一種應(yīng)用淡水發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)稀土尾礦庫(kù)周邊地下水污染急性毒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染檢測(cè)和評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用淡水發(fā)光細(xì)菌檢測(cè) 稀土尾礦庫(kù)周邊地下水污染急性毒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中，污染物的種類和濃度一般采用各種儀器與化學(xué)分析手段 可以比較快速而靈敏地分析測(cè)定出來，但大部分測(cè)定項(xiàng)目或參數(shù)還需定期采樣。因而只能 反映采樣瞬時(shí)的污染物濃度，不能反映環(huán)境已經(jīng)發(fā)生的變化。而生物監(jiān)測(cè)是20世紀(jì)初在一 些國(guó)家開展起來，近些年在水污染的生物監(jiān)測(cè)成為活躍的研究領(lǐng)域。生物監(jiān)測(cè)是從生物學(xué) 角度出發(fā)對(duì)環(huán)境質(zhì)量的檢測(cè)和評(píng)價(jià)依據(jù)，其可以通過生物個(gè)體、種群或群落對(duì)環(huán)境污染或 變化所產(chǎn)生的響應(yīng)及時(shí)反映污染物的綜合毒性效應(yīng)及可能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的潛在危害。在實(shí)際 環(huán)境中，環(huán)境污染通常不僅是由單一污染物引起，而是由多種污染物同事存在形成的復(fù)合 污染。生物監(jiān)測(cè)則可以更真實(shí)、更直接地反映出多種污染物在自然條件下對(duì)生物的綜合影 響，從而更客觀、更全面地評(píng)價(jià)各種環(huán)境狀況。此外，生物監(jiān)測(cè)能連續(xù)監(jiān)測(cè)污染史，成本低廉 簡(jiǎn)單易行，可以靈敏簡(jiǎn)便地反映長(zhǎng)期的污染效果。目前生物監(jiān)測(cè)主要應(yīng)用于地表水體，飲用 水，河流、湖泊沉積物，大氣，土壤等的檢測(cè)，鮮見針對(duì)稀土尾礦庫(kù)周邊地下水的污染檢測(cè)及 相關(guān)研究。稀土尾礦庫(kù)周邊地下水屬于靜態(tài)水，循環(huán)更新周期長(zhǎng)，水質(zhì)參數(shù)變化慢，一旦污 染很難恢復(fù)，取出后水質(zhì)狀況容易發(fā)生改變，長(zhǎng)期儲(chǔ)存會(huì)使水質(zhì)真實(shí)性受到影響。由于地下 水地質(zhì)作用可以沖刷、溶蝕和搬運(yùn)沉積物或巖石，破壞顆粒間的結(jié)合力，侵蝕巖石，并將侵 蝕產(chǎn)物搬運(yùn)，所以與土壤，地表水等相比，該區(qū)域地下水含有更多的金屬、氯、硫酸根和碳酸 氫根等離子。同時(shí)在稀土尾礦庫(kù)周邊地下水，往往還會(huì)由于尾礦庫(kù)污染物泄露、污染物地表 徑流、降水等原因而遭到不同程度污染，特別是一些放射性稀土元素可能進(jìn)入地下水系統(tǒng)， 使環(huán)境情況相比地表水尤為復(fù)雜，這方面的生物監(jiān)測(cè)工作研究起步較晚，所以我國(guó)目前監(jiān) 測(cè)領(lǐng)域針對(duì)該區(qū)域地下水開展的生物監(jiān)測(cè)工作十分有限。
[0003] 目前現(xiàn)有的國(guó)標(biāo)水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法僅適用于工業(yè)廢水、耐污水體及 實(shí)驗(yàn)室條件下可溶性化學(xué)物質(zhì)的水質(zhì)急性毒性監(jiān)測(cè)，應(yīng)用于稀土尾礦庫(kù)區(qū)地下水污染監(jiān)測(cè) 還有一定的局限性和較大的不確定性。國(guó)標(biāo)方法中采用明亮發(fā)光桿菌發(fā)光強(qiáng)度來響應(yīng)環(huán)境 污染程度，明亮發(fā)光桿菌是一種海洋發(fā)光細(xì)菌，高度適應(yīng)海洋生態(tài)環(huán)境，只有在鹽度3 %，及 豐富的鈉離子存在時(shí)才能良好生長(zhǎng)和發(fā)光。