可用于診斷間日瘧和/或惡性瘧的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及可用于檢測(cè)間日瘧原蟲感染和/ 或惡性瘧原蟲感染的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾仍然是全球公共衛(wèi)生的緊要問(wèn)題，每年死亡達(dá)0. 7 - 2. 7百萬(wàn)，其中75%以上 為非洲兒童。在過(guò)去的35年，瘧疾的發(fā)病率增長(zhǎng)了 2 - 3倍。在1955年，世界衛(wèi)生組織 (WHO)開始了一項(xiàng)通過(guò)應(yīng)用氯喹進(jìn)行臨床治療和應(yīng)用DDT (二氯二苯三氯乙烷)控制蚊群而 根除瘧疾的宏大計(jì)劃。在20世紀(jì)60年代后期逐步停止，這項(xiàng)計(jì)劃雖然在全世界許多國(guó)家 引起重要且持續(xù)的疾病負(fù)擔(dān)減輕。然而，在許多國(guó)家瘧疾仍有復(fù)發(fā)，其主要是由于耐藥寄生 蟲的出現(xiàn)和傳播導(dǎo)致的。耐殺蟲劑蚊子的出現(xiàn)，人口密度的增加（自1963年，世界人口已經(jīng) 翻了一番)，全球變暖(這種帶菌者擴(kuò)散至以前沒(méi)有到達(dá)的范圍)，持續(xù)貧窮，政治動(dòng)蕩，以及 由于傳染性疾病導(dǎo)致的生產(chǎn)力的損失，所有的這些因素破壞了治療和控制瘧疾的穩(wěn)定的公 共衛(wèi)生基礎(chǔ)的維持。
[0003] 瘧疾寄生蟲屬于瘧原蟲屬，能后感染許多脊椎動(dòng)物宿主，包括多種非人類靈長(zhǎng)類 物種。四種痕原蟲屬寄生于人類：惡性痕原蟲（Plasmodium, falciparum)、 三日 痕原蟲 （P. malariae)、 卵形 痕原蟲 （P. ovale) 和 間日痕 原蟲 (P. vivax)。其中，惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲分別與大部分瘧疾的發(fā)病率和死亡率相關(guān)。
[0004] 由于瘧疾治療藥物的特殊性，精確快速的診斷不僅能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療瘧疾患者， 大大降低病死率，也能通過(guò)早期排除瘧疾，及時(shí)挽救感染了其它傳染性疾病患者的生命。以 此同時(shí)，精確快速的早期診斷也是對(duì)瘧疾實(shí)時(shí)流行病監(jiān)測(cè)和控制的必要手段。到目前為止， 對(duì)可疑病人采血制作厚薄血片經(jīng)染色后顯微鏡檢查法(簡(jiǎn)稱鏡檢法）一直被認(rèn)為是瘧疾診 斷的"金標(biāo)準(zhǔn)"，其優(yōu)點(diǎn)是費(fèi)用低，能鑒定瘧原蟲蟲種，但是也存在著缺陷，即需要非常專業(yè) 的檢驗(yàn)人員，當(dāng)原蟲密度較低時(shí)，可出現(xiàn)假陰性，引起誤診或漏診，同時(shí)還需要顯微鏡、染色 液等一些輔助設(shè)備。隨著臨床機(jī)構(gòu)，特別是一些現(xiàn)代化程度高的醫(yī)院，由于檢驗(yàn)人員更依賴 儀器設(shè)備，對(duì)鏡檢能力的掌握明顯下降；而在一些欠發(fā)達(dá)地區(qū)，由于種種原因，未能配備鏡 檢相關(guān)的設(shè)備和試劑。這些因素限制了臨床對(duì)瘧疾快速有效的診斷。因此，研究新的瘧疾 快速診斷方法成為目前研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供新的用于診斷瘧疾，特別是可用于診斷間日瘧、惡性瘧或 混合瘧，或者用于區(qū)分間日瘧、惡性瘧與混合瘧的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明人提供了 5條多肽。在以受試者來(lái)源的生物樣本是否對(duì)所述5條多肽中的 至少兩條或兩條以上有響應(yīng)作為判定受試者是否已被瘧原蟲感染的指標(biāo)的情況下，可以以 高達(dá)98%的靈敏度（且假陽(yáng)性率低至1. 0%)診斷瘧疾。
[0007] 此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將上述5條多肽與其他2條多肽的組合作為檢測(cè)分 子，不僅能夠診斷瘧疾，還能進(jìn)一步診斷間日瘧、惡性瘧或混合瘧，或者用于區(qū)分間日瘧、 惡性瘧與混合瘧。
[0008] 因此，本發(fā)明包括： 1. 一種試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)固體載體，以及獨(dú)立地連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體 載體上的下述多肽集合1 : SEQ ID N0 :1所示的多肽； SEQ ID N0 :2所示的多肽； SEQ ID N0 :3所示的多肽； SEQ ID N0 :4所示的多肽；和 SEQ ID N0 :5所示的多肽。
