[0056] ⑤攪拌十分鐘以上。
[0057]⑥定容至 1600ml。
[0058] 2)R2試劑的配制
[0059] ①將300ml純化水加入到適當(dāng)容器中。
[0060]②開啟電動(dòng)攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。
[0061]③稱取0.3g Tris加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。
[0062] ④稱取2g甘膽酸脫氫酶加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。
[0063] ⑤稱取1.2g疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。
[0064] ⑥稱取12g還原型輔酶I加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。
[0065] ⑦攪拌十分鐘以上。
[0066] ⑧定容至400ml。
[0067] 3)標(biāo)準(zhǔn)品的配制
[0068] ①將80ml純化水加入到適當(dāng)容器中。
[0069]②開啟電動(dòng)攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。
[0070]③稱取0.8mg甘膽酸鈉水合物加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。
[0071]④稱取5mg Tris加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。
[0072]⑤稱取6.7mg疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。
[0073]⑥攪拌十分鐘以上。
[0074] ⑦定容至100ml。
[0075] 4)試劑檢驗(yàn)
[0076] ①儀器配置:儀器使用日立7100全自動(dòng)生化分析儀。
[0077] 測(cè)定參數(shù)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書在儀器中設(shè)定，基本測(cè)定參數(shù)如下：
[0078] 方法:終點(diǎn)法，反應(yīng)方向：向上;波長:600nm，溫度37 °C。
[0079] 比色杯光徑：1 cm; R1試劑：200μ1，R2試劑：50μ1，甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣：6μ1。
[0080] 第一測(cè)光點(diǎn):在R2加入后1分鐘讀取;第二測(cè)光點(diǎn):在R2加入后5分鐘讀取。
[00811②試劑外觀檢查：目測(cè)檢查。
[0082]③裝量檢查:用通用量具測(cè)量。
[0083]④試劑空白測(cè)定：
[0084]用蒸餾水或去離子水作為空白樣品測(cè)試試劑盒，在測(cè)試主波長下，記錄測(cè)試啟動(dòng) 時(shí)吸光度(Α1試劑)和約5分鐘后的吸光度(Α2試劑），Α2即為工作試劑的空白吸光度。
[0085]⑤線性范圍測(cè)定：
[0086]取接近線性范圍上限的高值樣本用生理鹽水倍比稀釋配制成不同濃度梯度的樣 本系列。以Η值與稀釋比例計(jì)算出預(yù)期值。稀釋方法參照表1所示(根據(jù)高值的大小可相應(yīng)調(diào) 整稀釋梯度）。
[0087] 表1樣本稀釋表
[0089]表中：實(shí)施例1樣本的濃度為已知定值CH，實(shí)施例2-5樣本濃度按公式:樣本濃度= CHX稀釋比例，計(jì)算作為預(yù)期值，將稀釋好的樣本系列充分混勻，在校正后的測(cè)定系統(tǒng)上按 從低值到高值順序平行測(cè)定2次，均值作為對(duì)應(yīng)實(shí)施例樣本實(shí)測(cè)值(如2次測(cè)定結(jié)果有明顯 偏差應(yīng)剔除重測(cè)）。
[0090]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：以預(yù)期值為橫坐標(biāo)，樣本實(shí)測(cè)值為縱坐標(biāo)作圖及直線回歸分析，確定 線性區(qū)間計(jì)算出直線方程y = a+bx及相關(guān)系數(shù)，當(dāng)相關(guān)系數(shù)r 2 0.990時(shí)為線性良好。
[0091 ] 數(shù)據(jù)分析處理采用Microsoft Excel軟件。
[0092]相關(guān)公式如下：
[0096] 式中，C:濃度;V:容積;b:回歸線的斜率；| a | :回歸線截距的絕對(duì)值;r:相關(guān)系數(shù)； X1:各管預(yù)期值;Y1:各管測(cè)定值;i:l、2、3.……、n;n:測(cè)定樣本數(shù)。
[0097] ⑥精密度測(cè)定：
[0098] a.重復(fù)性測(cè)定：
[0099] 用臨床標(biāo)本或質(zhì)控血清測(cè)試試劑盒，重復(fù)測(cè)試10次，計(jì)算測(cè)量值的平均值
[0100] ( i )和標(biāo)準(zhǔn)差(S)。按如下公式計(jì)算變異系數(shù)(CV)。
[0101] (?與變異系數(shù)cv(%)
[0104]式中：I一一待測(cè)血清樣本的均值；
[0105] Xi--測(cè)定血清樣本的測(cè)定結(jié)果；
[0106] η--測(cè)定次數(shù)
[0107] CV--變異系數(shù)
[0108] b.批間差測(cè)定
[0109] 取三個(gè)批號(hào)送檢試劑，每個(gè)批號(hào)取3瓶，分別測(cè)定1份臨床樣本或質(zhì)控血清，可選用 羅氏質(zhì)控品，分別計(jì)算9份試劑測(cè)定均值ΓΧ_Τ)和每個(gè)批號(hào)3份試劑的測(cè)定均值 CXI、H i3.)i并用Microsoft Excel軟件統(tǒng)計(jì)三個(gè)批號(hào)試劑測(cè)定的變異系數(shù)。
[0110] 相關(guān)公式如下：
[0111] 批間極差（％) = (ΧΛ--fmin) / Ιτχ?οο%..........…-(0)
[0112] 式中：
[0113] --K'、T2、I.-,中的最大值；
[0114] Χ1?η--、孓、1中的最小值；
[0115] XT--總均值。
[0116] ⑦準(zhǔn)確性測(cè)定：