所以檢測(cè)土壤、湖泊河流或地下水等時(shí)必須要 滿足他們對(duì)鹽度和鈉離子存在的需求，所得結(jié)果才比較可靠。然而，過多的鈉離子或氯離子 均可能影響某些物質(zhì)生物學(xué)毒性的表現(xiàn)。并且國(guó)標(biāo)測(cè)定方法選用HgCl 2作為參比毒物，毒性 較強(qiáng)，使用后排入環(huán)境對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康危害較嚴(yán)重。此外，國(guó)標(biāo)法或者已報(bào)道的其他 參考方法在測(cè)定水體毒性時(shí)未考慮水質(zhì)濁度的影響，會(huì)造成結(jié)果的偏差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。 因此，需要開發(fā)一種簡(jiǎn)單快速檢測(cè)稀土尾礦庫(kù)周邊地下水污染狀況的急性毒性測(cè)試方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種采用淡水發(fā)光細(xì)菌青?；【槍?duì)稀土尾礦庫(kù)周邊污 染的地下水污染急性毒性測(cè)試的方法，克服以往生物監(jiān)測(cè)方法的缺陷與不足，減少傳統(tǒng)方 法各種因素帶來的可能影響，使檢測(cè)結(jié)果更可靠。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，應(yīng)用淡水發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)稀土尾礦庫(kù)周邊地下水污染急性毒性的 方法，其特征在于，所述淡水發(fā)光菌為青?；【鶴67。
[0006] 進(jìn)一步，步驟為，
[0007] 將待檢樣品處理并稀釋、調(diào)pH值；
[0008] 將活化后的青?；【鶴67菌液加入到待檢樣品中進(jìn)行反應(yīng)；同時(shí)用所述稀釋所用 的稀釋液代替待檢樣品作為對(duì)照；
[0009] 設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)參比毒物ZnS〇4,用所述稀釋液稀釋成不同濃度的ZnS〇4溶液，測(cè)定相應(yīng)的 發(fā)光強(qiáng)度;采用origin 9.0軟件對(duì)ZnS〇4濃度與發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行非線性擬合，建立劑量-效應(yīng) 曲線擬合方程；
[0010] 采用生物發(fā)光測(cè)定儀檢測(cè)待檢樣品和對(duì)照的發(fā)光強(qiáng)度RLU;
[0011]計(jì)算相對(duì)抑制率，并將相對(duì)抑制率代入劑量-效應(yīng)曲線擬合方程，求出與樣品急性 毒性相當(dāng)?shù)膶?duì)應(yīng)的ZnS04的濃度，判定毒性效應(yīng)。
[0012]進(jìn)一步，所述待檢樣品的處理為將樣品進(jìn)行過濾或沉淀，使其池度小于300NTU。 [0013] 進(jìn)一步，所述稀釋是指用0.85wt%NaCl溶液來稀釋，使檢測(cè)的發(fā)光強(qiáng)度RLU為200-600萬即可。具體的，本發(fā)明的稀釋是用0.85wt%NaCl來稀釋，稀釋的合適程度通過檢測(cè)發(fā) 光強(qiáng)度(200-600萬）來調(diào)整控制。發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)是將100ul合適稀釋的待檢樣品與900ul 的0.85wt%NaCl溶液混合，生成lOOOul的反應(yīng)體系在發(fā)光儀中檢測(cè)，讀取發(fā)光強(qiáng)度。
[0014]進(jìn)一步，所述調(diào)pH值為用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)pH值在6-9范圍內(nèi)。
[0015] 進(jìn)一步，所述反應(yīng)為常溫反應(yīng)15-30min;優(yōu)選的，常溫反應(yīng)20min。
