O型口蹄疫病毒抗體檢測(cè)卡及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)卡，特別是涉及一種用于快速定量檢測(cè)豬血清中O型口蹄疫病毒抗體的檢測(cè)卡及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄動(dòng)物(豬、牛、羊、駱駝等)共患的一種急性、熱性、高度傳染性疫病，其特征是在口、舌、唇、鼻、蹄、乳房等發(fā)生水泡，并潰癢形成爛斑。該病傳播途徑多、速度快，流行區(qū)域廣，能造成巨大的政治、經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OfficeInternat1nal des Epizooties,OIE )將其列為A類動(dòng)物疫病。我國政府也將其排在14個(gè)一類動(dòng)物傳染病的第一位。目前，大部分OIE成員國都流行FMD，這不僅制約了畜牧業(yè)的發(fā)展而且還造成畜產(chǎn)品進(jìn)出口市場(chǎng)的關(guān)閉和消費(fèi)者的恐慌。FMD已經(jīng)時(shí)刻威脅著那些無FMD國家和地區(qū)的家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易。例如，2001年英國暴發(fā)FMD時(shí)(O型泛亞毒株入侵所致)，僅短短的7個(gè)月內(nèi)就造成高達(dá)30億英鎊的政府損失和50億英鎊的私人損失。
[0003]口蹄疫由口蹄疫病毒引起，口蹄疫病毒為小RNA病毒科(Picornaviridae) 口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員。口蹄疫病毒基因組為單股正鏈RNA，約由8500個(gè)核苷酸組成。病毒衣殼由4種結(jié)構(gòu)蛋白即VPl、VP2、VP3和VP4各60個(gè)拷貝組成，其中VPl是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒共有7個(gè)血清型:0、A、C、Asia-1、SAT USAT 2和SAT 3型。目前7個(gè)口蹄疫病毒型中O型的流行最為廣泛(世界范圍內(nèi))，其次為Asia-1型和A型;C型和南非三型非常罕見，通常只在特定區(qū)域流行。
[0004]O型口蹄疫的防控主要是疫苗免疫及屠宰感染和可疑畜群，而疫苗免疫動(dòng)物與感染動(dòng)物體內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體，因此檢測(cè)結(jié)構(gòu)蛋白抗體的診斷方法能確定動(dòng)物對(duì)病毒株的抵抗力。同時(shí)日常監(jiān)測(cè)疫苗產(chǎn)生抗體對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)來說，對(duì)群體的日常監(jiān)測(cè)是選擇疫苗、評(píng)估免疫程序合理性、掌握豬群健康狀態(tài)的重要手段，同時(shí)也可從側(cè)面反映飼養(yǎng)場(chǎng)管理是否合理，也是適時(shí)注射疫苗的主要依據(jù)。
[0005]市面上有O型口蹄疫病毒抗體膠體金快速檢測(cè)卡，通過對(duì)樣品的檢測(cè)，即可粗略判斷豬體內(nèi)是O型口蹄疫抗體含量，獸醫(yī)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷是否需要注射O型口蹄疫疫苗。
[0006]同樣市場(chǎng)上也大量使用檢測(cè)O型口蹄疫抗體酶標(biāo)試劑盒，即液相阻斷ELISA酶標(biāo)試劑盒，ELISA試劑盒需要酶標(biāo)儀、溫育反應(yīng)條件、洗板條件，操作工作環(huán)境和專業(yè)技術(shù)人員，另外檢測(cè)樣本還需要復(fù)雜的前處理，如采集血液，分離血清等；而快速膠體金雖然檢測(cè)方便，不需專業(yè)技術(shù)人員和工作環(huán)境，但其檢測(cè)的靈敏度低，且只能定性，檢測(cè)范圍窄。而本發(fā)明專利的目的就是克服以上兩類試劑盒的各自缺點(diǎn)，通過簡(jiǎn)單的操作，現(xiàn)場(chǎng)快速、準(zhǔn)確、高靈敏地定量(半定量)分析，實(shí)現(xiàn)在養(yǎng)豬現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就是提供一種O型口蹄疫病毒抗體檢測(cè)卡及其制備方法，能完全解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種O型口蹄疫病毒抗體檢測(cè)卡，包括裝配在外殼內(nèi)的檢測(cè)卡本體，所述檢測(cè)卡本體包括底板，在底板上依次設(shè)置樣品墊、標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述標(biāo)記墊由載體基層和標(biāo)記物組成，標(biāo)記物為載體基層上噴涂鑭系熒光檢測(cè)微球和鑭系熒光質(zhì)控微球形成的一層膜，所述檢測(cè)微球和質(zhì)控微球均為表面帶有羥基或氨基的硅膠微球或聚苯乙烯微球，且檢測(cè)微球和質(zhì)控微球的粒徑均為50?500nm，所述硝酸纖維素膜上包被O型口蹄疫抗原為檢測(cè)線，包被羊抗雞抗體為質(zhì)控線，在外殼上對(duì)應(yīng)樣品墊開設(shè)加樣孔，對(duì)應(yīng)硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線開設(shè)視窗孔。
