一種紅色熒光金納米團簇及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光納米材料，具體涉及一種紅色熒光金納米團簇及其制備方法，以及該納米團簇在制作熒光染料及其染色劑、制作檢測汞離子試紙以及檢測谷胱甘肽(GSH)中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，汞是一種重要的重金屬元素，它廣泛存在于自然界，如水、土壤以及食品中，汞離子即使在非常低的濃度也是一種劇毒的、并廣泛存在的污染物離子，是對人體及自然界最具威脅的重金屬元素之一，它在人體中可嚴重破壞消化、排泄、甚至是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起很多嚴重的疾病，例如顫抖、致聾、關(guān)節(jié)炎、失去肌肉協(xié)調(diào)能力、感覺失控、記憶力喪失以及運動障礙等。因此找到一種快速準確的檢測汞離子的方法，對于環(huán)境污染、檢測食品安全等有重要的理論和實用價值。
[0003]谷胱甘肽(GSH)作為身體中最豐富的抗氧化劑以及自由基清除劑，它參與著很多重要的生理進程。GSH在人體血液中以及組織中的含量被認為與很多的疾病以及疾病的治療有著非常密切的關(guān)系。研究表明，GSH在人體中含量的變化有可能將直接導致老化、帕金森疾病、以及癌癥的發(fā)生。
[0004]對于GSH以及汞離子的檢測，過去常采用儀器檢測方法進行檢測，這些方法包括高效液相色譜法、原子吸收光譜測定法、質(zhì)譜法、電化學方法以及熒光測定法等。在這些分析方法中，熒光檢測法因其高選擇性、易操作性以及短的時間響應等特點成為人們檢測小分子的新寵。在過去，有機染料作為熒光探針廣泛應用于重金屬離子的檢測。但是，有機染料斯托克斯位移小、熒光壽命短、耐光性差，因此，人們逐漸把注意力集中于制備無機納米材料用于檢測因為它們強烈的發(fā)光性、光催化穩(wěn)定性高以及光譜線寬等優(yōu)點。比如:熒光量子點(比如CdTe，CdSe)已經(jīng)應用于熒光檢測。CdS量子點用于檢測低水平汞離子，這些量子點檢測方法雖然靈敏，但對于檢測環(huán)境中的有毒金屬，它們合成步驟復雜困難;CdTe量子點用于檢測GSH，短的激發(fā)波長引起的本身的高熒光背景使得該材料不能應用于某些生物應用，即使制得近紅外的探針，也因為不能很好的消除自發(fā)熒光和散射光而不能得到廣泛的應用。近些年來，貴金屬熒光納米材料快速發(fā)展，被人們廣泛所知的是金納米團簇和銀納米團簇，它們都用很多環(huán)境友好型配體如多肽類、凝膠、蛋白質(zhì)以及DNA制得。這些熒光納米團簇具有超小尺寸、低毒性以及強的熒光性質(zhì)而被廣泛用于生物標記、生物成像、催化以及離子檢測。基于此，本發(fā)明在微波條件下以便宜的雞蛋清包被并還原四氯金酸迅速得到發(fā)強烈紅色熒光的金納米團簇，并利用熒光性質(zhì)應用于檢測汞離子以及檢測GSH。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種紅色熒光金納米團簇及其制備方法，且制備方法簡單、快速、成本低;制得的納米團簇可通過制作紅色熒光試紙用來檢測重金屬離子汞離子以及通過細胞成像來檢測谷胱甘肽，從而間接初步識別正常細胞和癌細胞的方法。
[0006]本發(fā)明提供的一種紅色熒光金納米團簇的制備方法，包括如下步驟:
[0007]稱取四氯金酸(HAuCl4.4H20)，在避光的容器中配制0.011濃度的說11(:14溶液;取蛋清于燒杯中，加入適量的水，攪拌5-10min后，將其收集置于離心機中以7000rpm離心10-20min，并收集上清液，最后將其定容至蛋清體積的25倍得到蛋清溶液;配制IM的NaOH溶液備用；取上述四氯金酸溶液稀釋4倍，置于微波反應器中，加入2倍體積的蛋清溶液，攪拌3-5min，然后向其中加入NaOH調(diào)節(jié)pH至11，繼續(xù)攪拌l_2min后移至微波裝置中，90°C下反應20-30min即得到紅色熒光金納米團簇(AuNCsOEW)。反應停止后，溶液變成澄清的淺黃色，在紫外燈下照射呈現(xiàn)強烈的紅色熒光。之后放入4°C冰箱備用。
