檢測食管癌的生物標志物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤標志物領域，涉及用于食管癌早期診斷的生物標志物，具體地，本 發(fā)明提供了可通過質譜檢測的特征多肽組合作為食管癌早期診斷的生物標志物。
【背景技術】
[0002] 食管癌是在全世界范圍內的第八大最常見的癌癥，按照與癌癥有關的致死原因排 序，食管癌排在第六位。盡管目前各國醫(yī)療科研機構對食管癌的診斷、治療的研究都有所進 展，但它的五年生存率平均只有15%，仍然缺乏可靠的診斷方法、早期檢測方法和有效的個 體化治療方案，并且預后效果差。據(jù)研究報導，處于早期階段的腫瘤，如果切除成功，會使食 管鱗狀細胞癌患者的5年總生存率超過90%，表明早期診斷和治療可降低病死率。目前用于 識別食管癌患者的生物標志物，在癌癥早期階段還缺乏足夠的靈敏度和特異性。
[0003] 目前食管癌的檢測仍然停留在臨床表征檢測水平，缺乏早期預警的技術手段。近 年來也出現(xiàn)了一些新型質譜檢測技術，如：中國專利申請200510075367、"一種在食管癌病 人血清中檢測腫瘤相關標志物的方法"公開了一種在食管癌病人血清中檢測腫瘤相關標志 物的方法，包括:蛋白免疫印跡證實Ku70蛋白為食管癌特異的腫瘤相關標志物，制備該標志 物的抗體，然后利用該標記物檢測病人血樣，并通過SDS-PAGE電泳，分離腫瘤特異表達的蛋 白條帶，進行電噴霧離子化偶聯(lián)在線離子阱質譜蛋白屬性鑒定，最終實現(xiàn)檢測目的。然而該 方法涉及免疫組織化學方法、電泳分離純化法，最終才進行質譜檢測，過程耗時費力，影響 了臨床檢測效果。
[0004] 中國專利申請201210479435、"一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒"則公開了另一 種質譜檢測技術，包括:將特定單克隆抗體結合到檢測載體上，吸附樣品中的待分析物，然 后收集待分析物進行質譜檢測。該方法仍然屬于傳統(tǒng)的免疫吸附分離聯(lián)合質譜檢測技術， 由于前期的分離過程過于傳統(tǒng)和復雜，涉及制備特定單抗和抗體/抗原的孵化結合等過程， 無法實現(xiàn)食管癌的早期、快速準確診斷和微量檢測的技術效果。
[0005] 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一 種新型的軟電離生物質譜，其原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激 光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質 子，從而使生物分子電離的過程。T0F的原理是離子在電場作用下加速飛過真空飛行管道， 根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同來檢測離子，即被檢測離子的質荷比(m/z)與該離子的飛 行時間成正比。盡管MALDI-T0F的準確度高達0.1 %~0.01%，遠遠高于目前常規(guī)應用的十 二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與高效液相色譜技術，但迄今為止尚無采用 MALDI-T0F-MS技術獲得檢測食管癌標志物或食管癌血清特征多肽的報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人基于質譜檢測技術，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了可用于食管癌診斷的生物 標志物，該生物標志物可靈敏、準確地診斷食管癌或評估罹患食管癌的風險，由此完成了本 發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明第一方面涉及生物標志物或生物標志物組合，其包括選自質荷比為1925.5 ±3·Om/z(例如±2·Om/z、± 1 ·Om/z、±0· 2m/z)、2950.6±3.Om/z(例如±2·Om/z、± 1 ·0m/ z、±0 · 3m/z)、5900·0±3 ·Om/z(例如±2·Om/z、± 1 .Om/z、±0·6m/z)的多肽中的一種、兩種 或三種，優(yōu)選地，
[0008] 所述質荷比為1925.5±3.〇111/2的多肽具有如下所示的序列：]\^卜617,31，31-Ser-Leu-Gly-Ser-Pr〇-Ser-Gly-Glu-Val-Ser-His-Pr〇-Arg-Lys-Thr(SEQ ID NO:1);
[0009] 所述質荷比為2950.6± 3. Om/z的多肽具有如下所示的序列：六811-六作-116-?1'〇-Glu-Ser-Gly-Gly-Asp-Asn-Ser-Val-Phe-Asp-Ile-Phe-G lu-Leu-Thr-Gly-Ala-Ala-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Arg(SEQ ID N0:2)；
[0010] 所述質荷比為5900.0±3. Om/z的多肽具有如下所示的序列 ：Ser-Ser-Ser-Tyr-Ser-Lys-Gln-Phe-Thr-Ser-Ser-Thr-Ser-Tyr-Asn-Arg-Gly-Asp-Ser-Thr-Phe-Glu-Ser-Lys-Ser-Tyr-Lys-Met-Ala-Asp-Glu-Ala-Gly-Ser-Glu-Ala-Asp-His-Glu-Gly-Thr-His-Ser-Thr-Lys-Arg-Gly-His-Ala-Lys-Ser-Arg-Pr〇-Val(SEQ ID N0:3)〇
