一種提高寡糖離子化效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，涉及一種寡糖離子化的方法，具體涉及一種提高寡糖 離子化效率的方法，尤其是一種提高寡糖在基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MLDI-T0F M巧中離子化的方法；該方法采用6-聯(lián)阱尼克醜胺（HYNIC)作為基質(zhì)分析寡糖，選擇性地 提高寡糖的離子化效率，且抑制了其它被分析物如膚段的離子化。
【背景技術(shù)】
[0002] 寡糖是體內(nèi)一類重要的信息物質(zhì)，具有諸多生物學(xué)功能，一般由3-10個(gè)單糖分子 通過糖巧鍵連接而成。所述寡糖具有重要的生理功能，如激活細(xì)胞的自我防衛(wèi)系統(tǒng)，決定細(xì) 胞識(shí)別，集聚及受體作用等，其諸多生物學(xué)功能決定了其在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 所述基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-T0F M巧是20世紀(jì)末問世并迅速發(fā) 展起來的質(zhì)譜技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域。所述MLDI-TOF MS因快速、靈敏、可提供結(jié) 構(gòu)信息等優(yōu)點(diǎn)，已成為糖類物質(zhì)分析的重要工具。在所述MALDI-TOF MS分析中，基質(zhì)起到 極其重要的作用；其中，所述基質(zhì)是一類能吸收激光的小分子有機(jī)物，將樣品混于基質(zhì)中， 在激光的照射下，樣品解吸并電離，再經(jīng)過飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。但是，天然寡糖的親水性強(qiáng)， 且缺乏質(zhì)子受體，在氣相中離子化效率低，阻礙了所述MLDI-TOF MS對(duì)寡糖的研究。目前， 為提高寡糖在質(zhì)譜中的離子化效率，有研究者進(jìn)行了各種嘗試，如進(jìn)行全甲基化衍生或還 原氨化衍生提升寡糖的疏水性或帶電性質(zhì)，從而提高寡糖的質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)。所述新型基質(zhì) 如二元基質(zhì)，離子液基質(zhì)，無(wú)機(jī)基質(zhì)等也陸續(xù)被報(bào)道可提高寡糖的檢測(cè)靈敏度。與衍生的方 法相比，直接利用基質(zhì)檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便，節(jié)省試劑，無(wú)需純化，譜圖解析方便等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 但迄今為止，尚未見有關(guān)采用6-聯(lián)阱尼克醜胺（HYNIC)作為基質(zhì)分析寡糖、提高 寡糖在基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜中離子化方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高寡糖離子化效率的方法，尤其是一種提高寡糖在 基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MLDI-T0F M巧中離子化的方法；該方法采用6-聯(lián)阱尼 克醜胺（HYNIC)作為基質(zhì)分析寡糖，選擇性地提高寡糖的離子化效率，且抑制了其它被分 析物如膚段的離子化。
[0006] 具體而言，本發(fā)明提供的的提高寡糖在基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜中離子化 的方法，其特征在于，采用6-聯(lián)阱尼克醜胺（HYNIC)作為寡糖在MLDI分析中的基質(zhì)，其步 驟包括：
[0007] (1)樣品溶液點(diǎn)祀烘干后，將所述基質(zhì)6-聯(lián)阱尼克醜胺（HYNIC)溶液點(diǎn)在相應(yīng)革己 點(diǎn)上烘干；
[000引 似將祀板送入所述MLDI-TOF-MS分析。
[0009] 本發(fā)明的方法中，所述6-聯(lián)阱尼克醜胺（HYNIC)具有式（I )的結(jié)構(gòu)，
[0010]
[0011] 本發(fā)明的方法中，所述基質(zhì)溶劑體系為甲醇與己酸體系；
[0012] 本發(fā)明的方法中，所述己酸體積分?jǐn)?shù)為1. 5-5%，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中優(yōu)選己酸 體積分?jǐn)?shù)為2% ;
