一種復(fù)合病毒半定量檢測(cè)金標(biāo)卡及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能實(shí)現(xiàn)百合三種病毒快速半定量檢測(cè)的復(fù)合金標(biāo)卡及制備方法，具體指運(yùn)用膠體金免疫層析法，研制出同時(shí)能快速半定量檢測(cè)百合X病毒(LVX)、百合李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)和百合草莓潛隱環(huán)斑病毒(SLRSV)的復(fù)合金標(biāo)卡及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本植物，是一種集觀賞、食用、藥用價(jià)值于一身的重要經(jīng)濟(jì)作物;在中國，食用和藥用百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展較好;食用百合屬于稀有特種蔬菜，是具有清熱潤肺、增強(qiáng)免疫力等保健功能的綠色食品，市場(chǎng)需求量很大，尤其是蘭州百合以含糖量高，粗纖維少，肉質(zhì)細(xì)膩，營養(yǎng)豐富而享有很高的聲譽(yù);對(duì)于切花百合，我國上世紀(jì)80年代末就開始了切花生產(chǎn)，但自繁百合種球病毒病等病害嚴(yán)重，種球質(zhì)量難以達(dá)到國外同類產(chǎn)品的水平，目前國內(nèi)百合切花生產(chǎn)中90%以上的種球依賴進(jìn)口，每年進(jìn)口百合種球1.5億個(gè)，耗資巨大。
[0003]隨著國內(nèi)百合種植面積的擴(kuò)大，加之進(jìn)口種球質(zhì)量參差不齊，無性繁殖使病毒廣泛傳播并積累，除了常見的百合斑駁病毒一Lily mottle virus, LMoV、百合黃瓜花葉病毒一Cucumber mosaic virus, CMV和百合隱癥病毒一Lily symptomless virus, LSV)外，近年來，相繼有百合X病毒(Lily virus X, LVX)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necroticringspot virus , PNRSV)和草莓潛隱環(huán)斑病毒(Strawberry latent ringspot virus ,SLRSV)等被報(bào)道可以侵染百合，且侵染率超過了 20%，造成百合葉片褪綠并出現(xiàn)黃條紋、葉畸形、植株矮化、產(chǎn)量以及品質(zhì)下降等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可引起毀滅性災(zāi)害。
[0004]LVX為馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)成員，LVX粒子無包膜，呈彎曲纖絲狀，長470nm，直徑13nm，外殼蛋白(CP)呈螺旋狀，其上有模糊的溝狀結(jié)構(gòu)；LVX基因組由5823個(gè)核苷酸組成，3 ’-末端具有poly (A)尾巴，CP亞基分子量大小為22.0kDa左右;PNRSV屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬(Ilarvirus)，PNRSV是正單鏈的RNA病毒，核酸大小為8.056kb，PNRSV病毒粒子形態(tài)為等軸對(duì)稱多面體，直徑約為22_23nm，CP蛋白含一種亞基，分子量約為25.0kDa ； SLRSV隸屬于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)溫州蜜柑矮縮病毒屬(Sadwavirus)，SLRSV是單鏈的RNA病毒，病毒粒子形態(tài)為球狀，大小相等，直徑30nm，CP蛋白包含大小兩種亞基，分子量分別約為43.0和26.0 kDa。
[0005]經(jīng)過大量的調(diào)查和田間取樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病毒病可使食用百合的產(chǎn)量由每畝1500公斤降至600公斤，甚至更少，2012年7月，蘭州百合種植區(qū)域爆發(fā)了嚴(yán)重的病毒病災(zāi)害，導(dǎo)致大面積枯死，給農(nóng)戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失;病毒病已造成百合種源嚴(yán)重退化，已是制約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素;如何對(duì)百合常見病毒實(shí)現(xiàn)全面、快速檢測(cè)，已成為百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要。
