檢測洛克沙胂的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測洛克沙胂的酶聯(lián)免疫試劑 盒，其適用于飼料（原料、配合料、濃縮料）中洛克沙胂測定。 技術(shù)背景
[0002] 有機(jī)胂制劑作為飼料添加劑，在世界備廣泛應(yīng)用于禽類促生長，在禽畜養(yǎng)殖中取 得了相當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)效益。目前我國及美國藥品與食品管理局（FDA)等批準(zhǔn)使用的有機(jī)胂制劑 主要有洛克沙胂和阿散酸。以洛克沙胂使用較多。它們都具有廣譜殺菌作用，對腸道寄生 蟲也有抑制和殺滅作用.還可使毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，主要作用于腸道，改善腸道的理化環(huán) 境。具有類似抗生素的作用.對豬能促進(jìn)生長。提高飼料利用率，使其皮膚紅潤，毛發(fā)光 亮，防止腹瀉；對雞可促進(jìn)生長、提高飼料報(bào)酬和產(chǎn)蛋率，增進(jìn)卵黃色素沉著，防止球蟲病和 大腦桿菌病的產(chǎn)生。因此，對動(dòng)物有一定的促生長和改善產(chǎn)品外觀作用。
[0003] 含砷坷料添加斜的使用，促進(jìn)了畜牧業(yè)的發(fā)屐，取得了較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)教益。但有 機(jī)胂飼料添加劑在動(dòng)物體內(nèi)吸收較少，大多數(shù)隨著禽糞便直接排出但有機(jī)胂飼料添加劑在 動(dòng)物體內(nèi)吸收較少，大多數(shù)隨著禽糞便直接排出.且前我國大多數(shù)的畜禽糞便未經(jīng)過無害 化處理。大量含胂的畜排泄物進(jìn)入環(huán)境，對環(huán)境造戊了污染。在生態(tài)環(huán)境日趨惡化的今天， 人們越來越關(guān)注含胂飼料添加劑隨畜禽排泄物進(jìn)入環(huán)境后在環(huán)境中的降解、轉(zhuǎn)化，遷移、歸 趨以及對壞境生物造成的影響。胂制劑的環(huán)境污染問題，已逐漸成為有胂制劑研究的重點(diǎn)， 并在國際上形成新的研究熱點(diǎn)，在我國在這方面研究目前處于起步階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于洛克沙胂含量測定的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡 單，適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。
[0005] 本發(fā)明試劑盒，它包括： (1) 包被有洛克沙胂偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板； (2) 洛克沙腫標(biāo)準(zhǔn)品洛液； (3) 濃縮酶結(jié)合物； (4) 酶結(jié)合物稀釋液； (5) 底物顯色液； (6) 終止液。
[0006] 所述洛克沙胂偶聯(lián)抗原為洛克沙胂半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述載體蛋白可 為卵清蛋白、牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。
[0007] 所述洛克沙胂半抗原制備過程： 1)取20mg洛克沙胂，10ul，1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2ml Ν，Ν' -二甲基甲酰胺中，得到I液； 2)取20mg Ν，Ν' -二環(huán)己基碳二亞胺溶解于0. 5mlDMF中，得到II液； 3)在0°C條件下，將II液緩慢滴加至I液中，恢復(fù)室溫后，繼續(xù)反應(yīng)20 h ; 4)蒸除溶劑，柱層析（洗脫液：二氯甲烷/甲醇，體積比20 :1)，得到洛克沙胂半抗原。
[0008] 所述濃縮酶結(jié)合物為酶標(biāo)記的洛克沙胂單克隆抗體，所述標(biāo)記酶為辣根過氧化物 酶；酶結(jié)合物是采用過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。
[0009] 為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品溶液、 酶結(jié)合物稀釋液、底物顯色液、終止液。
[0010] 所述的終止液為l~2mol/L的硫酸或鹽酸溶液，所述底物顯色液由底物液A液和底 物液B液組成，底物液A液為過氧化脲溶液，底物液B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液。
[0011] 所述的酶結(jié)合物稀釋液為PH7. 2~7. 4,0. 5%~1%牛血清白蛋白，0. lmol/L的磷酸鹽 緩沖液，所述百分比為重量百分比。
[0012] 其中酶標(biāo)板在制各過程中所用的包被緩沖液為pH9. 6,0. lmol/L碳酸鹽緩沖液， 所用封閉液為PH7. 2~7. 4,0. 5%~1%牛血清白蛋白，0. lmol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分 比為重量百分比。
[0013] 本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成0. 1~0. 2ug/ml，每 孔加入100 ul，37°C溫育2h或4°C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然 后在每孔中加入15(T200ul封閉液，37°C溫育l~2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空 密封保存。
