風(fēng)疹病毒IgG抗體親和力檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，尤其是涉及一種風(fēng)疹病毒IgG抗體親和力檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 風(fēng)疹病毒(Rubella virus，RV)屬于皰疹類病毒中的披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬，是引 起風(fēng)疹的病原體，為RNA病毒，人是其唯一宿主。病毒經(jīng)過呼吸道傳播，潛伏期約2-3周，病毒 增殖后進(jìn)入血液引起病毒血癥。風(fēng)疹的臨床表現(xiàn)類似麻疹，但較麻疹感染癥狀輕，合并癥 少，受風(fēng)疹病毒感染的成年人，癥狀如一般的感冒，先有感冒的一般癥狀及耳后和枕下淋巴 結(jié)腫大，隨后面部出現(xiàn)潛紅色斑丘疹并迅速遍及全身，多在1-3天內(nèi)消退，預(yù)后良好。人群中 感染率約為95%，常被人們忽視。
[0003] 孕婦在孕期6個(gè)月內(nèi)感染風(fēng)疹病毒，病毒可通過胎盤侵犯胎兒(垂直傳播），除引起 流產(chǎn)、死產(chǎn)外，活產(chǎn)者大約29%表現(xiàn)為"先天性風(fēng)疹綜合征"（congenital rubella syndrome，CRS)，即出生時(shí)體重低于2.5公斤，發(fā)育遲緩；出生后全身性器官受損，先天性心 臟病，畸形，耳聾、失明等。CRS患兒最常見的是白內(nèi)障等眼疾，其次是耳聾，60%有心血管系 統(tǒng)缺損。鑒于孕婦在懷孕期間（特別是在早期)感染風(fēng)疹病毒可能造成的嚴(yán)重后果，對(duì)風(fēng)疹 病毒感染狀態(tài)的評(píng)估非常重要。IgM抗體是近期感染的一個(gè)指標(biāo)，但僅通過IgM抗體的檢測(cè) 來判定近期感染比較困難，因?yàn)閺?fù)發(fā)感染也會(huì)產(chǎn)生IgM抗體，而且對(duì)于一些免疫功能缺陷的 人群，IgM抗體可能存在半年以上。IgG親和力檢測(cè)可以幫助區(qū)分是否為原發(fā)感染或新的復(fù) 發(fā)感染，因?yàn)榈陀H和力的IgG抗體出現(xiàn)在感染后的前幾個(gè)月，隨著時(shí)間的推移，抗體逐漸成 熟為高親和力的抗體，高親和力的IgG抗體可以排除發(fā)生在4個(gè)月以內(nèi)的感染。
[0004] 目前，風(fēng)疹毒IgG抗體親和力檢測(cè)有中和抗體法和變性劑法。中和抗體法是利用抗 原溶液將樣本中的高親和力抗體中和掉，剩余的是低親和力抗體，親和力指數(shù)=1-中和結(jié) 果/未中和結(jié)果，根據(jù)親和力指數(shù)判定結(jié)果。中和抗體法的親和力指數(shù)受到加入的中和抗原 量和樣本中抗體濃度的影響，為得到準(zhǔn)確的結(jié)果需將抗體濃度稀釋到一定的范圍內(nèi)進(jìn)行檢 測(cè)，這種方法適合于全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)于手工操作則顯得比較麻煩，且該檢測(cè)產(chǎn)品屬國外 進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格昂貴。變性劑法是利用尿素或二乙胺等變性劑處理結(jié)合在固相載體上的抗 體，低親和力的抗體很容易被洗脫掉，高親和力的抗體仍舊結(jié)合在固相載體上。親和力指數(shù) =變性處理的結(jié)果/未變性處理的結(jié)果，根據(jù)親和力指數(shù)判定結(jié)果。變性法比較簡單，但對(duì)于 全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)來說，高濃度的變性劑容易造成交叉污染，故比較適合于手工操作，但截至 目前，尚沒有基于ELISA平臺(tái)變性劑法檢測(cè)風(fēng)疹病毒IgG抗體親和力的試劑盒批準(zhǔn)上市。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種適合手工操作且操作簡便的風(fēng)疹病毒IgG抗體親和力 檢測(cè)試劑盒。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案： 本發(fā)明所述的風(fēng)疹病毒IgG抗體親和力檢測(cè)試劑盒，包括微孔板、酶結(jié)合物工作液、樣 品稀釋液、解離緩沖液、對(duì)照緩沖液、高親和力質(zhì)控品、低親和力質(zhì)控品;所述微孔板上包被 有風(fēng)疹病毒抗原;所述酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體;所述解離 緩沖液為由PBST溶液中加入8Mol/L尿素配制而成。
[0007] 所述試劑盒還包括底物液、顯色劑和終止液。