[0006]目前，對(duì)LVX、PNRSV和SLRSV檢測(cè)的主要技術(shù)和方法有電子顯微鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和核酸檢測(cè)法(PCR)等，但這些技術(shù)和方法普遍存在檢測(cè)程序復(fù)雜、耗時(shí)(6-7h/樣)、分析費(fèi)用高、對(duì)儀器和實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)水平要求高等問題，很難在生產(chǎn)中得到普遍推廣應(yīng)用；膠體金免疫層析是以硝酸纖維素膜為載體，通過液體的滲移，利用抗原抗體的結(jié)合，以及膠體金呈現(xiàn)顏色反應(yīng)來檢測(cè)抗原或抗體;該方法可以避免以上幾種檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，以其特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)便、不需任何儀器、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛接受，已用于包括煙草斑駁病毒、南瓜花葉病毒等多種植物病毒的檢測(cè)。
[0007]對(duì)于百合病毒，目前已有用膠體金免疫層析法檢測(cè)LMoV和LSV等的相關(guān)報(bào)道(Zhang et al., 2015, J Virol Methods , 220)，但是其只能進(jìn)行定性檢測(cè)，也就是說檢測(cè)結(jié)果僅能定性判斷病毒的有或無，對(duì)于陽性結(jié)果無法得知被檢樣品病毒含量的差異，田間防治病毒時(shí)依舊盲目而缺乏科學(xué)依據(jù)，從而阻礙了該方法的廣泛普及與推廣。
[0008]近年來，通過我們對(duì)田間感病毒程度不同的百合葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)、光合色素含量、防御酶活性等生理生化指標(biāo)的測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)許多陽性植株通常無明顯癥狀，其葉綠體結(jié)構(gòu)、光合色素含量以及株高、莖粗、葉片形狀等生長指標(biāo)與健康植株沒有差異;而部分陽性植株葉片形成了輕微的斑駁條紋，葉綠體結(jié)構(gòu)被部分破壞，光合色素含量以及株高、莖粗等生長指標(biāo)顯著低于健康植株;也發(fā)現(xiàn)少量的陽性植株出現(xiàn)了明顯的斑駁條紋或壞死斑，葉片嚴(yán)重變小，植株嚴(yán)重矮化，生理測(cè)定發(fā)現(xiàn)其葉綠體結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，光合色素含量顯著低于健康植株(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(1));進(jìn)一步通過對(duì)病毒含量的Real-time PCR檢測(cè)，證實(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀的陽性植株，其病毒相對(duì)含量是無癥狀陽性植株的 1000倍以上(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(2));以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明病毒含量的差異對(duì)百合生長影響的差異較大，所以對(duì)于感病程度不同的陽性植株應(yīng)該采取不同的策略，科學(xué)管理、合理防治，最大程度降低病毒對(duì)百合生長的危害;可見，檢測(cè)病毒含量的差異將對(duì)田間病毒管理起到非常重要的指導(dǎo)意義。
[0009]此外，目前對(duì)于百合病毒的防治主要以殺滅傳播介體-蚜蟲為主，對(duì)于如何科學(xué)地噴施抗百合病毒藥劑，噴施抗病毒藥劑后百合病毒增殖是否被抑制，若已抑制，抑制的程度如何等問題均沒有相關(guān)報(bào)道，而這些問題的解決首先依賴于半定量檢測(cè)；因此，實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)的意義重大。
[0010]本發(fā)明為了進(jìn)一步提高膠體金免疫層析檢測(cè)方法的使用效率和田間普及率，降低檢測(cè)成本，實(shí)現(xiàn)對(duì)百合常見病毒的快速且半定量檢測(cè)，我們通過對(duì)已有膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行不斷優(yōu)化和改進(jìn)，采用了多向免疫層析技術(shù)，研制能一次性同時(shí)半定量檢測(cè)LVX、PNRSV和SLRSV的復(fù)合金標(biāo)卡，解決LVX、PNRSV和SLRSV單一半定量檢測(cè)金標(biāo)卡技術(shù)存在的單一性、局限性以及傳統(tǒng)的百合病毒檢測(cè)方法成本高、耗時(shí)長、對(duì)儀器設(shè)備和專業(yè)技能要求高等問題的束縛，讓種植人員在田間便可掌握病毒快速檢測(cè)技術(shù)，在健康種源的選擇以及百合種植和生長的全過程內(nèi)隨時(shí)檢測(cè)病毒，為百合病毒病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和防治提供數(shù)據(jù)支持。