[0008]上述制備的紅色熒光金納米團簇可在檢測汞離子以及谷胱甘肽中應用，也可用作熒光染料。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所選用的雞蛋清便宜，反應條件綠色無污染，得到的熒光納米團簇具有超小尺寸、低毒性以及強的熒光性質(zhì)；與前期研究比較，本文發(fā)明的熒光金納米團簇更容易制得，且大大縮短了反應時間，可應用于試紙染色，直接在染色的試紙上進行汞離子的檢測，而且檢測限低，實現(xiàn)了可視化研究，所以該材料可應用于食品中或水中汞離子的檢測；同時熒光位于近紅外區(qū)且斯托克斯位移大，可以拓展其在生物體內(nèi)的應用，如應用于癌細胞的檢測。向不發(fā)光的AuNCsOEW-Hg2+體系中加入谷胱甘肽，由于汞離子與谷胱甘肽的結(jié)合能力大于Hg2+與AuNCsOEW的結(jié)合能力，因此熒光恢復，配制不同濃度的谷胱甘肽與猝滅體系分別作用，得到一條理想的線性關(guān)系，隨著谷胱甘肽濃度的增加，熒光強度逐漸升高，表明在一定谷胱甘肽濃度范圍內(nèi)，材料熒光強度與谷胱甘肽濃度呈線性關(guān)系。通過熒光的變化可以檢測食物中或血液中的谷胱甘肽的含量。癌細胞中谷胱甘肽含量要遠大于正常細胞，利用這一性質(zhì)，將不發(fā)光的AuNCsOEW-Hg2+體系各加入正常細胞以及癌細胞中，發(fā)現(xiàn)癌細胞經(jīng)過一段時間孵育后熒光出現(xiàn)，而同一時間正常細胞中沒有熒光。根據(jù)這一現(xiàn)象，達到了識別正常細胞和癌細胞的目的，從而為識別早期癌癥提供了一種簡單易行的方法。
【附圖說明】
[0010]圖1A反應時間對AuNCsOEW的影響
[0011]圖1B反應溫度對AuNCsOEW的影響
[0012]圖1C反應pH對AuNCsOEW的影響
[0013]圖1D反應濃度對AuNCsOEW的影響
[0014]圖2A AuNCsOEW的紫外和熒光譜圖
[0015]圖2B AuNCsOEW的透射電鏡分析譜圖
[0016]圖2C AuNCsOEW的粒徑分析譜圖
[0017]圖2D AuNCsOEW的X射線光電子能譜分析譜圖
[0018]圖2E AuNCsOEW的紅外分析譜圖
[0019]圖2F AuNCsOEW的X射線衍射分析譜圖
[0020]圖3A金納米團簇AuNCsOEW作為熒光涂料的照片
[0021 ]圖3B金納米團簇AuNCsOEW作為熒光染色劑的染色折紙照片
[0022]圖4金納米團簇AuNCsOEW與各金屬離子相互作用相對熒光比較圖
[0023]圖5A汞離子不同濃度的金納米團簇AuNCsOEW熒光發(fā)射光譜
[0024]圖5B汞離子濃度與熒光強度的線性關(guān)系圖
[0025]圖6染色試紙滴加汞離子溶液前后對比圖
[0026]圖7AuNCsOEW-Hg2+與體內(nèi)某些生物分子相互作用相對熒光比較圖
[0027]圖8A谷胱甘肽不同濃度的AuNCsOEW-Hg2+熒光發(fā)射光譜
[0028]圖8B谷胱甘肽濃度與熒光強度的線性關(guān)系圖
[0029]圖9A不同濃度AuNCsOEW對人肝癌細胞(HepG2)、人宮頸癌細胞(HeLa)活性的影響
[0030]圖9B用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察AuNCsOEW在人肝癌細胞(HepG2)、人宮頸癌細胞(HeLa)中的成像
[0031 ]圖10用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察正常細胞和癌細胞加入不發(fā)光的AuNCsOEW-Hg2+體系對比圖
【具體實施方式】
[0032]以下為實施例中使用的材料:
