一種基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬的雙抗體夾心elisa法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬的雙抗體夾心ELISA法，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單增李斯特菌是一種兼性厭氧性革蘭氏陽性細(xì)菌，屬于李斯特菌屬。它主要以食物為傳染媒介，是全球范圍內(nèi)的最致命的食源性病原體之一。李斯特菌在環(huán)境中分布廣泛，肉類、蛋類、禽類、乳制品、蔬菜等均已被證實是李斯特菌的感染源。感染李斯特菌后會引起肌肉疼痛、惡心、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，而且由于該菌在4°C冷藏溫度下仍可生長繁殖，被污染的冷藏食品對人類健康具有很大威脅。因此很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0003]李斯特菌屬共分為10個種，包括單增李斯特菌(L.monocytogenes)、綿羊李斯特菌(L.1uanuii)、英諾克李斯特菌(L.1nnocua)、威爾李斯特菌(L.welshimeri)等。其中單增李斯特菌是引起人類致病的主要原因。然而，作為食品衛(wèi)生學(xué)的指標(biāo)，李斯特菌常常被要求專門進行檢測。檢測李斯特菌屬的方法目前主要有平板培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)、酶聯(lián)免疫方法(ELISA)。
[0004]Elisa作為檢測微生物的常用方法具有快速、靈敏、特異性好、高通量、不需要大型儀器，易于推廣的特點。直接檢測微生物的Elisa試劑盒檢測抗原通常為菌體的表面抗原，檢測抗體一般為多克隆抗體或單克隆抗體。由于單克隆抗體具有理化性質(zhì)單一、特異性好、親和力高并可以無限生產(chǎn)的特點，比多克隆抗體具有更高的應(yīng)用價值。本發(fā)明制備了李斯特菌屬特異性單克隆抗體并建立起李斯特菌屬特異性的雙抗體夾心ELISA方法，為食品中李斯特菌屬的監(jiān)測與控制提供了分析手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005](一)要解決的技術(shù)問題
李斯特菌屬包括10個種，其中的單增李斯特種又分為13種亞型，種類較為繁多。如何實現(xiàn)對李斯特菌屬的均一性、特異性檢測是目前ELISA方法仍需要解決的問題。本發(fā)明的目的在于建立一種具有較高靈敏度、均一、特異性好、操作簡單的ELISA方法用于檢測食品中的李斯特菌屬的。
[0006](二)技術(shù)方案
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬的雙抗體夾心ELI SA法，酶標(biāo)板上包被了包被抗體2G7，可特異性捕獲李斯特菌屬內(nèi)的李斯特菌，2H8-HRP為酶標(biāo)抗體，包被抗體2G7與李斯特菌結(jié)合后催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，P/N 2 2.1時被判定為陽性，反之，P/N<2.1則判定為陰性； 抗體2G7，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCCN0.10875；
酶標(biāo)抗體2H8，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCC N0.10876；
步驟為:
(I)李斯特菌屬單克隆抗體的制備
以原核表達的單增李斯特菌P60蛋白(Listeria monocytogenes J0161, GenBank:AEO 02672.1)為免疫原，免疫8周齡BALB/c小鼠并通過雜交瘤技術(shù)融合小鼠脾臟。免疫程序如下:第一周進行首免，SOyg/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射;第四周進行二免，80μg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射;第六周進行三免，40yg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射;第七周尾部采血測效價，檢測小鼠血清對李斯特菌屬及其它雜菌的交叉反應(yīng);第九周進行四免，40yg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射;第十周檢測小鼠血清對李斯特菌屬及其它雜菌的交叉反應(yīng)，篩選對李斯特菌屬效價高，交叉均一并且對其它雜菌沒有交叉的小鼠；第十二周進行沖刺免疫，20yg /只，生理鹽水溶解，腹腔注射;沖刺免疫3天后眼眶采血后進行用常規(guī)雜交瘤技術(shù)融合小鼠脾臟。
[0007](2)采用多重篩選得到具有李斯特菌屬特異性的細(xì)胞株。經(jīng)常規(guī)免疫融合后用單增李斯特菌CMCC 54003菌體包被檢測陽性，得到的陽性孔用ATCC 19111 (l/2a)、ATCC19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002( l/2c)、CMCC 54004^CMCC 54007、凍牛肉分離株(北京良潤生物技術(shù)有限公司提供)以及李斯特菌屬的ATCC 19119(Listeria ivanovii)、ATCC 33090(Listeria innocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri, 6b)、ATCC25400(Listeria grayi)包被的板檢測細(xì)胞株的交叉反應(yīng)，(以上ATCC菌體見AmericanType Culture Collect1n，美國模式培養(yǎng)物保藏中心簡稱ATCC;以上CMCC菌株見國家微生物資源平臺中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心簡稱CMCC)挑選對李斯特菌屬均有交叉反應(yīng)的強陽性孔進行亞克隆；隨后3次亞克隆后第7天均采用同樣的方案檢測陽性孔的交叉反應(yīng)并選孔進行亞克隆；多重篩選得到15株李斯特菌屬特異性單克隆抗體，分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，并以單增李斯特菌CMCC54003為目標(biāo)物進行兩兩配對；