該LVX、PNRSV和SLRSV的多向復(fù)合金標(biāo)卡的開發(fā)，將為加快百合產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展、提高百合產(chǎn)區(qū)農(nóng)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，增加農(nóng)民收入，促進(jìn)脫貧致富做出貢獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是運(yùn)用膠體金免疫層析法研制一種能同時(shí)快速半定量檢測(cè)三種百合病毒LVX、PNRSV和SLRSV的復(fù)合金標(biāo)卡及其制備方法。
[0012]本發(fā)明金標(biāo)卡可一次性同時(shí)快速半定量檢測(cè)LVX、PNRSV和SLRSV，無需任何儀器和設(shè)備，便可準(zhǔn)確檢測(cè)樣品之間三種病毒含量的差異;較LVX、PNRSV和SLRSV單一半定量檢測(cè)金標(biāo)卡，本發(fā)明金標(biāo)卡檢測(cè)效率更高，檢測(cè)成本進(jìn)一步降低，一次性檢測(cè)病毒種類更齊全；此外，其操作簡(jiǎn)便，攜帶方便，檢測(cè)快速，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好;可見本發(fā)明特別適用于百合病毒的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，也特別適合在田間推廣應(yīng)用，并且可靠性很高。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種百合X病毒、百合李屬壞死環(huán)斑病毒和百合草莓潛隱環(huán)斑病毒復(fù)合半定量檢測(cè)金標(biāo)卡，包括:金標(biāo)卡槽I，襯板26，樣品墊18，第一膠體金結(jié)合墊19，第二膠體金結(jié)合墊21，第三膠體金結(jié)合墊23，第一硝酸纖維素膜20，第二硝酸纖維素膜22，第三硝酸纖維素膜24，吸水濾紙25，其特征在于:金標(biāo)卡槽I包括上殼體和下殼體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設(shè)有加樣孔2、第一反應(yīng)窗3、第二反應(yīng)窗4和第三反應(yīng)窗5，樣品墊18置于加樣孔2下方，第一硝酸纖維素膜20置于第一反應(yīng)窗3下方，第二硝酸纖維素膜22置于第二反應(yīng)窗4下方，第三硝酸纖維素膜24置于第三反應(yīng)窗5下方，第一膠體金結(jié)合墊19上含有兔抗LVXIgG，第二膠體金結(jié)合墊21上含有兔抗PNRSV IgG，第三膠體金結(jié)合墊23上含有兔抗SLRSVIgG，襯板26固定于金標(biāo)卡槽I中，樣品墊18、第一膠體金結(jié)合墊19、第一硝酸纖維素膜20和吸水濾紙25依次排列連接于襯板26右側(cè)上表面，第二膠體金結(jié)合墊21、第二硝酸纖維素膜
22和吸水濾紙25依次排列連接于襯板26下側(cè)上表面，第三膠體金結(jié)合墊23、第三硝酸纖維素膜24和吸水濾紙25依次排列連接于襯板26左側(cè)上表面，第一硝酸纖維素膜20上設(shè)有第一檢測(cè)線6、第二檢測(cè)線7、第三檢測(cè)線8和第一對(duì)照線9，第二硝酸纖維素膜22上設(shè)有第四檢測(cè)線10、第五檢測(cè)線11、第六檢測(cè)線12和第二對(duì)照線13，第三硝酸纖維素膜24上設(shè)有第七檢測(cè)線14、第八檢測(cè)線15、第九檢測(cè)線16和第三對(duì)照線17，第一檢測(cè)線6、第二檢測(cè)線7、第三檢測(cè)線8上包被的是已知量的有濃度差異的兔抗LVX IgG，第四檢測(cè)線10、第五檢測(cè)線11、第六檢測(cè)線12上包被的是已知量的有濃度差異的兔抗PNRSV IgG，第七檢測(cè)線14、第八檢測(cè)線15、第九檢測(cè)線16上包被的是已知量的有濃度差異的兔抗SLRSV IgG，第一對(duì)照線9、第二對(duì)照線13和第三對(duì)照線17上均包被的是羊抗兔IgG，第一檢測(cè)線6、第二檢測(cè)線7、第三檢測(cè)線8上LVX IgG包被量分別為1.5?2.0 pg、0.75?1.0 yg和1.5?2.0 yg蛋白，第四檢測(cè)線10、第五檢測(cè)線11、第六檢測(cè)線12上PNRSV IgG包被量分別為2.5?3.0 pg、1.25?1.5 yg和2.5?3.0 yg蛋白，第七檢測(cè)線14、第八檢測(cè)線15、第九檢測(cè)線16上兔抗SLRSV IgG包被量分別為2.5?3.0 pg、1.25?1.5 yg和2.5?3.0 yg蛋白，第一膠體金結(jié)合墊19上兔抗LVX IgG標(biāo)記量為16 yg/mL，第二膠體金結(jié)合墊21上兔抗PNRSV IgG標(biāo)記量為20 yg/mL，第三膠體金結(jié)合墊23上兔抗SLRSV IgG標(biāo)記量為22 yg/mL，羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2.5?3.0yg蛋白ο