[0009] 2.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其用于診斷瘧疾。
[0010] 3.根據(jù)項(xiàng)1或2所述的試劑盒，其中，所述多肽集合1還包括下述多肽集合2 : SEQ ID N0 :6所示的多肽；和 SEQ ID N0 :7所示的多肽。
[0011] 4.根據(jù)項(xiàng)3所述的試劑盒，其用于診斷間日瘧、惡性瘧或混合瘧，或者用于區(qū)分 間日瘧、惡性瘧與混合瘧。
[0012] 5.根據(jù)項(xiàng)1~4中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，全部多肽獨(dú)立地連接于同一固體載 體上。
[0013] 6.下述多肽集合1在制備用于診斷瘧疾的試劑盒中的用途： 多肽集合1 SEQ ID N0 :1所示的多肽； SEQ ID N0 :2所示的多肽； SEQ ID N0 :3所示的多肽； SEQ ID N0 :4所示的多肽；和 SEQ ID N0 :5所示的多肽。
[0014] 7.根據(jù)項(xiàng)6所述的用途，其中，所述診斷瘧疾還包括診斷間日瘧、惡性瘧或混合 瘧，或者用于區(qū)分間日瘧、惡性瘧與混合瘧，且所述多肽集合1還包括下述多肽集合2 : SEQ ID N0 :6所示的多肽；和 SEQ ID N0 :7所示的多肽。
[0015] 發(fā)明的【具體實(shí)施方式】 多狀集合和多狀鉬 本說(shuō)明書中，多肽集合1是下述多肽組1飛的全部： 多肽組1 :SEQ ID N0 :1所示的多肽； 多肽組2 :SEQ ID N0 :2所示的多肽； 多肽組3 :SEQ ID N0 :3所示的多肽； 多肽組4 :SEQ ID N0 :4所示的多肽；以及 多肽組5 :SEQ ID N0 :5所示的多肽。
[0016] 本說(shuō)明書中，靈敏度是指：用"金標(biāo)準(zhǔn)"方法確認(rèn)的陽(yáng)性樣本中，被其他方法測(cè)定為 陽(yáng)性樣本的比例。假陽(yáng)性率是指：用"金標(biāo)準(zhǔn)"方法確認(rèn)的陰性樣本中，被其他方法測(cè)定為 陽(yáng)性樣本的比例。本技術(shù)領(lǐng)域檢測(cè)間日瘧原蟲感染或惡性瘧原蟲感染的"金標(biāo)準(zhǔn)"方法是 鏡檢法。
[0017] 本說(shuō)明書中，"瘧疾"是指惡性瘧和/或間日瘧。惡性瘧是指因惡性瘧原蟲感染而 引起的瘧疾，間日瘧是指因間日瘧原蟲感染而引起的瘧疾，混合瘧是指因惡性瘧原蟲和間 日瘧原蟲感染(也稱混合感染）而引起的瘧疾。
[0018] 優(yōu)選地，多肽集合1是在所述多肽組1飛的全部的基礎(chǔ)上再加上下述多肽組6~7 : 多肽組6 :SEQ ID N0 :6所示的多肽；以及 多肽組7 :SEQ ID N0 :7所示的多肽。
[0019] 如實(shí)施例所示，所述多肽集合1對(duì)惡性瘧原蟲和/或瘧原蟲感染者的血清呈陽(yáng)性 反應(yīng)，而對(duì)健康正常人或非惡性瘧原蟲和/或間日瘧原蟲感染者的血清呈陰性反應(yīng)，因此， 所述多肽集合1作為瘧原蟲感染的檢測(cè)工具是有用的。
[0020] 本說(shuō)明書中，陽(yáng)性反應(yīng)是指：滿足下述"診斷方法"部分中所列的判據(jù)；否則為陰 性反應(yīng)。
[0021] 所述多肽可以適宜采用（1)化學(xué)合成方法、或（2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來(lái) 獲得，其中化學(xué)合成更為簡(jiǎn)便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過(guò)使用肽合成儀合成或 者半合成該多肽來(lái)進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成 的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣 的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。
[0022] 此外，在通過(guò)酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國(guó)際公開小冊(cè)子 W02004/011653號(hào)所述的方法。即，可以這樣來(lái)生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸（例如羧基保護(hù)的 氨基酸）在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出： 具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體 處理物、或該微生物來(lái)源的肽合成酶。
[0023] 特別是多肽的化學(xué)合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，可以容易地委托專業(yè)的多肽合成公司 來(lái)合成所述多肽。
[0024] 試劑盒 本發(fā)明