[0016] 進(jìn)一步，所述標(biāo)準(zhǔn)參比毒物ZnS04是用于建立劑量-效應(yīng)曲線擬合方程；用稀釋液 將ZnS04稀釋成不同濃度的溶液，檢測(cè)相應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，建立并檢驗(yàn)參比毒物稀釋濃度與其 相對(duì)抑制率的劑量-效應(yīng)擬合曲線。
[0017] 進(jìn)一步，所述相對(duì)抑制率計(jì)算所采用的公式為，
[0018] 相對(duì)抑制率(R，％ ) = (1 -樣品的RLU/對(duì)照的RLU) X 100;
[0019]所述根據(jù)結(jié)果判定毒性效應(yīng)為：
[0020] 檢測(cè)樣品對(duì)應(yīng)ZnS〇4的濃度C<1.0mg/L時(shí)，判定為無毒；
[0021 ] 對(duì)應(yīng)ZnSCU的濃度1.0mg/L < C<1.6mg/L時(shí)，判定為輕微毒性；
[0022] 對(duì)應(yīng)ZnS〇4的濃度1.6mg/L < C<2.7mg/L時(shí)，判定為中等毒性；
[0023] 對(duì)應(yīng)ZnS〇4的濃度2.7mg/L < C<5.2mg/L時(shí)，判定為強(qiáng)毒性；
[0024] 對(duì)應(yīng)ZnS〇4的濃度C2 5.2mg/L時(shí)，判定為超強(qiáng)毒性。
[0025]本發(fā)明通過對(duì)淡水發(fā)光菌檢測(cè)條件優(yōu)化，以及對(duì)稀土金屬冶選尾礦庫(kù)周邊地下水 的毒性綜合響應(yīng)加以實(shí)際驗(yàn)證，形成了快速、靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)稀土尾礦庫(kù)周邊地下水污染 的測(cè)試體系，便于推廣應(yīng)用。同時(shí)采用淡水發(fā)光菌青海弧菌作為測(cè)試菌種，避免了海洋發(fā)光 菌所需鹽度對(duì)發(fā)光的影響。測(cè)試快速方便，反應(yīng)時(shí)間僅需20min，對(duì)樣品pH值的要求比較廣， 在6-9之間即可，樣品濁度低于300NTU不需進(jìn)行過濾處理，樣品稀釋液選用0.85%NaCl溶 液，配制簡(jiǎn)便省時(shí)，參比毒物為ZnS〇4，減少了對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康的影響。
[0026] 本發(fā)明廣泛適用于尾礦庫(kù)周邊地下水污染的檢測(cè)。
[0027] 本發(fā)明淡水發(fā)光細(xì)菌測(cè)試條件優(yōu)化為:最佳反應(yīng)時(shí)間為20min;測(cè)試用pH值控制在 6-9之間；稀釋液選擇0.85%NaCl;樣品濁度控制在300NTU以下，不需要進(jìn)行過濾處理;標(biāo)準(zhǔn) 參比毒物為ZnS〇4。
【附圖說明】
[0028] 圖1是不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)試發(fā)光強(qiáng)度的影響圖。
[0029] 圖2是不同pH值對(duì)樣品測(cè)試相對(duì)抑制率的影響圖。
[0030] 圖3是發(fā)光細(xì)菌對(duì)不同pH值的GW-7樣品的相對(duì)抑制率的響應(yīng)圖。
[0031 ]圖4是不同稀釋液對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響圖。
[0032]圖5是樣品不同濁度對(duì)青?；【鄬?duì)抑制率的影響圖。
[0033]圖6為函數(shù)擬合不同濃度的ZnS〇4(l)對(duì)發(fā)光菌相對(duì)抑制率的劑量-效應(yīng)曲線圖。 [0034]圖7為函數(shù)擬合不同濃度的MnCl2(2)對(duì)發(fā)光菌相對(duì)抑制率的劑量-效應(yīng)曲線圖。 [0035]圖8為函數(shù)擬合不同濃度的AgN0 3(3)對(duì)發(fā)光菌相對(duì)抑制率的劑量-效應(yīng)曲線圖。 [0036]圖9為原位稀土尾礦庫(kù)17個(gè)地下水樣品對(duì)青海孤菌相對(duì)抑制率的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明 書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0038] 菌種活化:將裝有青?；【?67(￥11^1〇.011111 &以1^&067)凍干粉(購(gòu)于北京濱松 光子學(xué)商貿(mào)（中國(guó)）有限公司）的安瓿瓶先置于室溫內(nèi)約l〇_15min，在超凈工作臺(tái)中切開安 瓿瓶，取已滅菌的〇.85wt%NaCl溶液100yL點(diǎn)在培養(yǎng)皿平板上，用接種環(huán)取一環(huán)菌種蘸取點(diǎn) 的溶液在平板上劃線，倒置放于恒溫培養(yǎng)箱中于22°C培養(yǎng)24h。
