原花青素的應(yīng)用及含原花青素的纖維蛋白原測定試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及原花青素在凝血測定試劑中的應(yīng)用，以及一種含有原花青素穩(wěn)定劑的 纖維蛋白原測定試劑及其制備方法，可用于檢測血漿中纖維蛋白原的含量。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維蛋白原為凝血因子I，是體內(nèi)重要的凝血因子，它在凝血酶存在的情況下，轉(zhuǎn) 變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白，導(dǎo)致血液凝固。檢測纖維蛋白原水平，可用來分析出血傾向。流行 病學(xué)研究表明，纖維蛋白原升高會引起血栓。
[0003] 纖維蛋白原由三對多肽鏈構(gòu)成，包括兩個α鏈，兩個β鏈和兩個γ鏈。它們之間通過 29個雙硫鍵連接，受凝血酶的作用，纖維蛋白原的α和β鏈分別游離出血纖維蛋白肽Α和血纖 維蛋白肽B而形成血纖維蛋白單體。血漿中纖維蛋白原的檢測方法有很多種，包括Clauss 法、PT法、免疫學(xué)法和稱重法。Clauss法和PT法的基礎(chǔ)分別為纖維蛋白的形成時間和凝血酶 原時間。免疫法為測量纖維蛋白原抗原而不是功能性纖維蛋白原，而稱重法則以凝血重量 為基礎(chǔ)。其中，Clauss法為美國臨床實驗室標準委員會(Clinical&Laboratory Standards Institute)推薦的方法。該方法的原理是，高濃度的凝血酶與低濃度纖維蛋白原血漿反應(yīng)， 纖維蛋白原含量與血凝時間成反比。在測試中，高濃度的凝血酶使稀釋血漿凝固，血漿的稀 釋比例一般為1:10,以最大限度地降低血漿中抑制組份(包括肝素及較高的FDP)帶來的影 響。
[0004] 另一方面，作為多酸類，黃酮可用于抗菌（Cushnie，T .，Lamb，A. Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents 2005,26， 343-356)，以及抑制腫瘤生長（Ferguson，P · J ·，Kurowska，E ·Μ·，F(xiàn)reeman，D · J · In vivo inhibition of growth of human tumor lines by flavonoid fractions from cranberry extract,Nutrition and Cancer 2006,56,8694)，而更多的研究則傾向于它的 抗氧化性會泛(Van Acker,S.A.B.E. ,Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids,Free Radical Biology and Medicine 1996,20,331-342.；De Souza,R.F., Antioxidant properties of complexes of flavonoids with metal ions,Redox Report 2004，9，97-104·;Teixeira S., Structure-property studies on the antioxidant activity of flavonoids present in diet.Free Radical Biology and Medicine 2005,39,1099-1108)。
[0005] 在纖維蛋白原測定試劑中，活性組份凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，也是血液凝血 級聯(lián)反應(yīng)中的主要效應(yīng)蛋白酶（Crawley JT，The central role of thrombin in hemostasis.J Thrombosis Haemostasis 2007,5(suppl 1):95-101;McMichael M.,New models of hemostasis. Topics in Companion Animal Medicine , 2012,27:40-45) 〇作為 活性凝血因子II，它的活性受很多因素的影響，特別是在液相或乳濁相中。為了維系凝血酶 的活性，可添加低濃度的鹽類和醇類（US Patent 4696812) ;BSA和EDTA(US Patent 4409334);氨基酸類和有機酸及多糖類(特願平11/272092卜口 ^ t、'^(7)安定化手段掃上0 組成物;US Patent 20060246052A1)。含有上述穩(wěn)定劑的液相凝血酶制劑，經(jīng)冷凍干燥制成 粉劑后，凝血酶的活性得到較好的保護。另一方面，根據(jù)實驗研究，上述添加劑對液態(tài)或乳 濁相中的凝血酶的穩(wěn)定效果并不盡理想，特別是在試劑存放較長時間的條件下。這是由于 液態(tài)狀態(tài)下，凝血酶的結(jié)構(gòu)相對粉末態(tài)比較脆弱，酸、堿、溫度、離子強度以及其它某些化合 物(包括重價金屬離子）的少量存在，都會引起凝血酶空間結(jié)構(gòu)的改變，局部結(jié)構(gòu)的微小變 化也會引起凝血酶活性的喪失。