[0014] 本發(fā)明的檢測原理為： 當(dāng)在微孔條上預(yù)包被洛克沙胂偶聯(lián)抗原，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，樣本中殘留 的洛克沙胂與酶標(biāo)板上預(yù)包被的洛克沙胂偶聯(lián)抗原競爭洛克沙胂的酶結(jié)合物，用底物顯色 液顯色，樣本吸光值與所含洛克沙胂的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中洛 克沙胂的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的 比較可粗略判斷樣品中洛克沙胂的濃度范圍。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒洛克沙胂的方法，它包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試劑盒進(jìn)行檢測； (3) 分析檢測結(jié)果。
[0016] 本發(fā)明檢測洛克沙胂的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用競爭ELISA方法檢測樣品中洛 克沙胂的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批量樣 品，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、準(zhǔn)確度 高、精確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，攜帶便利、使用方便、結(jié)構(gòu)簡單、檢測方法 快速、簡便、適于大批量樣品篩選。
【附圖說明】
[0017] 圖1為試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范闈。
[0019] 實(shí)施例1試劑盒組分的制備 1、洛克沙胂半抗原制各 1) 取20mg洛克沙胂，10ul，1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2mlN，Ν' -二 甲基甲酰胺中，得到I液； 2) 取20mg Ν，Ν' -二環(huán)己基碳二亞胺溶解于0. 5mlDMF中，得到II液； 3) 在0°C條件下，將II液緩慢滴加至I液中，恢復(fù)室溫后，繼續(xù)反應(yīng)20 h ; 4) 蒸除溶劑，柱層析（洗脫液：二氯甲烷/甲醇，體積比20 :1)，得到洛克沙胂半抗原， 如圖1。
[0020] 2、抗原的制備 免疫原制備--洛克沙胂半抗原與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0021 ] 1)取洛克沙胂半抗原5. 3mg用0. 5ml DMF溶解，得到I液； 2) 取BSA 30mg用2. 0ml，ρΗ7· 0,0· lmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，得到II液； 3) 取碳化二業(yè)胺（EDC) 10mg用0. 5ml，pH7. 0,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，得到III 液： 4) 將I液與II液混合，在攪拌下緩慢滴加入III液，室溫反應(yīng)2小時(shí)，4°C透析二天， 每天換液三次，得到免疫原。
[0022] 包被原制備--洛克沙胂半抗原與卵清蛋白（0VA)偶聯(lián)得到包被原。
[0023] 1)取洛克沙胂半抗原5. 3mg用0· 5ml DMF溶解，得到I液； 2) 取OVA 18mg用2. 0ml，pH7. 0,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，得到II液； 3) 取EDClOmg用0· 5ml，ρΗ7· 0,0· lmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，得到III液： 4) 將I液與II液混合，在攪拌下緩慢滴加入III液，室混反應(yīng)2小時(shí)，4°C透析二天，每 天換液三次，得到包被原。
[0024] 3、洛克沙胂單克隆抗體的制備 a.動(dòng)物免疫 將上述步驟得到的免疫抗原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑最為150ug/只，使其產(chǎn)生 抗血清。
[0025] b.細(xì)胞融合和克隆化 取免疫Bal b/c小鼠脾細(xì)胞，按9:1 (數(shù)最配比）比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合篩選得 到穩(wěn)定分泌赭洛克沙胂單克隆抗體的洛克沙胂單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0026] c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1X 1 〇9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí) 取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0027] d.單克隆抗體的制各與純化 增量培養(yǎng)法：將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸一飽 和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體