[0013] 本發(fā)明的方法中，所述6-聯(lián)阱尼克醜胺（HYNIC)的終濃度為1. 5-3mg/mU本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施例中優(yōu)選為2mg/mL。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其包括下述步驟：
[0015] (1) W麥芽走糖值P7)，葡聚糖1000為標(biāo)準(zhǔn)寡糖，標(biāo)準(zhǔn)核必巖藻糖（NA2F)，標(biāo)準(zhǔn)唾 液酸化N糖（Al)為標(biāo)準(zhǔn)N-糖鏈，測(cè)試所述HYNIC作為基質(zhì)的效果，并與傳統(tǒng)基質(zhì)D皿進(jìn)行 對(duì)比；
[0016] (2) W標(biāo)準(zhǔn)合成膚段與DP7的混合物，核糖核酸酶B糖鏈與膚段混合物為模型測(cè)試 所述HYNIC的選擇性離子化效果，并與傳統(tǒng)基質(zhì)D皿進(jìn)行對(duì)比；
[0017] (3) W DP7為標(biāo)準(zhǔn)寡糖，非揮發(fā)性鹽氯化鋼為溶劑測(cè)試所述HYNIC的耐鹽性，并與 傳統(tǒng)基質(zhì)D皿進(jìn)行對(duì)比；
[0018] (4) W DP7為標(biāo)準(zhǔn)寡糖利用串級(jí)質(zhì)譜測(cè)試所述HYNIC對(duì)于其碎裂方式的影響，并與 傳統(tǒng)基質(zhì)D皿進(jìn)行對(duì)比；
[0019] (5) W去糖鏈酶PNGase F釋放人血清糖蛋白質(zhì)N-糖鏈作為實(shí)際樣品，測(cè)試所述 HYNIC基質(zhì)用于實(shí)際樣品分析的可行性。
[0020] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能選擇性地提高寡糖的離子 化效率，且抑制了其它被分析物如膚段的離子化（如表1和表2所示）；且具有靈敏度高、 結(jié)晶均勻、耐鹽性強(qiáng)、串級(jí)質(zhì)譜碎片信息豐富等特點(diǎn)。
[0021] 表1分別采用HYNIC和D皿檢測(cè)到的SOpmol葡聚糖1000的不同聚合度寡糖的質(zhì) 荷比信息
[0022]
[0023] 表2采用HYNIC為基質(zhì)的進(jìn)行麥芽走糖串級(jí)譜圖檢測(cè)中跨環(huán)斷裂的信息
[00巧]本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] (1)所述HYNIC作為基質(zhì)可大幅度提高寡糖質(zhì)譜分析的信噪比與信號(hào)強(qiáng)度；
[0027] (2)所述HYNIC作為基質(zhì)可選擇性地提高寡糖的離子化效率，同時(shí)抑制膚段的離 子化效率；
[0028] (3)所述HYNIC作為基質(zhì)結(jié)晶均勻，提高了寡糖檢測(cè)的信號(hào)穩(wěn)定性與重復(fù)性；
[0029] (4)所述HYNIC作為基質(zhì)提高了寡糖二級(jí)質(zhì)譜信噪比，豐富了碎裂信息，有利于糖 鏈結(jié)構(gòu)解析。
【附圖說明】
[0030] 圖1為HYNIC的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031] 圖2為上樣量為Ipmol的DP7, Ipmol甲基化的DP7, 5pmol NA2F和5pmol Al分別 采用D皿（圖片上部）和HYNIC(圖片下部）為基質(zhì)的質(zhì)譜圖；其中，?代表糖鏈加鋼峰， 代表糖鏈加鐘峰；
[0032] 圖3上樣量為10化mol的葡聚糖1000分別采用和D皿(a)和HYNIC化）為基質(zhì)的 質(zhì)譜圖；其中，?代表糖鏈加鋼峰，代表糖鏈加鐘峰；
[003引圖4為標(biāo)準(zhǔn)膚段與DP7摩爾比為1:1 (曰，b)和1:10 (C，d)時(shí)，分別采用D皿(曰，C) 和HYNIC(b，d)為基質(zhì)的質(zhì)譜圖；其中，?代表糖鏈加鋼峰，代表糖鏈加鐘峰。*代表膚段 峰；
[0034] 圖5為1化mol當(dāng)量的核糖核酸酶B糖鏈與膚段混合物分別采用D皿(a)和 HYNIC化）為基質(zhì)的質(zhì)譜圖；其中，?代表糖鏈加鋼峰，*代表膚段峰；
[00對(duì)圖6為上樣量為Ipmol的DP7分別采用HYNIC (紅色）和D皿（黑色）為基質(zhì)信號(hào) 重復(fù)性示意圖；
[003引圖7上樣量為Ipmol的麥芽走糖分別采用HYNIC (a)和D皿化）為基質(zhì)的質(zhì)譜成像 圖；
[0037] 圖8為上樣量為Ipmol的DP7分別采用D皿（左側(cè)）和HYNIC (右側(cè)）W氯化鋼為 非揮發(fā)性溶劑進(jìn)行耐