一種肉制品中氨基吡啶類致癌物的定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種氨基[!比啶類致癌物的定量檢測(cè)方法，特別是涉及肉制品中氨基口比啶類致癌物的定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在癌癥的眾多誘發(fā)因素中，飲食是不容忽視的一項(xiàng)。多項(xiàng)研究表明，長(zhǎng)期攝入“過度”加工的肉制品可顯著提高人類患癌的風(fēng)險(xiǎn)，而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因已被證實(shí)可能與肉制品在加工過程中產(chǎn)生的小分子危害物密切相關(guān)。
[0003]氨基吡啶是一類在高溫肉制品中最為常見的雜環(huán)芳香烴類致癌和致突變化合物，以2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4，5-b]吡啶為代表，簡(jiǎn)稱為PhIP，此外還包括2-氨基-1，6-二甲基咪唑并[4，5-b]吡啶，簡(jiǎn)稱為DMIP，2-氨基-1，5，6-三甲基咪唑并[4，5-b]吡啶，簡(jiǎn)稱為TMIP，以及2-氨基-1-甲基-6-(4'-羥苯基)_咪唑并[4，5-b]吡啶，簡(jiǎn)稱為V-OH-PhIP等。近年來的研究表明，氨基吡啶類化合物能顯著誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)多器官患癌，同時(shí)還具有極強(qiáng)的致突變性。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)于1993年已將包括PhIP在內(nèi)的8種雜環(huán)芳香烴類化合物定義為2B級(jí)潛在致癌物，并將PhIP作為導(dǎo)致人類致癌的因素之一列入了國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃中。高溫肉制品中由氨基吡啶類化合物帶來的飲食安全問題已引起人們廣泛的關(guān)注，使得對(duì)于該化合物形成機(jī)制和抑制途徑的研究成為焦點(diǎn)，而一套快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)前處理方法的提出往往是各項(xiàng)進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。
[0004]在復(fù)雜的肉制品體系中，氨基吡啶的含量極少，通常以ng/g的水平存在。要想從復(fù)雜的肉基質(zhì)中提取含量極少的氨基吡啶，選取一種合適的提取試劑，在最大程度保證提取率的基礎(chǔ)上，盡可能的去除干擾UHPLC-MS/MS雜質(zhì)有很大的技術(shù)難度，也給后期的凈化提出了一定的要求。同時(shí)，由于氨基吡啶的含量極低，想要采用UHPLC-MS/MS對(duì)該化合物進(jìn)行精確測(cè)定，必須要對(duì)該化合物進(jìn)行富集，并去除基質(zhì)的干擾，因此在提取后所采用的固相萃取等富集凈化步驟也必不可少。
[0005]目前行業(yè)上還未有對(duì)于氨基吡啶檢測(cè)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)。而對(duì)于肉制品中氨基吡啶類化合物的測(cè)定前處理方法已有報(bào)道?，F(xiàn)行傳統(tǒng)檢測(cè)主要基于液液萃取以及串聯(lián)固相萃取來完成，簡(jiǎn)稱液液串聯(lián)固相萃取法。具體方法是:首先向粉碎后的肉粉末中加入一定量的高濃度堿溶液后均質(zhì)，與固定劑硅藻土混合后采用如乙酸乙酯或二氯甲烷的有機(jī)試劑將氨基吡啶從堿液中萃取出來。再將萃取液先后通過PRS和Ci8兩種固相萃取小柱凈化，最后用UHPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。但是在應(yīng)用的過程中發(fā)現(xiàn)，該方法對(duì)目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率低，所得結(jié)果誤差過大，且操作繁瑣復(fù)雜，不利于大規(guī)模樣本的測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種肉制品中氨基吡啶類致癌物的定量檢測(cè)方法，該方法主要是利用UHPLC-MS/MS定量檢測(cè)的原理，通過預(yù)處理的方法將肉制品中微量的氨基吡啶類致癌物富集和溶解，使其完全準(zhǔn)確的被UHPLC-MS/MS分離和定量，達(dá)到定量檢測(cè)的目的。所述定量檢測(cè)方法包括肉制品預(yù)處理和UHPLC-MS/MS定量檢測(cè)兩部分，依次包括如下步驟:
[0007]制備肉制品的粉末；
[0008]加三氯乙酸水溶液并均質(zhì)處理；