[0009]作為優(yōu)選，所述底板為PVC底板，在PVC底板上從左至右依次粘貼樣品墊、標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，且樣品墊的右端搭在標(biāo)記墊的左端上，標(biāo)記墊的右端搭在硝酸纖維素膜的左端上，吸水紙左端搭在硝酸纖維素膜的右端上。
[0010]作為優(yōu)選，所述檢測(cè)微球?yàn)闃?biāo)記有O型口蹄疫抗原的微球，質(zhì)控微球?yàn)闃?biāo)記有雞IgY或兔IgG的質(zhì)控微球。
[0011]作為優(yōu)選，所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和標(biāo)記墊上采用的O型口蹄疫抗原均為滅活O型口蹄疫病毒抗原、O型口蹄疫疫苗或O型口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白VPl、VP2和VP3的重組蛋白；所述硝酸纖維素膜上質(zhì)控線采用的羊抗雞抗體為羊抗雞IgY的IgG或者羊抗兔lgG。
[0012]作為優(yōu)選，所述檢測(cè)微球和質(zhì)控微球均為表面帶有羥基或氨基的硅膠微球或聚苯乙烯微球。
[0013]作為優(yōu)選，所述標(biāo)記在生物原料上的鑭系熒光微球的鑭系熒光是指鑭系元素Eu、Sm或Tb與β— 二酮配基產(chǎn)生的熒光。其發(fā)光效率高、吸收光譜寬、發(fā)射光譜很窄、斯特克斯位移寬，使其熒光光譜分析的靈敏度很高。
[0014]作為優(yōu)選，所述樣品墊為檢測(cè)血清或血漿的樣品墊，或者為檢測(cè)全血的樣品墊。
[0015]作為優(yōu)選，本檢測(cè)卡利用豬血樣品中O型口蹄疫病毒抗體、O型口蹄疫病毒抗原的標(biāo)記物和硝酸纖維素膜上包被O型口蹄疫病毒抗原通過雙抗原夾心法來檢測(cè)豬血樣本中O型口蹄疫病毒抗體。
[0016]作為優(yōu)選，本檢測(cè)卡為定量層析檢測(cè)卡，它是通過檢測(cè)儀檢測(cè)層析后檢測(cè)卡的檢測(cè)線和質(zhì)控線發(fā)出的熒光信號(hào)，然后根據(jù)此批檢測(cè)卡的IC卡儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光信號(hào)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待檢物的濃度。
[0017]一種O型口蹄疫病毒抗體檢測(cè)卡的制備方法，其特征在，包括以下步驟:
步驟一，把硝酸纖維素膜粘貼在PVC底板上，并在硝酸纖維素膜上噴涂已稀釋至0.2?0.5mg/ml的羊抗雞IgY的IgG形成質(zhì)控線和已稀釋至0.3?1.0mg/ml的O型口蹄疫抗原形成檢測(cè)線，烘制后備用；
步驟二，用封閉液封閉硝酸纖維素膜10?30分鐘，用1mM磷酸緩沖液清洗硝酸纖維素膜10?30分鐘，干燥后備用；
步驟三，制備標(biāo)記有雞IgY的鑭系熒光微球和標(biāo)記有O型口蹄疫抗原的鑭系熒光微球； 步驟四，把標(biāo)記有雞IgY和標(biāo)記有O型口蹄疫抗原的鑭系熒光微球并分別稀釋至濃度
0.05?0.4yg/ml和I?8yg/ml，并將其噴涂在載體基層上構(gòu)成標(biāo)記墊，烘制后備用；
步驟五，把樣品墊、標(biāo)記墊、吸水紙依次粘在PVC底板上，組裝成大卡，再用剪切機(jī)切割成試紙條，裝配在檢測(cè)卡外殼內(nèi)，即得到O型口蹄疫病毒抗體檢測(cè)卡。
[0018]名詞解釋:
羊抗雞IgY的IgG:羊抗雞IgY的免疫球蛋白G;
羊抗兔IgG:羊抗兔IgG的免疫球蛋白G;
雞IgY:雞卵黃抗體；
兔IgG:兔免疫球蛋白G;
抗豬RBC:抗豬紅細(xì)胞表面蛋白抗體。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:靈敏度高，檢測(cè)的批內(nèi)差及批間差小，有較好的重復(fù)性，性能穩(wěn)定，既可檢測(cè)全血樣本，也可以檢測(cè)血清和血漿樣本，與CSFV(豬瘟病毒)、PRRSV(豬呼吸與繁殖障礙綜合癥耳病病毒)、PCV(豬圓環(huán)病毒)、PRV(偽狂犬病毒)、PPV(豬細(xì)小病毒)、JEV(乙腦病毒)等抗體沒有交叉反應(yīng)?？蓪?shí)現(xiàn)O型口蹄疫病毒抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有較高的實(shí)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是圖1中檢測(cè)卡本體的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是圖2的俯視圖；
圖4是O型口蹄疫病毒抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0022]如圖1至圖4所示，一種O型口蹄疫病毒抗體檢測(cè)卡，包括裝配在外殼10內(nèi)的檢測(cè)卡本體，所述檢測(cè)卡本體包括PVC底板I，在PVC底板I上從左至右依次粘貼樣品墊2、標(biāo)記墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙5，且樣品墊2的右端搭在標(biāo)記墊3的左端上，標(biāo)記墊3的右端搭在硝酸纖維素膜4的左端上，吸水紙5左端搭在硝酸纖維素膜4的右端上。所述硝酸纖維素膜4上包被O型口蹄疫抗原為檢測(cè)線6，包被羊抗雞抗體為質(zhì)控線7。在外殼10上對(duì)應(yīng)樣品墊2開設(shè)加樣孔11，對(duì)應(yīng)硝酸纖維素膜4上的檢測(cè)線6和質(zhì)控線7開設(shè)視窗孔12。
[0023]所述硝酸纖維素膜4上質(zhì)控線4采用的羊抗雞抗體為羊抗雞IgY的IgG或者羊抗兔IgG0
[0024]所述標(biāo)記墊3由載體基層和標(biāo)記物組成，標(biāo)記物為載體基層上噴涂鑭系熒