[0006] 有研究表明，某些多酚類物質(zhì)可抑制血小板聚集活性(Mattiello Tl，Trifir0E， Jotti GS,Pulcinelli FM.,effects of pomegranate juice and extract polyphenols on platelet function,】 Med Food.2009Apr; 12(2) :334_339;邱培，不同兒茶素對人體血 小板聚集活性的影響，浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文，2015年6月）。另外，也有研究表明，在含有凝 血酶的體系中加入黃酮，凝血酶的活性會受到抑制（Hugo A.Guglielmone，Anticoagulant effect and action mechanism of sulphated flavonoids from Flaveria bidentis, Thrombosis Research，2002，2:183-188;Liu L,Ma H,Yang N，A series of natural flavonoids as thrombin inhibitors: structure-activity relationships.Thrombosis Researsh，2010，126: 365-378)。但是，黃酮包含多個亞類，它具有較好的抗氧化性，也具有 很強的金屬離子螯合能力，從而可以降低二價金屬離子對物相氧化反應(yīng)的催化作用（Van Acker,Influence of iron chelation on the antioxidant activity of flavonoids .Biochem.Pharmacol. 1998,56:935-943)。基于上述思路，我們發(fā)現(xiàn)并不是所有 的黃酮都能夠抑制凝血酶的活性，而屬于黃酮類的原花青素，不僅不會影響凝血酶的酰胺 反應(yīng)和蛋白反應(yīng)，同時還會提升含有凝血酶的液相體系的穩(wěn)定性能。
[0007] 原花青素主要分布在植物中，包括銀杏、大黃、山楂、耳葉番瀉、小連翹、葡萄、日本 羅漢柏、北美崖柏、花旗松、白樺樹、野生豪4葵、番荔枝、野草莓、海岸松、洋委陵菜、甘薯等， 其中，葡萄籽與松樹皮提取物中原花青素的含量相對較高。
[0008] 原花青素在結(jié)構(gòu)上由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，最簡單的原花青素 是兒茶素或表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體、三聚體、四聚體至十聚體。原花青 素含有很多酚羥基，溶解度較銀杏黃酮高，特別是低聚體的溶解性特別好。原花青素為白色 粉末，溶于水、乙醇、甲醇、丙酮，也可溶于乙酸乙脂。UN在280nm有強吸收。原花青素有較強 的抗氧化活性，對活性氧有很強的消除能力（Kota T, Increase of Antioxidative Potential of Rat Plasma by Oral Administration of Proanthocyanidin-Rich Extract from Grape Seeds(J)Agricultural and Food Chemistry,1999,45(5):1892-1897)，攝入原花青素可提高血漿對氧化應(yīng)激的抵抗力。同時，酚類消除自由基的能力與化 學(xué)性質(zhì)和立體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)（Saint Cricq,Polyphenol profiles of Freeh eider apple varieties,Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999,47(12):4847-4853)〇
[0009] 本發(fā)明在實驗研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)在含有凝血酶的纖維蛋白原測定試劑中，添加 原花青素，可以制備出較好穩(wěn)定性的含有凝血酶的液態(tài)試劑，并用于纖維蛋白原的測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明以原花青素為主要研究對象，分析了原花青素對凝血酶蛋白反應(yīng)的影響， 提出在含有凝血酶的試劑中，添加原花青素，可以提升含凝血酶試劑的穩(wěn)定性。所得到的含 有凝血酶的試劑，可用于Clauss法測定纖維蛋白原。
[0011] 具體地，本發(fā)明采用原花青素用于穩(wěn)定液相蛋白質(zhì)，特別用于穩(wěn)定含有凝血酶的 纖維蛋白原測定試劑。
[0012] 所述的原花青素，用于穩(wěn)定纖維蛋白原測定試劑時，所述原花青素的加入量為質(zhì) 量體積比〇. 5-1.5%，最佳加入量為質(zhì)量體積比1.0%。
[0013] 所述的原花青素，當(dāng)用于纖維蛋白原測定試劑中時，不會降低凝血酶的酰胺活性 和蛋白活性，同時會穩(wěn)定含有凝血酶的乳濁相。
[0014] 一種纖維蛋白原測定試劑，包含凝血酶50-150U/mL、穩(wěn)定劑原花青素0.5-1.5%。
[0015] 所述的纖維蛋白原測定試劑，組分中還可以含有其它穩(wěn)定劑，包括α-丙氨酸、氯化 鈣、聚乙二醇、甘露醇、麥芽糖、山梨酸鉀中的一種或幾種。所述其它穩(wěn)定劑的加入量為α-丙 氨酸2-3%、氯化鈣8-110mM、聚乙二醇0.05-0.5%、甘露醇2-3%、麥芽糖1-2%、山梨酸鉀 0.5-1 %，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。
[0016] 所述的纖維蛋白原測定試劑，所述其它穩(wěn)定劑的加入量優(yōu)選為:α-丙氨酸1.5%、 氯化鈣9mM、聚乙二醇0.1%、甘露醇2.3%、麥芽糖1.6%、山梨酸鉀1 %，其中的百分比均為 質(zhì)量體積百分比。
[0017] 一種纖維蛋白原測定試劑，以20-50mM Tris緩沖液為溶劑，包含凝血酶50-150U/ mL、原花青素0.5-1.5%、α-丙氨酸2-3%、氯化鈣8-110mM、聚乙二醇0.05-0.5%、甘露醇2-3%、麥芽糖1-2%、山梨酸鉀0.5-1%，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。
[0018] 優(yōu)選地，一種纖維蛋白原測定試劑，以50mM Tris緩沖液為溶劑，包含凝血酶100U/ mL、原花青素1.0%、α-丙氨酸1.5%、氯化鈣9mM、聚乙二醇0.1 %、甘露醇2.3%、麥芽糖 1.6%、山梨酸鉀1%，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。
[0019] 所述的纖維蛋白原測定試劑，試劑的PH為7 ·卜7 · 4，最好為7 · 35。
[0020] 上