[0117]取校準(zhǔn)品（有證參考物質(zhì)，CRM)對(duì)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)檢測(cè)3次，取測(cè)試結(jié)果均值 (M)，按公式(7)計(jì)算相對(duì)偏差(B)。
[0118]相對(duì)偏差(B) = (M_T)/TX100%.......................................(7)
[0119] 式中：T 有證參考物質(zhì)(CRM)標(biāo)不值;Μ 樣品測(cè)定結(jié)果均值；
[0120]⑧分析靈敏度：
[0121] 用已知濃度或活性的樣品測(cè)試試劑盒，記錄在試劑盒規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改 變，換算為η單位的吸光度差值（ΔΑ)。
[0122] 以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)所提供技術(shù)方案所作的進(jìn)一步詳 細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實(shí)施只局限于上述這些說明，對(duì)于本發(fā)明創(chuàng)造所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演 或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甘膽酸測(cè)定試劑，其特征在于:包括R1試劑、R2試劑和甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣，所述的R1 試劑是由硫代氧化型輔酶I溶解于添加有緩沖液的純化水中所形成的溶液;所述的R2試劑 是由還原型輔酶I溶解于添加有緩沖液、甘膽酸脫氫酶、疊氮鈉的純化水中所形成的溶液； 所述的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣是由甘膽酸鈉水合物、緩沖液和疊氮鈉溶解于純化水中形成的溶液。2. 如權(quán)利要求1所述的一種甘膽酸測(cè)定試劑，其特征在于:所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖 液或三羥甲基氨基甲烷。3. 如權(quán)利要求2所述的一種甘膽酸測(cè)定試劑，其特征在于:所述的磷酸鹽緩沖液的pH為 7.0,濃度為 0.65mol/L。4. 如權(quán)利要求1所述的一種甘膽酸測(cè)定試劑，其特征在于:所述的硫代氧化型輔酶I為 硫代煙酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型，其濃度為lg/L。5. 如權(quán)利要求1所述的一種甘膽酸測(cè)定試劑，其特征在于:所述的還原型輔酶I為β_煙 酰胺脲嘌呤二核苷酸還原型，其濃度為6g/L。6. 如權(quán)利要求1所述的一種甘膽酸測(cè)定試劑，其特征在于:所述的甘膽酸脫氫酶濃度2 5000U/L。7. 如權(quán)利要求1所述的一種甘膽酸測(cè)定試劑，其特征在于：所述的疊氮鈉濃度為 0·6mol/L〇8. -種權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述甘膽酸測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1 )R1試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解;加入硫代氧化型輔酶I攪拌 至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容； (2 )R2試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解;加入甘膽酸脫氫酶，攪拌至 溶解;添加疊氮鈉攪拌至溶解，加入還原型輔酶I攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容； (3) 甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣配制：向純化水中加入甘膽酸鈉水合物，攪拌至完全溶解;加入緩沖 液攪拌至溶解，加入疊氮鈉攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容； (4) 對(duì)上述制備的R1試劑、R2試劑及甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行靈敏度、線性范圍、精密度和準(zhǔn) 確度進(jìn)行測(cè)定。9. 如權(quán)利要求8所述的甘膽酸測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于：所述的攪拌速度為 450轉(zhuǎn)/分。10. 如權(quán)利要求8所述的甘膽酸測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于：步驟（1)中，所述的 純化水為15 0 0 m 1，定容體積為16 0 0 m 1;步驟（2)中，所述的純化水為3 0 0 m 1，定容體積為 400ml;步驟(3)中，所述的純化水為80ml，定容體積為100ml。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種甘膽酸測(cè)定試劑及其制備方法，屬于生化手段測(cè)試技術(shù)領(lǐng)域。包括R1試劑、R2試劑和甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣，所述的R1試劑是由硫代氧化型輔酶溶解于添加有緩沖液的純化水中所形成的溶液；所述的R2試劑是由還原型輔酶溶解于添加有緩沖液、甘膽酸脫氫酶、疊氮鈉的純化水中所形成的溶液；所述的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣是由甘膽酸鈉水合物、緩沖液和疊氮鈉溶解于純化水中形成的溶液。將本發(fā)明應(yīng)用于甘膽酸測(cè)定，具有快速靈敏、準(zhǔn)確性好、特異性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/53
【公開號(hào)】CN105588936
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510929415
【發(fā)明人】方朝君
【申請(qǐng)人】浙江達(dá)美生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請(qǐng)日】2015年12月14日