[0014]其中在用所述金標(biāo)卡檢測(cè)時(shí)，在所述加樣孔處加入百合樣品的待檢溶液，對(duì)比第一反應(yīng)窗、第二反應(yīng)窗和第三反應(yīng)窗內(nèi)第一至第九檢測(cè)線以及第一至第三對(duì)照線的顏色，即可判定被檢百合是否感染了百合X病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒或草莓潛隱環(huán)斑病毒，若已感染，可以進(jìn)一步判定被檢測(cè)樣品病毒含量的差異。
[0015]其中將待檢溶液加入所述金標(biāo)卡的加樣孔內(nèi)，若待檢溶液中含有LVX，在第一反應(yīng)窗3內(nèi)，檢測(cè)樣品經(jīng)過所述第一膠體金結(jié)合墊19時(shí)，LVX與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一至第三檢測(cè)線6、7、8方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測(cè)線6時(shí)發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被全部截留下來，形成可見的淡紅色條帶;金標(biāo)墊上剩余的金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二檢測(cè)線7和第三檢測(cè)線8方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二檢測(cè)線7和第三檢測(cè)線8時(shí)不發(fā)生反應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對(duì)照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對(duì)照線9時(shí)與羊抗兔IgG結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶;此外，在第二反應(yīng)窗4和第三反應(yīng)窗5內(nèi)，檢測(cè)樣品經(jīng)過所述第二和第三膠體金結(jié)合墊21、23時(shí)，則不能與所述金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述第四至第九檢測(cè)線10、11、12、14、15、16時(shí)不發(fā)生反應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第二對(duì)照線13和第三對(duì)照線17方向滲移，當(dāng)接觸到所述第二和第三對(duì)照線13和17時(shí)與羊抗兔IgG結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)?shù)诙恋诰艡z測(cè)線7、8、10、11、12、14、15、16沒有顏色變化，而第一檢測(cè)線6出現(xiàn)淡紅色、第一至第三對(duì)照線9、13、17出現(xiàn)棕紅色條帶時(shí)，則判定被檢樣品感染了百合X病毒，病毒含量低，田間防治以殺滅蚜蟲為主；
若待檢溶液中含有LVX，在第一反應(yīng)窗3內(nèi)，檢測(cè)樣品經(jīng)過所述第一膠體金結(jié)合墊19時(shí)，LVX與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述第一至第三檢測(cè)線6、7、8方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一檢測(cè)線6時(shí)發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被部分截留下來，形成可見的淡紅色條帶;剩余的復(fù)合物繼續(xù)往第二檢測(cè)線7、第三檢測(cè)線8方向滲移，當(dāng)接觸到第二檢測(cè)線7時(shí)發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)被全部截留下來，形成淡紅色條帶;剩余的金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第三檢測(cè)線8和第一對(duì)照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第三檢測(cè)線8時(shí)不發(fā)生反應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述第一對(duì)照線9方向滲移，當(dāng)接觸到所述第一對(duì)照線