一種檢測早期胃癌的抗體芯片試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及芯片檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測早期胃癌的抗體芯片試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率高達(dá)40/10萬，僅次于肺癌，已經(jīng)躍居中國癌癥發(fā)病 率的第二位。在中國，每年新增胃癌患者達(dá)40萬人；占到全世界發(fā)病人數(shù)的42% ;患病率和 死亡率均是世界平均水平的兩倍多；近5年來19歲至35歲青年人胃癌的發(fā)病率比30年前 翻了一番。在世界范圍內(nèi)，胃癌也是最為常見的癌癥之一，具有很高的死亡率。因此，對胃 癌的診斷與治療在醫(yī)療領(lǐng)域是一個重大的工程。目前在胃癌的綜合治療方案中，手術(shù)占據(jù) 主導(dǎo)地位，早期胃癌手術(shù)5年后的生存率可達(dá)95%，可見胃癌的早前診斷對胃癌的治療及其 重要。然而，在中國對胃癌的早期診斷，并及時進(jìn)行手術(shù)治療所占的比例非常低，盡管中日 胃癌人群發(fā)病率相當(dāng)，但日本的早期胃癌發(fā)現(xiàn)率和手術(shù)率均已超過50%，中國該兩項數(shù)據(jù) 則均低于5%。由此可見，在中國對胃癌的早期診斷并及時進(jìn)行手術(shù)治療對胃癌的防治工程 具有重大意義。大量的研究已經(jīng)證實，在胃癌患者的早期，血清中有數(shù)種分子水平已經(jīng)發(fā)生 了明顯的變化，比如：CEA、CA199，CA72-4，PGI/PGII明顯上升。因此，通過對血清中這些分 子水平的定量檢查可以作為胃癌預(yù)測的一個有效手段。為了增加預(yù)測的敏感性和特異性， 將多個指標(biāo)聯(lián)合起來診斷是一個很好的辦法。比如聯(lián)合采用CEA、CA242、CA72-4可以提高 預(yù)測的敏感性和特異性。原來的芯片上的指標(biāo)都是比較經(jīng)典的指標(biāo)，新近又有兩個指標(biāo)通 過臨床驗證具有很好的診斷價值，比如：PGI、PGII。添加這兩個指標(biāo)更具有臨床價值。蛋 白芯片技術(shù)，可以在一個極小的微陣列內(nèi)同時檢測上百個指標(biāo)，具有檢測速度快、樣本用量 少、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，是用來開發(fā)這種多指標(biāo)同時檢測的最優(yōu)技術(shù)選擇。
[0003] 胃癌的早期的發(fā)現(xiàn)率低，主要與早期胃癌的癥狀不明顯以及目前市場上缺乏有效 的檢測手段有關(guān)。目前，臨床上胃癌的確診都要通過胃鏡來驗證。胃鏡檢查，不僅費用高， 而且對患者來講是及其痛苦的。因此，開發(fā)其它有效的檢測手段是及其必要的。血清學(xué)檢 測已經(jīng)成為臨床診斷的一個常規(guī)手段。而且，大量的研究證實，在早期的胃癌患者體內(nèi)相應(yīng) 的腫瘤標(biāo)志物的水平明顯上升。比如以下腫瘤標(biāo)志物：

所有的這些指標(biāo)已經(jīng)成為臨床檢測項目。然而，大量的回顧性研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單個指標(biāo) 的腫瘤標(biāo)志物對腫瘤的敏感性和特異性都是很低的，比如：通過多個指標(biāo)的聯(lián)合檢測可以 大大提高腫瘤檢測的敏感性和特異性。因此，開發(fā)一種可以同時檢測多個指標(biāo)的方法，避免 傳統(tǒng)單個指標(biāo)檢測方法樣本使用量大，檢測時間長的弊端是非常必要的。蛋白芯片可以在 一個小的方陣內(nèi)同時檢測多個指標(biāo)，因此為實現(xiàn)本目標(biāo)提供了一個極佳的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種高通量、高靈敏度、高特異性和低成本的早期胃癌檢 測試劑盒，具體為采用抗體芯片技術(shù)，能夠同時檢測5個胃癌腫瘤標(biāo)志物，克服了現(xiàn)有技術(shù) 操作繁瑣、檢測指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量 少、能在普通實驗室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點。
