并且容易生產(chǎn)?？贵w特異性主要由位 于可變結(jié)構(gòu)域中的CDR的序列決定。選擇臨床候選物的方法開始于篩選大量單克隆抗體的 功能性質(zhì)。篩選后，對高達(dá)數(shù)百個(gè)分子進(jìn)行詳細(xì)的體外性質(zhì)分析，以識(shí)別滿足所有所需功能 標(biāo)準(zhǔn)且還顯示化學(xué)和生物物理穩(wěn)定性的單克隆抗體。因此，必須識(shí)別和剔除具有可能影響 單克隆抗體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的不穩(wěn)定性問題的單克隆抗體，以避免制造和貯存過程中 以及應(yīng)用后在體內(nèi)的不想要的降解。
[0003] 在蛋白質(zhì)中發(fā)生的一種降解反應(yīng)是天冬酰胺(Asn) (3)和天冬氨酸(Asp)殘基(4， 5)的化學(xué)降解。這些反應(yīng)可通過適當(dāng)?shù)闹苿l件控制(6-9)。如果Asn和Asp殘基參與抗原識(shí) 另IJ，它們的化學(xué)改變可導(dǎo)致抗體效力的降低（10-14)。
[0004] 已經(jīng)提出了，主要是在肽中（52,53,57-59)，但也有在蛋白質(zhì)環(huán)境中（7,10,35， 60 )，可能影響Asn和Asp殘基降解傾向的多個(gè)參數(shù)，例如一級序列（3，5，16，33，40，51-56)、 溶劑的介電常數(shù)、溫度和pH。早在上世紀(jì)80年代，一些結(jié)構(gòu)上的要求被提議是蛋白質(zhì)脫酰胺 的主要決定因素(5,61)，后來其被證實(shí)和擴(kuò)展(34,37,38,40,46,51，62-64)。
[0005] 盡管積累了關(guān)于單克隆抗體降解機(jī)理及其對環(huán)境要求的知識(shí)，但單克隆抗體中的 自發(fā)脫酰胺和異構(gòu)化仍然是一個(gè)懸而未決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文報(bào)道了在多肽的Asp和Asn殘基降解和一組結(jié)構(gòu)參數(shù)之間的相關(guān)性。已發(fā)現(xiàn)， 降解熱點(diǎn)可以通過（i)其構(gòu)象柔性，（ii)C-端側(cè)翼氨基酸殘基的大小，和（iii)二級結(jié)構(gòu)參 數(shù)來表征。使用這些參數(shù)，已經(jīng)建立了預(yù)測Asn和Asp殘基降解傾向的方法。
[0007] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是，選擇具有降解（=修飾)穩(wěn)定性的抗體的方法，其包 括步驟：
[0008] a)使用同源物模型集合(homology model ensemble)/在同源物模型集合中/應(yīng)用 同源物模型集合，針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定Ca原子的構(gòu)象柔性，
[0009] b)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定直接位于Asp或Asn殘基C-端的氨基酸 殘基的大小，
[0010] C)選擇其中Ca原子是非構(gòu)象柔性的和/或Asp或Asn殘基具有大的C-端氨基酸殘基 的抗體。
[0011] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是選擇一種或多種具有降解（=修飾)穩(wěn)定性的抗體的 方法，其包括以下步驟：
[0012] a)提供兩種或更多種抗體，
[0013] b)使用同源物模型集合/在同源物模型集合中/應(yīng)用同源物模型集合，針對抗體Fv 區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定Ca原子的構(gòu)象柔性，
[0014] c)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定直接位于Asp或Asn殘基C-端的氨基酸 殘基的大小，
[0015] d)選擇一種或多種其中Ca原子是非構(gòu)象柔性的和/或Asp或Asn殘基具有大的C-端 氨基酸殘基的抗體，
[0016] 由此選擇一種或多種具有降解（=修飾)穩(wěn)定性的抗體。
[0017] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是剔除（=從大量抗體中選擇除去)抗體的方法，其包括 以下步驟：
[0018] a)針對(大量抗體Fv區(qū)的）抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，使用同源物模型集合/ 在同源物模型集合中/應(yīng)用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0019] b)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定直接位于Asp或Asn殘基C-端的氨基酸 殘基的大小，
[0020] c)(從大量抗體Fv區(qū)中）剔除/去除其中C。原子具有中度至高度構(gòu)象柔性和/或Asp 或Asn殘基具有小的C-端氨基酸殘基的抗體。
[0021] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是剔除（=從大量抗體中選擇除去）一種或多種抗體的 方法，其包括以下步驟：
[0022] a)提供兩種或更多種抗體，
[0023] b)針對(大量抗體Fv區(qū)的）抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，使用同源物模型集合/ 在同源物模型集合中/應(yīng)用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0024] c)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定直接位于Asp或Asn殘基C-端的氨基酸 殘基的大小，
[0025] d)(從大量抗體Fv區(qū)中）剔除/去除其中C。原子具有中度至高度構(gòu)象柔性和/或Asp 或Asn殘基具有小的C-端氨基酸殘基的一種或多種抗體。