[0008] 所述微孔板上包被的風(fēng)疹病毒抗原用pH9.6、0.05M的碳酸鹽緩沖液稀釋至0.1~ 0.4ug/人份后，再包被到空白微孔板上，以達(dá)到最佳的包被效果。
[0009] 所述酶結(jié)合物工作液中的抗體按體積比1:1000~10000的比例，用含牛血清、防腐 劑P300和表面活性劑Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl緩沖液進(jìn)行稀釋，以兼顧靈敏度和特異 性，使試劑盒達(dá)到最佳水平。
[0010] 所述高親和力質(zhì)控品中RV IgG高親和力抗體按體積比1:100~500的比例，用 PH7.4 0.02M PBS并含有BSA的緩沖液進(jìn)行稀釋。選擇最佳稀釋比例，以滿足試劑盒的性能 要求。
[0011] 所述低親和力質(zhì)控品中R V I g G低親和力抗體按體積比1: 5 5 0~10 0 0的比例，用 PH7.4 0.02M PBS并含有BSA的緩沖液進(jìn)行稀釋。選擇最佳稀釋比例，以滿足試劑盒的性能 要求。
[0012] 所述對(duì)照緩沖液是含牛血清、防腐劑P300和表面活性劑Tween-20的PH7.4的Tris-Hcl緩沖液；所述樣品稀釋液是含Casein、防腐劑P300、表面活性劑Tween-20的pH7.4的 Tris-Hcl緩沖液。
[0013] 所述顯色劑是含有TMB-HC1的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，PH3.0;底物液是含有過氧化 氫尿素的檸檬酸-乙酸鹽緩沖液，PH5.0;所述終止液為0.4M硫酸溶液。
[0014] 本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫間接法原理進(jìn)行檢測(cè)，用風(fēng)疹病毒抗原包被微孔板，辣根過 氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG作為酶結(jié)合物工作液。檢測(cè)時(shí)向微孔板中加入待測(cè)樣本(每個(gè)樣 本均做復(fù)孔），溫育反應(yīng)后特異性RV IgG抗體被結(jié)合在微孔板上，充分洗滌去掉未結(jié)合物， 向其中一孔加入解離緩沖液，另外一孔加入對(duì)照緩沖液，溫育反應(yīng)后低親和力RV IgG抗體 在解離緩沖液作用下與抗原分離。本發(fā)明試劑盒可以幫助區(qū)分風(fēng)疹病毒感染是否為原發(fā)感 染或新的復(fù)發(fā)感染，彌補(bǔ)了我國對(duì)人血清或血漿中風(fēng)疹病毒IgG抗體親和力檢測(cè)的空白，適 合于手工操作，且操作方法簡便，可用于大量樣本的檢測(cè)，為臨床醫(yī)生評(píng)估胎兒的健康狀況 和采取進(jìn)一步的措施提供有力的幫助。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做更加詳細(xì)的闡述。
[0016] 本發(fā)明所述的風(fēng)疹病毒IgG抗體親和力檢測(cè)試劑盒，包括微孔板、酶結(jié)合物工作 液、樣品稀釋液、解離緩沖液、對(duì)照緩沖液、高親和力質(zhì)控品、低親和力質(zhì)控品；其中微孔板 上包被的是風(fēng)疹病毒抗原;所述酶結(jié)合物工作液中的抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人 I gG抗體;解離緩沖液為由PBST溶液中加入8Mo 1 /L尿素配制而成。
[0017] -、本發(fā)明試劑盒的制備 1、制備微孔板 將風(fēng)疹病毒抗原用pH9.6、0.05M的碳酸鹽緩沖液稀釋至0.1~0.4ug/人份，作為微孔板 的包被液，每孔各加入l〇〇ul，在2~8°C溫度下放置16~32小時(shí)，洗板一次，加入封閉液120μ 1/孔，封閉液為PH7.4、0.02M的ros緩沖液中加入10%蔗糖和l%Casein(酪蛋白），在2~8°C 放置12~24小時(shí)，達(dá)到最佳的保護(hù)抗原蛋白穩(wěn)定的效果，甩去封閉液，置于恒溫干燥間干燥 16~36小時(shí)。
[0018] 2、制備酶結(jié)合物工作液 在pH7.4的Tris-Hcl緩沖液中，添加20%牛血清、0.1%防腐劑P300和0.1%表面活性劑 Tween-20，配制成稀釋液； 用上述配制的稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體，其中抗體與稀釋液 的體積比為1:1000~10000,本實(shí)施例中選用的比例為1:4000; 3、 制備尚未和力質(zhì)控品 采用PH7.4的0.02M PBS緩沖液中加入5%BSA配制成稀釋液； 然后用上述配制的稀釋液，按1:100~500的體積比稀釋RV IgG高親和力抗體(本實(shí)施例 選擇1:200)，得到高親和力質(zhì)控品； 4、 制備低親和力質(zhì)控品 采用PH7.4的0.02M PBS緩沖液中加入5%BSA配