[0005] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 一種檢測早期胃癌的抗體芯片試劑盒，所述試劑盒由固相載體、洗滌液、稀釋液、檢測 抗體、熒光素-鏈霉親和素溶液、樣本處理液組成，其中，固相載體上固定多種胃癌標(biāo)志物 相關(guān)特異性抗體，所選特異性抗體是從35種腫瘤標(biāo)志物相關(guān)抗體中篩選得到；所述35種 胃癌腫瘤標(biāo)志物為：CEA，CA242, IL-lbeta，IL-6, CA72-4, IL-11，IL-8, IL-18, PGI，PGII， MCP1, MCP3, MCP4, CK19, VEGF, NGAL, RANTES, MMP1, MMP7, MMP9, TIMP-1, IGFBP2, TNF-alpha, GMCSF, VDBP, TTR, AEG-1, ADAM10, ADAM17, Nardilysin, ProApoAl, ApoAl, HCG beta, CA50, CA199〇
[0006] 作為優(yōu)選實施方式，所述固相載體上固定的多種胃癌標(biāo)志物相關(guān)特異性抗體選自 以下32種胃癌標(biāo)志物相關(guān)抗體中的多種或全部；CEA，CA242, IL-lbeta，IL-6, CA72-4， IL-8, IL-18, PGI, PGII, MCP1, MCP3, MCP4, CK19, VEGF, NGAL, RANTES, MMP1, MMP7, MMP9, TIMP-1, IGFBP2, TNF-alpha, GMCSF, VDBP, TTR, ADAM10, ADAM17, Nardilysin, ProApoAl, ApoAl，CA50, CA199。
[0007] 更優(yōu)選地，所述固相載體上固定5種胃癌標(biāo)志物相關(guān)特異性抗體，5種胃癌標(biāo)志物 相關(guān)特異性抗體為CEA、CA199，CA72-4, PGI，PGII蛋白之抗體。
[0008] 優(yōu)選地，所述固相載體由玻片，軟質(zhì)硅膠墊，硬質(zhì)框架，U形框夾形成反應(yīng)槽，硬質(zhì) 框架劃分為2X8或16X4個小孔，形成16或64孔框架。軟質(zhì)硅膠墊尺寸對應(yīng)于所述硬質(zhì)框 架以及標(biāo)準(zhǔn)玻片，硬質(zhì)框架的每個小格形成一個小的反應(yīng)槽，各個小的反應(yīng)槽里的標(biāo)準(zhǔn)玻 片結(jié)合有相應(yīng)濃度的特異性抗體。
[0009] 優(yōu)選地，所述胃癌標(biāo)志物的特異性抗體通過全自動點樣儀完成點樣操作，將特異 性抗體固定在載體上。
[0010] 更優(yōu)選地，所述全自動點樣儀點樣操作，包括以下步驟： 1)特異性抗體與含有1. 4至2 %酪蛋白的pH7. 4磷酸鹽緩沖液混合形成抗體混合物。
[0011] 2)于抗體混合物中將每個抗體含量以0. 01至2ng固定于所述點樣孔，每個抗體設(shè) 置2至4個重復(fù)孔。
[0012] 3)抗體芯片點陣排布于玻片，玻片每平方厘米點5至35種特異性抗體。各特異性 抗體的排布可以按照實驗設(shè)計需要進(jìn)行調(diào)整，根據(jù)不同的抗體芯片排布陣列，通過控制全 自動點樣儀，制備出所需要的中間產(chǎn)品。
[0013] 所述樣本處理液，用于裂解細(xì)胞沉淀物，包含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖 液。所用樣本可為血漿，血清，尿液，細(xì)胞培養(yǎng)物，組織。