[0009]在頻率為40 ± 1kHz超聲提取15 ±5min后離心并取上清液；
[0010]調(diào)節(jié)上清液的pH值至3.0±0.5，并通過活化好的MCX小柱；
[0011]依次采用鹽酸溶液、甲醇溶液淋洗和氨水-甲醇= l:9(v/v)混合液洗脫，得到洗脫液；
[0012]用氮?dú)獯蹈上疵撘海尤胍译鎻?fù)溶，并加入2.5mg/mL的咖啡堿甲醇溶液；
[0013]用UHPLC-MS/MS檢測(cè)，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品與樣品圖譜中的保留時(shí)間，確定樣品圖譜中對(duì)應(yīng)的峰，并采用外標(biāo)法對(duì)所得質(zhì)譜圖峰面積進(jìn)行計(jì)算，最終得到肉制品中氨基吡啶類致癌物的含量。
[0014]其中，所述UHPLC-MS/MS檢測(cè)條件為:Acquity UPLC BEH C18色譜柱;流動(dòng)相A相為lOmmol/L的乙酸銨水溶液，其pH為6.8，流動(dòng)相B相為乙腈;梯度洗脫程序:O?1min，10 %?15% 流動(dòng)相B; 1?I Imin，15% ?100% 流動(dòng)相B; ll?12min，100% 流動(dòng)相B; 12?13min，100%?10%流動(dòng)相8，13?1711^11，10%流動(dòng)相8，流速為0.3111171^11，柱溫為35°(:。質(zhì)譜采用ESI源，正離子模式。源溫為120°C，毛細(xì)管電壓為3.5V，脫溶劑為氮?dú)?，脫溶劑氣流速?50L/h，脫溶劑溫度為350°C，錐孔氣為氮?dú)?，錐孔氣流速為60L/h，碰撞氣為氬氣，碰撞氣流速為0.13mL/min0
[0015]在UHPLC-MS/MS檢測(cè)中，使用的質(zhì)譜定量模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜定量模式。
[0016]所述氨基吡啶類致癌物包括DMIP，TMIP，PhIP和V-OH-PhIP，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜定量模式中，四種氨基吡啶類致癌物的定量離子對(duì)分別為:
[0017]a)DMIP:定量離子對(duì)為163>148，錐孔電壓為46V，碰撞能量為34V;
[0018]b)TMIP:定量離子對(duì)為177>162，錐孔電壓為54V，碰撞能量為30V;
[0019]c)PhIP:定量離子對(duì)為225>210，錐孔電壓為54V，碰撞能量為42V;
[0020](1)47 -OH-PhIP:定量離子對(duì)241 >225，錐孔電壓為54V，碰撞能量為32V。
[0021 ] 進(jìn)一步，在頻率為40 ± 1kHz超聲提取15 ±5min后離心并取上清液中，所述離心的轉(zhuǎn)速為11000r/min，離心的時(shí)間為15±5min。
[0022]—種優(yōu)化的方法，所述在頻率為40 ± 1kHz超聲提取15 ±5min后離心并取上清液的步驟后，還包括將離心的沉淀物再用頻率為40 ± 1kHz超聲提取15 ±5min，并離心，合并兩次離心后的上清液。
[0023]有益效果
[0024]1、本發(fā)明提供的方法較現(xiàn)行常用方法更為簡(jiǎn)便。采用添加三氯乙酸水溶液并均質(zhì)的方法，輔助超聲處理，僅僅添加了一種溶液和單步提取方式代替多步液液萃取步驟，同時(shí)采用單步固相萃取步驟代替串聯(lián)固相萃取操作，因此對(duì)可節(jié)省約50%的預(yù)處理時(shí)間。同時(shí)，本發(fā)明采用了 MCX小柱，經(jīng)過檢索，MCX小柱目前尚未被使用在氨基吡啶類致癌物的定量檢測(cè)中，MCX小柱替代了傳統(tǒng)方法中兩次過小柱，僅僅用了一個(gè)小柱就完成了之前通過PRS和C18兩中種固相萃取小柱凈化的操作，完全富集了氨基吡啶類致癌物，并將對(duì)UHPLC-MS/MS定量檢測(cè)有影響的雜質(zhì)過濾掉，同時(shí)使肉制品中氨基啦啶類致癌物的定量檢測(cè)更為快速，在高溫肉制品安全控制方面有很高的應(yīng)用前景。
[0025]2、本發(fā)明采用了三氯乙酸水溶液提取的方法，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)三氯乙酸水溶液溶解可以提高氨基吡啶類致癌物定量檢測(cè)的準(zhǔn)確率，配合MCX小柱的富集和過濾，使檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率得到顯著提高。同時(shí)，較現(xiàn)行常用方法，本發(fā)明提供的預(yù)處理方法所得四種氨基吡啶的加標(biāo)回收率都有顯者提尚，進(jìn)一步又提尚了肉制品中氣基卩比唆檢測(cè)的準(zhǔn)確性。經(jīng)過檢測(cè)，本發(fā)明實(shí)施例1采用的預(yù)處理方法得到的加標(biāo)回收率范圍為59.29 %?108.24 %，而現(xiàn)行傳統(tǒng)液液串聯(lián)固相萃取法的加標(biāo)回收率僅為21.35?45.33%，通過加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)得出，本發(fā)明方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率很高，氨基吡啶的損失率可以被忽略，較傳統(tǒng)方法有顯著提升。