[0033]四氯金酸(HAuCl4.4H20，分子量為411.9)為天津市登封化學試劑廠生產(chǎn)
[0034]雞蛋清(新鮮雞蛋)為當?shù)爻兴徺I。
[0035]氫氧化鈉(NaOH，分子量為40.0)為北京化工廠生產(chǎn)[0036 ] 谷胱甘肽(C1Hi7N3O6S，分子量為307.33)為生工生物生產(chǎn)
[0037]各種生物分子(半胱氨酸Cys、苯丙氨酸PHE、賴氨酸Lys、酪氨酸Tyr、葡萄糖glucose, 二硫蘇糖醇DTT、甘氨酸Gly、鉀離子K+、鈉離子Na+、鈣離子Ca2+)
[0038]三羥甲基氨基甲烷(C4HnNO3,分子量為121.14)為天津市光復精細化工研究所生產(chǎn)
[0039]實施例1
[0040]雞蛋清還原并包被制備紅色熒光金納米團簇
[0041]所有用到的容器用王水(VHa:VHNQ3= 3:l)泡洗，之后用二蒸水洗凈并烘干備用。首先從新鮮雞蛋中將蛋清小心提取出來，取4mL蛋清溶液加入燒杯中，加入適量的水開始攪拌，時間為1min，攪拌結(jié)束后將所有溶液轉(zhuǎn)移至1mLEP管中，將其收集至離心機中以7000rpm離心20min，離心結(jié)束后取出，將上清液收集至10mL容量瓶中，最終定容至lOOmL，放入4°C冰箱冷藏備用。稱取206.011^四氯金酸(說11(:14.4H20)，在棕色50mL容量瓶中配制
0.0IM濃度的HAuCl4溶液并放置4°C冰箱冷藏備用。配制IM的NaOH溶液1mL。取ImL已經(jīng)配好的HAuCl4溶液，用二蒸水稀釋至4mL，取2mL置于1mL微波玻璃反應器中，并加入4mL已稀釋的蛋清溶液，在攪拌器上進行攪拌，時間為5min，之后向其中加入80yL的NaOH溶液，將此反應器置于微波裝置中，設置反應條件(時間30min，溫度90°C，電功率150W，壓強250psi，攪拌速度高速，預攪拌時間2min。)，開始反應。反應結(jié)束后得到淡棕色液體，將其轉(zhuǎn)入EP管中并放入4°C冰箱備用。(圖1為制備材料時改變時間、溫度、濃度、pH以確定最佳的反應條件)
[0042]實施例2
[0043](I)金納米團簇AuNCsOEW紫外以及熒光表征
[0044]圖2A中觀察到，合成的材料在日光燈下呈現(xiàn)淡淡的棕色，為了確認合成的材料發(fā)什么熒光，將合成的材料放在紫外燈下，觀察到強烈的紅色的熒光;取2mL 二蒸水于紫外杯中作為空白，進行測定;之后取200yL制得的AuNCs溶液于紫外杯中，再向其中加入1800yL二蒸水進行稀釋，測定紫外吸收曲線，結(jié)果顯示該物質(zhì)沒有確切的吸收峰值，但是從400nm開始該物質(zhì)有吸收出現(xiàn);在熒光光譜儀上改變不同的激發(fā)峰，確定了最佳的發(fā)射峰位置以及強度。結(jié)果表明最佳激發(fā)位置為320nm，最佳發(fā)射峰為650nmo
[0045](2)金納米團簇AuNCsOEW的透射電鏡分析譜圖以及粒徑分析譜圖表征
[0046]為了確認金納米團簇形貌和尺寸大小，將超聲了半小時的金納米團簇溶液滴在銅網(wǎng)上制樣，待液體揮發(fā)，在透射電鏡下進行觀察。另外將超聲好的液體放入Zeta電位儀中配套的容器中，進行粒徑大小的測量。
[0047]圖2B為所制備的金納米團簇的透射電鏡分析譜圖，從圖中可看出制得的金納米團簇呈球狀，并且均勻分散，圖2C為所制備的金納米團簇的粒徑分析譜圖，結(jié)果顯示平均尺寸在4-6nm，與透鏡結(jié)果呼應。
[0048](3)金納米團簇AuNCsOEW的X射線光電子能譜分析(XPS)譜圖表征
[0049]為了確認AuNCsOEW的元素化合價態(tài)，將所制得的液體樣品經(jīng)過冷凍干燥器干燥得到固體，在X射線光電子能譜分析儀上進行表征。
[0050]圖2D為所制備的金納米團簇的X射線光電子能譜分析譜圖，AuNCs@EW中Au4f5/2和Au 4f7/2的結(jié)合能分別是87.6eV和84.(^，這和文獻當中報道的一致，在父?3中^11(40峰的位置在Au (I)