一種依諾肝素鈉的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種依諾肝素鋼的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 依諾肝素鋼，作為一種用于預(yù)防和治療深靜脈血栓或肺栓塞的抗凝血劑，其產(chǎn)品 質(zhì)量的好壞直接關(guān)系著患者的生命安全。
[0003] 在依諾肝素鋼的生產(chǎn)過程中，如果企業(yè)的生產(chǎn)工藝不先進(jìn)或控制水平不高，其產(chǎn) 品的質(zhì)量很可能會產(chǎn)生較大的波動；因此，為了監(jiān)控依諾肝素鋼的產(chǎn)品質(zhì)量和/或其生產(chǎn)工 藝的穩(wěn)定性，同時，也為了盡可能降低因產(chǎn)品質(zhì)量波動所帶來的經(jīng)濟(jì)損失，有必要對生產(chǎn)出 來的依諾肝素鋼進(jìn)行檢測。
[0004] 然而，依諾肝素鋼的現(xiàn)有檢測方法：中國專利CN 102323355 A和CN 104193849 A， 對依諾肝素鋼進(jìn)行檢測時，需要同時檢測10多個色譜峰來評價依諾肝素鋼的產(chǎn)品質(zhì)量，其 檢測結(jié)果無法直觀的反映出產(chǎn)品質(zhì)量和/或其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，而且，它還需要采用程序 復(fù)雜但分離效果好的梯度洗脫，也不簡便。
[0005] 為了能夠使檢測方法的結(jié)果直觀的反映產(chǎn)品質(zhì)量和/或其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，同 時，也為了使檢測方法更加簡便，需要發(fā)明一種檢測依諾肝素鋼的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種依諾肝素鋼的檢測方法。
[0007] 本發(fā)明提供的一種依諾肝素鋼的檢測方法，它包括W下步驟：
[000引 a、取依諾肝素鋼樣品，加入酸水溶液，于110°C~120°C下水解反應(yīng)6~8小時后，除 去酸，加入水，過濾，得到樣品水解溶液；
[0009] 其中，依諾肝素鋼樣品與酸水溶液的重量體積比為1:0.5~2mg/mL，依諾肝素鋼樣 品與水的重量體積比為1:80~1 OOmg/yL
[0010] b、取樣品水解溶液，加入氨氧化鋼水溶液和衍生化試劑醇溶液，于70°C~80°C下 反應(yīng)60分鐘~90分鐘后，冷卻，用鹽酸調(diào)節(jié)至溶液呈中性，加入立氯甲燒，振蕩，離屯、，取水 相的上清液，作為待檢溶液；
[0011] 其中，樣品水解溶液與氨氧化鋼水溶液的體積比為1:0.8~1.5;樣品水解溶液與 衍生化試劑醇溶液的體積比為1:0.8~1.5;
[0012] C、采用高效液相色譜方法對待檢溶液進(jìn)行檢測，檢測條件如下：
[0013] 反相色譜柱:C18柱或C8柱，
[0014] 流動相:憐酸鹽緩沖液-乙臘，憐酸鹽緩沖液與乙臘的體積比為70:30~95:5，
[001引檢測波長：220nm~270nm;
[0016] 檢測得到葡萄糖胺與甘露糖胺的峰面積，按照W下公式：
[0017]
[0018] 計算得到葡萄糖胺與甘露糖胺的比例。
[0019] 進(jìn)一步的，步驟a中，所述酸水溶液的濃度為1.5~2.5mol/M優(yōu)選的，所述酸水溶 液的濃度為2mol/L。
[0020] 進(jìn)一步的，步驟a中，所述的酸水溶液為Ξ氣乙酸水溶液或氨氣酸。
[0021] 進(jìn)一步的，步驟b中，所述氨氧化鋼水溶液的濃度為0.2mol/L~0.5mol/L，所述衍 生化試劑醇溶液的濃度為〇.2mol/L~ImolA;優(yōu)選的，所述氨氧化鋼水溶液的濃度為 0.3mol/L，所述衍生化試劑醇溶液的濃度為0.5mol/L。
[0022] 進(jìn)一步的，步驟b中，所述的衍生化試劑醇溶液為1-苯基-3甲基-5-化挫嘟酬的醇 溶液、2-氨基化晚的醇溶液、乙基-4-氨基安息香酸鹽的醇溶液、2-氨基苯甲酸的醇溶液或 1,2-二氨基-4,5-亞甲基雙氧苯的醇溶液;優(yōu)選的，所述的衍生化試劑醇溶液為1-苯基-3甲 基-5-化挫嘟酬的甲醇溶液。
[0023] 進(jìn)一步的，步驟C中，C18柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，長度為150mm，內(nèi) 徑為4.6mm，填料的粒徑為如m。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟C中，憐酸鹽緩沖液與乙臘的體積比為85:15。