(3)單克隆抗體的配對篩選
15株李斯特菌屬特異性單克隆抗體純化后分別標(biāo)記HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進行夾心法配對，配對參數(shù)如下:包被抗體2G7 4yg/mL;包被液為pH 9.6、0.0lM的碳酸鹽緩沖液;標(biāo)品CMCC 54003濃度5X10~7CFU/mL;標(biāo)品稀釋液含0.1% Tween 20 的pH7.2、0.0lM的PBS;酶標(biāo)抗體2H8-HRP稀釋1000倍使用，實驗成功得到了 18對P/N值>5的配對；
(4)李斯特菌屬特異性ELISA方法的建立
配對后，比較不同配對的檢測限和交叉反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，用包被抗體2G7和酶標(biāo)抗體2H8-HRP建立了李斯特菌屬特異性的夾心ELISA分析方法;具體參數(shù)如下:
包被抗體2G7包被濃度:4yg/mL，
包被液:pH9.6、0.0IM碳酸鹽緩沖液，
樣品稀釋液:含0.1% Tween 20的pH 7.2、0.0IM的PBS溶液，
酶標(biāo)抗體2H8-HRP濃度:2yg/mL，
反應(yīng)時間:包被、封閉:37°C，2h ；標(biāo)準(zhǔn)品:37°C，Ih ；酶標(biāo)抗體37°C，Ih ；顯色1min ； 本方法對包括單增李斯特菌在內(nèi)的李斯特菌屬的快速，高靈敏檢測;對單增李斯特菌ATCC 19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b) 、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003、CMCC 54004、CMCC 54007、凍牛肉分離株以及李斯特菌屬的ATCC 19119(Listeriaivanovii)、ATCC 33090(Listeria innocua, 6a)、ATCC 35897 (Listeria welshimeri,6b)、ATCC 25400(Listeria grayi)的實際檢測限(P/N 2 2.I)分別為I.36 X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.22X 106CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.36X15CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、4.53 X 104CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、l.36Χ105CFU/mL、1.36 X 105CFU/mL;同時對P60蛋白的實際檢測限達到了0.137 ng/mL，線性范圍為0.13-11.1ng/mL;對測試的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌沒有交叉反應(yīng)。
[0008]本發(fā)明方法的檢測分析原理是:
酶標(biāo)板上包被了捕獲抗體2G7，合適的濃度下可以最大限度捕獲李斯特菌屬;洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液220yL封閉板孔上多余結(jié)合位點；洗板3次，加入樣品和對照，37°C孵育Ih;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體2H8-HRP，37°C孵育Ih;洗板4次，加入顯色液顯色12min。如果樣品有足夠的李斯特菌，被捕獲抗體捕獲后與酶標(biāo)抗體2H8-HRP結(jié)合并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值(P/N > 2.1)，被判定為陽性;如果樣品沒有李斯特菌或濃度太低(P/N<2.1)那么樣品不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性。
[0009](三)有益效果
本發(fā)明制備了李斯特菌屬特異性單克隆抗體并建立了李斯特菌屬雙抗體夾心ELISA法，該方法對包括單增李斯特菌在內(nèi)的李斯特菌屬均有交叉反應(yīng)。該方法對單增李斯特菌及李斯特菌屬的實際檢測限(P/N 2 2.1)在4.53 X 14 CFU/mL到1.22 X 106CFU/mL之間。同時對P60蛋白的實際檢測限為0.137 ng/mL，線性范圍為0.13-11.1ng/mL。對測試的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌沒有交叉反應(yīng)。
[0010]生物材料樣品保藏:
單克隆細(xì)胞株2G7，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2015年5月 19日，保藏編號:CGMCC N0.10875。
[0011]單克隆細(xì)胞株2H8，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2015年5月19日，保藏編號:CGMCC N0.10876。
【附圖說明】
[0012]圖1單克隆抗體2H8與李斯特菌屬的交叉反應(yīng)。
[0013]圖2單克隆抗體2G7與李斯特菌屬的交叉反應(yīng)。
[0014]圖3李斯特菌雙抗體夾心ELISA法檢測P60蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0015]圖4李斯特菌雙抗體夾心ELISA法檢測李斯特菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施方案
[0016]以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
[0017]—、儀器:
TGL—40B臺式低速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠
KFLOW純水機，凱佛隆公司
ZD-9556水平搖床，太倉科教器材廠
96孔8 X 12可拆酶標(biāo)板，廈門怡佳美實驗器材有限公司
MuLtiska Mks酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems公司
可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司