一種檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于膠體金技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測(cè)周期短、流程簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確的檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]耳聾是最常見的致殘疾病和臨床遺傳病之一，已報(bào)道的新生兒發(fā)病率達(dá)I?3%。，研究發(fā)現(xiàn)，約60 %的新生兒耳聾與遺傳因素有關(guān)，即遺傳性耳聾。遺傳性聾分為非綜合征性耳聾(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)和綜合征性耳聾(syndromic hearingimpairment，SHI)。其中70%左右以常染色體隱性方式遺傳。遺傳性耳聾由單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變引起。至今發(fā)現(xiàn)的耳聾相關(guān)基因已達(dá)120余個(gè)，具有較高的基因和位點(diǎn)遺傳異質(zhì)性。
[0003]遺傳性耳聾在臨床上多表現(xiàn)為重度的感音神經(jīng)性聾，缺乏有效的臨床治療辦法，由于耳聾基因在正常人群中也有較高的攜帶率，因此耳聾基因篩查和產(chǎn)前診斷可以產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，從而真正達(dá)到提高人口質(zhì)量，優(yōu)生優(yōu)育的目的。因此早期診斷、早期預(yù)防是主要的遺傳性耳聾防治辦法。
[0004]隨著分子生物學(xué)技術(shù)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用，產(chǎn)前診斷結(jié)合基因檢測(cè)是一種有效的解決遺傳性耳聾發(fā)病的技術(shù)手段。然而基于PCR技術(shù)和DNA探針雜交以及生物芯片技術(shù)檢測(cè)遺傳性耳聾，至少需要幾個(gè)小時(shí)才能得到檢測(cè)結(jié)果，而且對(duì)人員，技術(shù)，場(chǎng)地，儀器都有嚴(yán)格的要求，不適合普通大眾自測(cè)使用。因此需要一種更簡(jiǎn)捷的方法來(lái)檢測(cè)遺傳性耳聾。
[0005]金標(biāo)免疫層析技術(shù)是一種簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)并且具有一定靈敏度的免疫分析技術(shù)，很適合在基層應(yīng)用。幾分鐘內(nèi)可以檢測(cè)出結(jié)果，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間；另外對(duì)人員或場(chǎng)地幾乎沒有什么要求，可以隨時(shí)隨地進(jìn)行自測(cè)。市場(chǎng)上目前尚未采用金標(biāo)免疫層析技術(shù)進(jìn)行遺傳性耳聾的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)周期短、流程簡(jiǎn)單、適合自測(cè)、結(jié)果準(zhǔn)確的檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明第一方面提供了一種檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡，包括底板及依次粘貼在底板上的上樣墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸樣墊，所述膠體金結(jié)合墊為包被膠體金標(biāo)記SLC26A4抗體、GJB2抗體的玻璃纖維膜或聚酯膜，所述層析膜為包被SLC26A4抗體、GJB2抗體的硝酸纖維素膜。
[0008]本發(fā)明第二方面提供了上述檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡的制備方法，其步驟包括:
[0009](I)膠體金溶液制備:向HauCl4中加入檸檬酸三鈉，煮沸后用枸櫞酸三鈉、鞣酸為還原劑得到直徑為10_20nm的膠體金溶液；
[0010](2)膠體金結(jié)合墊制備:將膠體金溶液調(diào)至pH7.5-8.5后加入SLC26A4抗體、GJB2抗體和封閉劑，標(biāo)記結(jié)束后將沉淀復(fù)溶至含有BSA、蔗糖的膠體金溶液中，將復(fù)溶產(chǎn)物加至玻璃纖維膜或聚酯膜后干燥；
[0011](3)層析墊制備:將SLC26A4抗體、GJB2抗體用PBS稀釋后分別在硝酸纖維素膜上劃線包被后干燥；
[0012](4)試紙卡組裝:將上樣墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸樣墊依次粘貼至底板上。
[0013]本發(fā)明第三方面提供了一種遺傳性耳聾檢測(cè)膠體金試劑盒，所述試劑盒包括上述檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:(I)本發(fā)明提供的檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡，采用金標(biāo)免疫層析技術(shù)同時(shí)對(duì)SLC26A4、GJB2抗體進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)中不需要昂貴的儀器和繁瑣的操作過(guò)程，簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，大大縮短了檢測(cè)周期，檢測(cè)時(shí)間比基因分析方法縮短了許多。
[0015](2)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，樣本無(wú)需轉(zhuǎn)入其它分析裝置，直接滴加實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)易操作，避免交叉污染，而且可同時(shí)完成定量分析。血清、全血、尿液、組化定性試驗(yàn)的組織切片、細(xì)胞涂片等樣品均可作為檢測(cè)樣品。