[0011] 在本發(fā)明的實施方案中，所述生物標志物或生物標志物組合用于以下用途中的一 種或數(shù)種：1)評估食管癌的患病風險;2)食管癌的診斷；3)篩選治療食管癌的藥物;和4)評 估藥物對食管癌的治療效果。
[0012] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述食管癌為食管鱗狀細胞癌，例如為早期食管鱗 狀細胞癌，例如為TNM分期I期食管鱗狀細胞癌。
[0013] 本發(fā)明第二方面涉及試劑組合物，其含有用于檢測本發(fā)明第一方面任一項的生物 標志物或生物標志物組合的試劑。
[0014] 在本發(fā)明中，所述用于檢測本發(fā)明第一方面任一項的生物標志物或生物標志物組 合的試劑為本領域所公知，或者可以根據(jù)本領域的技術常識制備得到，例如可以為能夠與 所述的生物標志物特異性結合的抗體或配體。
[0015] 本發(fā)明第三方面涉及試劑盒，其含有本發(fā)明第一方面任一項的生物標志物或生物 標志物組合或第二方面任一項的試劑組合物。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述生物標志物或生物標志物組合可以作為標準 品。
[0017] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其還含有用于質譜檢測本發(fā)明第一方面任一項的 生物標志物或生物標志物組合的試劑。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述用于質譜檢測本發(fā)明第一方面任一項的生 物標志物或生物標志物組合的試劑包括能夠和多肽結合的物質，例如弱陽離子磁珠或弱陽 離子交換柱，以及任選的緩沖液、洗滌液和洗脫液。
[0019] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，其中所述的能夠和多肽結合的物質為弱陽離子 磁珠;所述磁珠可以使用市售的，例如美國Bruker公司的WCX2磁珠試劑盒，或者申請人研制 的SPE-C磁珠試劑盒（專利號ZL2008101879684)。
[0020] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其還含有本發(fā)明第一方面任一項的生物標志物或生 物標志物組合的標準數(shù)據(jù)庫(例如食管癌患者的標準數(shù)據(jù)庫）的軟件或芯片，可用于待測樣 品進行質譜時提供標準數(shù)據(jù)或標準曲線的比對，以判斷待測樣品中所述的生物標志物或其 組合的有無或含量。
[0021] 本發(fā)明第四方面涉及試劑盒，其含有說明書，所述說明書記載了該試劑盒的用途 以及使用方法，
[0022] 所述用途選自以下用途中的一種或數(shù)種：1)評估食管癌的患病風險;2)食管癌的 診斷;3)篩選治療食管癌的藥物;和4)評估藥物對食管癌的治療效果；
[0023]所述使用方法包括利用質譜檢測選自以下質荷比為1925.5± 3.0m/z(例如土 2 · Om/z、± 1 · Om/z、± 0 · 2m/z)、2950.6±3. Om/z (例如 ± 2 · Om/z、± 1 · Om/z、± 0 · 3m/z)、 5900 · 0±3 · Om/z(例如±2 · Om/z、± 1 · Om/z、±0 · 6m/z)的多肽中的一種、兩種或三種的步 驟。
[0024] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述試劑盒還含有含有本發(fā)明第一方面任一項的生 物標志物或生物標志物組合或第二方面任一項的試劑組合物。
[0025] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述生物標志物或生物標志物組合可以作為標準 品。
[0026] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其還含有用于質譜檢測本發(fā)明第一方面任一項的生 物標志物或生物標志物組合的試劑。
[0027] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述用于質譜檢測本發(fā)明第一方面任一項的生 物標志物或生物標志物組合的試劑包括能夠和多肽結合的物質，例如弱陽離子磁珠或弱陽 離子交換柱，以及任選的緩沖液、洗滌液和洗脫液。
[0028] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，其中所述的能夠和多肽結合的物質為弱陽離子 磁珠;所述磁珠可以使用市售的，例如美國Bruker公司的WCX2磁珠試劑盒，或者申請人研制 的SPE-C磁珠試劑盒（專利號ZL2008101879684)。
[0029] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其還含有本發(fā)明第一方面任一項的生物標志物或生 物標志物組合的標準數(shù)據(jù)庫(例如食管癌患者的標準數(shù)據(jù)庫）的軟件或芯片，可用于待測樣 品進行質譜時提供標準數(shù)據(jù)或標準曲線的比對，以判斷待測樣品中所述的生物標志物或其 組合的有無或含量。
[0030] 本發(fā)明第五方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的生物標志物或生物標志物組合、或 者第二方面任一項的試劑組合物在制備產品中的用途，所述產品通過對受試者待測樣品的