[0026]3、本發(fā)明提供的氨基吡啶致癌物定量檢測(cè)的方法，包括預(yù)處理以及UHPLC-MS/MS檢測(cè)，具有檢測(cè)限低，精密度高，重現(xiàn)性好的優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于市售多種肉制品中氨基吡啶化合物的定量檢測(cè)。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明的方法的工藝流程圖；
[0028]圖2為實(shí)施例1中四種氨基吡啶標(biāo)準(zhǔn)品的MRM圖譜；
[0029]圖3為實(shí)施例1中本發(fā)明方法樣品中四種氨基吡啶標(biāo)準(zhǔn)品的MRM圖譜；
[0030]圖4為實(shí)施例1中本發(fā)明方法與傳統(tǒng)液液串聯(lián)固相萃取法方法的加標(biāo)回收率對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
。
[0031]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑未特別說明均為分析純，并從商業(yè)途徑得到。
[0032]實(shí)施例1
[0033]1、烤肉樣品制備:購(gòu)買新鮮豬肉，并置于225°C下焙烤30min，烤至規(guī)定時(shí)間一半時(shí)翻一面，得到烤肉樣品，并用組織絞碎機(jī)粉碎，得到烤肉樣品粉末。
[0034]2、加三氯乙酸均質(zhì)處理:精確稱取4.0Og烤肉樣品粉末加入均質(zhì)管，并向其中加入25g 5%三氯乙酸水溶液，均質(zhì)15s，重復(fù)4次，其中，均質(zhì)采用德國(guó)IKAT-25型高速分散機(jī)，分散時(shí)轉(zhuǎn)速為15000 ±250轉(zhuǎn)/min。
[0035]3、超聲提取:將步驟2得到的混合液轉(zhuǎn)移到三角瓶中再超聲提取15±5min，超聲波工作頻率為40 ± 1kHz，溫度為室溫。
[0036]4、離心取上清液:離心的轉(zhuǎn)速為11000r/min，所述離心的時(shí)間為15±5min:提取后后將混合物轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，離心15±5min，收集上清液后，將殘?jiān)儆貌襟E3的條件超聲提取一次，合并離心后的上清液。
[0037]5、調(diào)節(jié)pH值至3.0:向合并后的上清液加入4mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至3.0 ±0.5，過濾得到提取液I。
[0038]6、MCX小柱預(yù)處理:所述固相萃取小柱的型號(hào)為:0asis MCX小柱，規(guī)格是60mg，3mL。依次用6mL甲醇、6mL超純水、6mL 0.lmol/L鹽酸溶液通過Oasis MCX小柱，對(duì)其進(jìn)行活化，再將提取液I上樣至活化好的小柱。并依次采用6mL 0.lmol/L鹽酸和6mL甲醇溶液淋洗，再采用6mL氨水-甲醇=1:9(v/v)的混合液洗脫。
[0039]7、收集洗脫液并用高純氮?dú)獯蹈?，加?00yL乙腈復(fù)溶，加入10yL2.5mg/mL咖啡堿后，進(jìn)行UHPLC-MS/MS檢測(cè)。
[0040]8、UHPLC_MS/MS檢測(cè):其中，所述UHPLC-MS/MS檢測(cè)條件為:Acquity BEH C18柱;流動(dòng)相A相為lOmmol/L的乙酸銨水溶液，其pH為6.8，流動(dòng)相B相為乙腈;梯度洗脫程序:O?1min，10% ?15%流動(dòng)相B; 10?I Imin，15% ?100%流動(dòng)相B; 11?12min，100%流動(dòng)相B;12?13min，100%?10%流動(dòng)相B，13?17min，10%流動(dòng)相B，流速為0.3mL/min，柱溫為35°C。質(zhì)譜采用ESI源，正離子模式。源溫為120°C，毛細(xì)管電壓為3.5V，脫溶劑為氮?dú)?，脫溶劑氣流速?50L/h，脫溶劑溫度為350 °C，錐孔氣為氮?dú)?，錐孔氣流速為60L/h，碰撞氣為氬氣，碰撞氣流速為0.13mL/min。
[0041]質(zhì)譜定量模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜定量模式。測(cè)定以下四種氨基吡啶:
[0042]1)DMIP:定量離子對(duì)為163>148，錐孔電壓為46V，碰撞能量為34V;