[0016](3)較基因芯片方法和傳統(tǒng)的測(cè)序方法成本低、操作簡(jiǎn)便、無(wú)污染安全，可以在幾分鐘內(nèi)得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果且結(jié)果準(zhǔn)確，可供群眾自檢自測(cè)，且可確認(rèn)患者的待測(cè)樣本中是否存在基因突變，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供參考，在大規(guī)模孕前預(yù)防、孕期干預(yù)、產(chǎn)后篩查及用藥指導(dǎo)中可得到廣泛應(yīng)用，提供了一種檢測(cè)人類遺傳性耳聾的新思路。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是本發(fā)明提供的檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明第一方面提供了一種檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡，包括底板及依次粘貼在底板上的上樣墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸樣墊，所述膠體金結(jié)合墊為包被有膠體金標(biāo)記SLC26A4抗體、GJB2抗體的玻璃纖維膜或聚酯膜，所述層析膜為同時(shí)包被SLC26A4抗體、G JB2抗體的硝酸纖維素膜。
[0019]GJB2、SLC26A4等基因是常見的耳聾相關(guān)基因，GJB2上的235delC、299delAT、176dell6，以及SLC26A4上的IVS7-2A>G、2168A>G等為熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，病理性攜帶率和雙等位基因突變率均高。針對(duì)上述熱點(diǎn)突變進(jìn)行篩查，可以為40%以上的聾病患者明確病因。由于耳聾基因在正常人群中也有較高的攜帶率，如GJB2、SLC26A4突變?cè)诼犃φＨ巳褐袛y帶率均為3%，線粒體DNA1555和1494突變攜帶率約為1/300，聽力正常的育齡夫婦攜帶至少一種基因突變的幾率為6.3%。因此在有生育要求但無(wú)耳聾家族遺傳史的聽力正常育齡夫婦中進(jìn)行常見耳聾基因篩查，在此基礎(chǔ)上對(duì)攜帶耳聾基因突變的夫婦提供遺傳咨詢，這一前瞻性防治策略將阻止較大比例的先天性隱性遺傳性耳聾的出生，其意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)已生育聾兒的正常夫婦進(jìn)行耳聾遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，從根本上為預(yù)防遺傳性耳聾發(fā)生提供了理論依據(jù)和方法。
[0020]優(yōu)選的，所述層析膜上包被的SLC26A4抗體、GJB2抗體的濃度分別為0.4-0.6mg/ml、0.9-1.lmg/ml。
[0021]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述層析膜上設(shè)置有相互平行的檢測(cè)線Tl、檢測(cè)線T2、質(zhì)控線，所述檢測(cè)線Tl通過(guò)包被SLC26A4抗體形成，所述檢測(cè)線T2通過(guò)包被GJB2抗體形成，所述質(zhì)控線通過(guò)包被羊抗鼠IgG抗體形成。
[0022]更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述檢測(cè)線Τ2設(shè)置于檢測(cè)線Tl與質(zhì)控線之間。
[0023]優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜孔徑為5_12um。
[0024]優(yōu)選的，所述層析膜的兩端分別搭接有吸樣墊、膠體金結(jié)合墊，所述膠體金結(jié)合墊的另一端搭接有上樣墊。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述上樣墊搭接壓住膠體金結(jié)合墊的1/3，所述膠體金結(jié)合墊搭接壓住層析墊的1/4，所述吸樣墊搭接壓住膠體金結(jié)合墊的1/10。
[0026]上述檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡的制備方法，其步驟包括:
[0027](I)膠體金溶液制備:向HauC14中加入檸檬酸三鈉，煮沸后用枸櫞酸三鈉、鞣酸為還原劑得到直徑為10_20nm的膠體金溶液；
[0028](2)膠體金結(jié)合墊制備:將膠體金溶液調(diào)至pH7.5-8.5后加入SLC26A4抗體、GJB2抗體和封閉劑，標(biāo)記結(jié)束后將沉淀復(fù)溶至含有BSA、蔗糖的膠體金溶液中，將復(fù)溶產(chǎn)物加至玻璃纖維膜或聚酯膜后干燥；
[0029](3)層析墊制備:將SLC26A4抗體、GJB2抗體用PBS稀釋后分別在硝酸纖維素膜上劃線包被后干燥；
[0030](4)試紙卡組裝:將上樣墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸樣墊依次粘貼至底板上。
[0031]本發(fā)明第三方面提供了一種遺傳性耳聾檢測(cè)膠體金試劑盒，所述試劑盒包括上述檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡。
[0032]優(yōu)選的，所述試劑盒還包括比色卡、膠體金定量讀數(shù)儀中的一種或幾種。
[0033]實(shí)施例1
[0034]本實(shí)施例提供了一種檢測(cè)遺傳性耳聾的膠體金試紙卡，并提供了該試紙卡的制備方法。
[0035]一、主要材料
[0036]SLC26A4，GJB2特異性配對(duì)抗體、羊抗鼠IgG抗體:北京盛齊揚(yáng)桓科技有限公司產(chǎn)品；氯金酸:Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜:SART0RIUS(德國(guó)),CNl40;德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白:Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純?cè)噭?br>[0037]二、膠體金的制備方法
[0038]1、將HauCl4先配制成0.01%水溶液，取10ml加熱至沸。
[0039]2、攪動(dòng)下逐滴準(zhǔn)確加入I %檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)水溶液2.00—4.50ml。
[0040]3、繼續(xù)加熱煮沸30min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成橙紅一紅色-紫紅。全過(guò)程約2?3min。
[0041 ] 4、冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至100ml。
[0042]SLC26A4抗體、GJB2抗體膠體金標(biāo)記:枸櫞酸三鈉-鞣酸混合還原劑制備直徑為15nm的膠體金溶液，制備完成后取二份膠體金，分別用0.2M K2CO3將溶液調(diào)到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每10ml溶液加入0.5mg、Img將標(biāo)記用SLC26A4抗體、GJB2抗體緩慢滴