[0039] 新鮮菌液制備：挑取單個(gè)菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于22°C培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接于斜 面，活化為第3代菌種;將培養(yǎng)好的第3代菌種接種到15mL液體培養(yǎng)基中22°C振蕩培養(yǎng)16-18h(處于對(duì)數(shù)期），待用。
[0040] 待測(cè)樣品：以不同濃度的Na2S04溶液作為受硫酸鹽污染的地下水樣品。
[0041 ]液體培養(yǎng)基:淡水發(fā)光細(xì)菌Q67培養(yǎng)基成分見表1。
[0042] 表1.發(fā)光細(xì)菌Q67培養(yǎng)基配方表
[0044] 檢測(cè)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度:打開生物發(fā)光測(cè)定儀(BERTHOD LB9501發(fā)光儀，德國(guó)），預(yù) 熱15min，調(diào)零，備用。取適量體積的已滅菌0.85wt %NaCl溶液，調(diào)整菌液濃度，測(cè)其發(fā)光強(qiáng) 度(RLU為200-600萬）。實(shí)驗(yàn)前用0.85wt%NaCl溶液稀釋待測(cè)樣品和ZnS〇4,設(shè)置不同的稀釋 度，分別取〇. 9mL加入化學(xué)/生物發(fā)光儀的低背景管中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，以0.85wt % NaCl溶液為對(duì)照，為減少儀器測(cè)定延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間所引起的誤差，每隔20s向同一平行管的另 外管中加〇. lmL菌懸液到樣品管中，混勾后控制待測(cè)反應(yīng)時(shí)間在20min。
[0045] 按各管原來加菌液的順序，當(dāng)某管達(dá)到記錄的反應(yīng)時(shí)間，立即將測(cè)試管放入儀器 測(cè)試艙，讀出并記錄其發(fā)光強(qiáng)度。
[0046] 計(jì)算測(cè)試樣品急性毒性:根據(jù)試驗(yàn)測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度RLU(Relative Light Units)， 計(jì)算樣品的相對(duì)發(fā)光抑制率:相對(duì)抑制率(R，％) = (1-試樣的RLU/對(duì)照的RLU) X 100。
[0047] 建立標(biāo)準(zhǔn)參比毒物ZnS〇4的劑量-效應(yīng)曲線，origin 9.0軟件擬合ZnS〇4濃度與發(fā)光 強(qiáng)度的關(guān)系方程：
[0048] y = 3.32+101.1/(l+l(T((5.3-x)*1.25))。見圖 6。
[0049] 實(shí)施例1:反應(yīng)時(shí)間和pH值的選擇試驗(yàn)
[0050] 該試驗(yàn)對(duì)測(cè)試方法中的測(cè)試反應(yīng)時(shí)間以及樣品pH值適用范圍進(jìn)行優(yōu)化。
[0051 ] 分別配制并稀釋不同濃度的Na2S〇4溶液(500、1000和10000mg/L)，在該溶液基礎(chǔ)上 進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間以及pH值的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
[0052] 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化：分別設(shè)置不同的反應(yīng)時(shí)間0、3、7、10、15、20、30、40、60、80、100和 120min〇
[0053] pH值