[0026] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是識(shí)別或剔除易于發(fā)生天冬酰胺(Asn)降解(脫酰胺和/ 或琥珀酰亞胺形成)的抗體的方法，其包括以下步驟：
[0027] a)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asn殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合中/應(yīng) 用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0028] b)針對抗體Fv區(qū)中具有小的C-端氨基酸殘基的每個(gè)Asn殘基，確定主鏈二面角 phi，
[0029] c)針對抗體Fv區(qū)中具有小的C-端氨基酸殘基且主鏈二面角phi大于-75.2度的每 個(gè)Asn殘基，確定溶劑暴露和該Asn殘基N-端二級結(jié)構(gòu)改變的發(fā)生/存在、以及相對于該Asn 殘基而言發(fā)生該改變的氨基酸殘基距離，和
[0030] d)識(shí)別或剔除易于發(fā)生天冬酰胺(Asn)降解(脫酰胺和/或琥珀酰亞胺形成）的抗 體，條件是：
[0031 ] i)Asn殘基在⑶R環(huán)1中，其Ca原子是構(gòu)象柔性的且C-端氨基酸殘基是Asp，Pro，Thr 或 Asn，
[0032] ii)Asn的Ca原子是構(gòu)象柔性的，具有小于-75.2度的主鏈二面角phi，且該Asn殘基 的C-端氨基酸殘基是小的，或
[0033] iii)Asn殘基的Ca原子是構(gòu)象柔性的，具有大于-75.2度的主鏈二面角phi，具有高 度溶劑暴露，且氨基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于Asn殘基超過3個(gè)氨基酸殘基的延伸 (stretch)中。
[0034] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是識(shí)別或剔除易于發(fā)生天冬酰胺(Asn)降解(脫酰胺和/ 或琥珀酰亞胺形成)的一種或多種抗體的方法，其包括以下步驟：
[0035] a)提供兩種或更多種抗體，
[0036] b)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asn殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合中/應(yīng) 用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0037] c)針對抗體Fv區(qū)中具有小的C-端氨基酸殘基的每個(gè)Asn殘基，確定主鏈二面角 phi，
[0038] d)針對抗體Fv區(qū)中具有小的C-端氨基酸殘基且主鏈二面角phi大于-75.2度的每 個(gè)Asn殘基，確定溶劑暴露和該Asn殘基N-端的二級結(jié)構(gòu)改變的發(fā)生/存在、以及相對于該 Asn殘基而言發(fā)生該改變的氨基酸殘基距離，和，
[0039] e)識(shí)別或剔除易于發(fā)生天冬酰胺(Asn)降解(脫酰胺和/或琥珀酰亞胺形成）的一 種或多種抗體，條件是：
[0040] i)Asn殘基在⑶R環(huán)1中，其ca原子是構(gòu)象柔性的且C-端氨基酸殘基是Asp，Pro，Thr 或 Asn，
[0041] ii)Asn的Ca原子是構(gòu)象柔性的，具有小于-75.2度的主鏈二面角phi，且Asn殘基的 C-端氨基酸殘基是小的，或
[0042] iii)Asn殘基的Ca原子是構(gòu)象柔性的，具有大于-75.2度的主鏈二面角phi，具有高 度溶劑暴露，且氨基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于Asn殘基超過3個(gè)氨基酸殘基的延伸中。
[0043] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是選擇一種或多種具有改進(jìn)的天冬酰胺(Asn)穩(wěn)定性 (降低的脫酰胺和/或琥珀酰亞胺形成)的抗體的方法，其包括以下步驟：
[0044] a)提供兩種或更多種抗體，
[0045] b)針對每個(gè)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asn殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合 中/應(yīng)用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0046] c)針對每個(gè)抗體Fv區(qū)中具有小的C-端氨基酸殘基的每個(gè)Asn殘基，確定主鏈二面 角 phi，
[0047] d)針對每個(gè)抗體Fv區(qū)中具有小的C-端氨基酸殘基且主鏈二面角phi大于-75.2度 的每個(gè)Asn殘基，確定溶劑暴露和該Asn殘基N-端的二級結(jié)構(gòu)改變的發(fā)生/存在、以及相對于 該Asn殘基而言發(fā)生該改變的氨基酸殘基距離，和，
[0048] e)從兩種或更多種抗體中去除/刪除/剔除至少具有以下之一的那些抗體：
[0049] i )Asn殘基，其在CDR環(huán)1中、具有構(gòu)象柔性的Ca原子且具有Asp，Pro，Thr或Asn作為 C_端氨基酸殘基，
[0050] ii)Asn殘基，其具有構(gòu)象柔性Ca原子、小于-75.2度的主鏈二面角phi且具有小的 C-端氨基酸殘基，或
[0051] iii)Asn殘基，其具有構(gòu)象柔性Ca原子、具有大于-75.2度的主鏈二面角phi，具有 高度溶劑暴露，且氨基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于Asn殘基超過3個(gè)氨基酸殘基的延伸 中，
[0052] 由此選擇一種或多種具有改進(jìn)的天冬酰胺(Asn)穩(wěn)定性的抗體。
[0053] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是獲得具有降低的天冬酰胺(Asn)降解(脫酰胺和/或琥 珀酰亞胺形成)的抗體的方法，其包括一個(gè)或多個(gè)以下步驟：
[0054] -降低Ca原子的構(gòu)象柔性，