[0014] 本發(fā)明所述檢測早期胃癌的芯片試劑盒，通過改良的夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定胃 癌腫瘤標(biāo)志物，所述的特異性抗體與樣品中的目標(biāo)抗原結(jié)合，經(jīng)過篩選的檢測抗體與目標(biāo) 抗原的另一區(qū)域結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物。本發(fā)明試劑盒能同時檢測5至35個胃癌相關(guān)抗 原蛋白。其中組合后的抗體芯片比采用單個腫瘤標(biāo)志物的檢測效果好。
[0015] 所述玻片還包括陽性對照孔和陰性對照孔；陽性對照孔為對應(yīng)特異性抗體的具有 相應(yīng)濃度的生物素化IgG抗體，每個反應(yīng)的生物素化的IgG抗體的濃度一致，以便于標(biāo)準(zhǔn)化 檢測；陰性對照孔為具有相應(yīng)濃度的生物素化的無關(guān)抗體，每個反應(yīng)的生物素化的無關(guān)抗 體的濃度一致，以便于標(biāo)準(zhǔn)化檢測。
[0016] 本發(fā)明所述試劑盒，利用熒光素作為檢測信號，通過比較未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣本的 信號來確定樣品中的目標(biāo)抗原的濃度。
[0017] 本發(fā)明所述試劑盒，利用Gen印ix Pro 6. 1軟件獲取芯片上所有點的信號強(qiáng)度，利 用自行開發(fā)的電子表格版的分析軟件計算每個蛋白的表達(dá)水平和標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用陽性對照 信號標(biāo)準(zhǔn)化，背景閾值設(shè)置對照組的平均強(qiáng)度加上2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)進(jìn)行統(tǒng)計，表達(dá)水平 高于背景加上2xSD的蛋白用于校正的T檢驗分析。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明采用的抗體芯片是多個夾心ELISA法同時進(jìn)行定量檢測的系統(tǒng)，它結(jié)合了 ELISA法高特異性和靈敏度及芯片高通量的優(yōu)勢。通過在玻片上固定多個特異性捕獲抗體， 一次實驗可定量檢測至少上千個蛋白，檢測樣品體積僅需50~100微升。利用熒光素作為檢 測信號，通過比較未知樣品和參考值的信號來確定樣品中的未知因子的含量，其結(jié)果具有 一致性和可靠性且節(jié)省時間和樣品量。
[0019] 本發(fā)明同時采用了玻片式抗體芯片平臺的優(yōu)勢。玻片式芯片是抗體預(yù)先固定在標(biāo) 準(zhǔn)大小的玻片上，并用16或64孔的框架形成的多通量的芯片。玻片式芯片與膜芯片相比 有以下優(yōu)點：首先多個陣列在同一個標(biāo)準(zhǔn)大小玻璃片上，通量大大增加，其次，所需樣品量 更少，約是膜芯片的十分之一。最后，可應(yīng)用于自動化操作，方便技術(shù)員一天完成幾百個芯 片的檢測工作。玻片式芯片制作成本較低，價格比膜芯片便宜約20%，適合于膜芯片的樣品 都可以用于玻片式芯片。玻片式芯片激光掃描儀來檢測突光信號，幾乎相同原理的掃描儀 都可以使用。玻片式芯片熒光信號可維持?jǐn)?shù)月，適用于蛋白濃度的定量分析。
【附圖說明】
[0020] 圖1固相載體結(jié)構(gòu)圖。
[0021] 圖2. 35種胃癌腫瘤標(biāo)志物相應(yīng)抗體點樣示意圖。
[0022] 圖3. 35種胃癌腫瘤標(biāo)志物相應(yīng)抗體包被芯片的檢測結(jié)果。
[0023] 圖 4.CEA，CA199，PGI，PGII，CA72-4 相應(yīng)抗體點樣示意圖。
[0024] 圖5.試劑盒CEA抗體與電化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性比較。
[0025] 圖6.試劑盒CA72-4抗體與電化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性比較。
[0026] 圖7.試劑盒CA199抗體與電化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性比