[0055] -增加 Asn殘基C-端氨基酸殘基的大小。
[0056] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是識(shí)別或剔除易于發(fā)生天冬氨酸(Asp)降解(異構(gòu)化和/ 或琥珀酰亞胺形成)的抗體的方法，其包括以下步驟：
[0057] a)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合中/應(yīng) 用同源物模型集合，確定Ca原子的構(gòu)象柔性，
[0058] b)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，確定Asp殘基C-端氨基酸殘基的大小，
[0059] c)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，確定在該Asp殘基的C-端二級結(jié)構(gòu)改變的發(fā)生/ 存在以及相對于該Asp殘基而言發(fā)生該改變的氨基酸殘基距離，和
[0060] d)識(shí)別或剔除易于發(fā)生Asp降解(異構(gòu)化和/或琥珀酰亞胺形成）的抗體，條件是：
[0061 ] i)Asp殘基的Ca原子具有尚度構(gòu)象柔性且Asp殘基C-端氣基酸殘基是小的，或
[0062] ii )Asp殘基的Ca原子具有中度構(gòu)象柔性，該Asp殘基的C端氣基酸殘基是小的，且 羧基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于該Asp殘基少于3個(gè)氨基酸殘基的延伸中，或
[0063] iii)Asp殘基的Ca原子具有中度構(gòu)象柔性，該Asp殘基的C-端氨基酸殘基是Gly殘 基，且羧基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于該Asp殘基大于3個(gè)氨基酸殘基的距離上。
[0064]如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是識(shí)別或剔除一種或多種易于發(fā)生天冬氨酸(Asp)降解 (異構(gòu)化和/或琥珀酰亞胺形成)的抗體的方法，其包括以下步驟：
[0065] a)提供兩種或更多種抗體，
[0066] b)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合中/應(yīng) 用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0067] c)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，確定Asp殘基C-端氨基酸殘基的大小，
[0068] d)針對抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，確定Asp殘基C-端二級結(jié)構(gòu)改變的發(fā)生/存在以 及相對于Asp殘基而言發(fā)生該改變的氨基酸殘基距離，和
[0069] e)識(shí)別或剔除易于發(fā)生Asp降解(異構(gòu)化和/或琥珀酰亞胺形成）的一種或多種抗 體，條件是：
[0070] i)Asp殘基的Ca原子具有尚度構(gòu)象柔性且Asp殘基C-端氣基酸殘基是小的，或
[0071] ii)Asp殘基的Ca原子具有中度構(gòu)象柔性，Asp殘基C-端的氨基酸殘基是小的，且羧 基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于Asp殘基少于3個(gè)氨基酸殘基的延伸中，或 [0072] iii)Asp殘基的Ca原子具有中度構(gòu)象柔性，Asp殘基的C-端氨基酸殘基是Gly殘基， 且羧基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于Asp殘基超過3個(gè)氨基酸殘基的距離上。
[0073]如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是選擇一種或多種具有改進(jìn)的天冬氨酸(Asp)穩(wěn)定性 (降低的異構(gòu)化和/或琥珀酰亞胺形成)的抗體的方法，其包括以下步驟：
[0074] a)提供兩種或更多種抗體，
[0075] b)針對每個(gè)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合 中/應(yīng)用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0076] c)針對每個(gè)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，確定Asp殘基C-端氨基酸殘基的大小，
[0077] d)針對每個(gè)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp殘基，確定Asp殘基C-端二級結(jié)構(gòu)改變的發(fā)生/存 在以及相對于該Asp殘基而言發(fā)生該改變的氨基酸殘基距離，和
[0078] e)從兩種或更多種抗體中去除/刪除/剔除具有至少以下之一的那些抗體：
[0079] i) Asp殘基，其具有構(gòu)象柔性的C。原子，并具有小的C-端氨基酸殘基，
[0080] ii )Asp殘基，其具有中度構(gòu)象柔性的Ca原子，具有小的C-端氨基酸，且羧基端二級 結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于該Asp殘基少于3個(gè)氨基酸殘基的延伸中，或
[0081] i i i) Asp殘基，其具有中度構(gòu)象柔性的Ca原子，具有Gly作為C-端氨基酸殘基，且羧 基端二級結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在相對于該Asp殘基大于3個(gè)氨基酸殘基的距離上，
[0082] 由此選擇一種或多種具有改進(jìn)的天冬氨酸(Asp)穩(wěn)定性的抗體。
[0083] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是獲得具有降低的天冬氨酸(Asp)降解(異構(gòu)化和/或琥 珀酰亞胺形成)的抗體的方法，其包括以下步驟中的一個(gè)或兩個(gè)：
[0084] -降低Ca原子的