[0025] 進(jìn)一步的，步驟C中，憐酸鹽緩沖液是按照W下方法配制而成：取0.05~0.2mol/L 的憐酸氨二鋼水溶液，用憐酸調(diào)節(jié)pH值為6.0~7.0，即得。
[0026] 進(jìn)一步的，步驟C中，憐酸鹽緩沖液是按照W下方法配制而成：取O.lmol/L的憐酸 氨二鋼水溶液，用憐酸調(diào)節(jié)pH值為6.7，即得。
[0027] 進(jìn)一步的，步驟C中，檢測波長為245nm;柱溫為30°C ;流速為ImL/min;進(jìn)樣體積為 20化。
[0028] 本發(fā)明檢測方法，通過檢測葡萄糖胺與甘露糖胺的比例，不僅可W直觀的反映出 產(chǎn)品質(zhì)量和/或其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性;而且，本發(fā)明檢測方法簡便，無需采用復(fù)雜的梯度洗 脫程序，就可W實(shí)現(xiàn)對依諾肝素鋼的準(zhǔn)確檢測，為監(jiān)控依諾肝素鋼的產(chǎn)品質(zhì)量和/或其生產(chǎn) 工藝的穩(wěn)定性提供了一種簡單易行的新方法。
[0029] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0030] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明方法對依諾肝素鋼樣品、依諾肝素鋼標(biāo)準(zhǔn)品、單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測的 HPLC圖：GlcN表示葡萄糖胺;ManN表示甘露糖胺;GlcUA表示葡萄糖醒酸;GalN表示半乳糖 胺;GalUA表示半乳糖醒酸。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。 實(shí)施例1、本發(fā)明檢測依諾肝素鋼中葡萄糖胺與甘露糖胺比例的方法
[0033] 1、儀器與試劑
[0034] ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6X 150mm,美國，Agilent公司）；高效液相色譜儀 (Agilent-1260,美國Agilent公司），配紫外檢測器和數(shù)據(jù)分析軟件；
[0035] 依諾肝素鋼樣品(成都百裕制藥股份有限公司，110401批次）；
[0036] 依諾肝素鋼標(biāo)準(zhǔn)品化P，E0180000);
[0037] 葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖醒酸標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖胺標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖醒酸標(biāo)準(zhǔn)品、1-苯 基-3-甲基-5-化挫嘟酬(PMP)，均購自美國sigma公司；
[003引乙臘為HPLC級試劑；
[0039] Ξ氣乙酸、氨氣酸、氨氧化鋼、鹽酸、甲醇(A時式劑）。
[0040] 2、樣品供試液制備
[0041] 2.1、加酸水解
[0042] 取依諾肝素鋼樣品、依諾肝素鋼標(biāo)準(zhǔn)品各2mg，分別用2mol/LS氣乙酸水溶液2mL 溶解，110°C沙浴恒溫降解化，氮吹儀吹干Ξ氣乙酸，溶于20化L水中，0.22μπι濾膜過濾，分別 得到依諾肝素鋼樣品的水解溶液、依諾肝素鋼標(biāo)準(zhǔn)品的水解溶液。
[0043] 2.2、柱前衍生
[0044] 分別取10化L上述所得的依諾肝素鋼樣品的水解溶液、依諾肝素鋼標(biāo)準(zhǔn)品的水解 溶液，加入100化濃度為0.3mol/L氨氧化鋼水溶液，混合均勻，再加入120化濃度0.5mol/L PMP甲醇溶液，在70°C下反應(yīng)60min。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，用0.3mol/L鹽酸溶液中和，加入50化 L氯仿，充分振蕩、離屯、、棄去有機(jī)相，重復(fù)3次，取上清液，作為待檢溶液。
[0045] 3、色譜檢測條件
[0046] 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6mmX150mm，5皿）；
[0047] 流動相:0.1mol/L憐酸鹽緩沖液(pH 6.7)-乙臘(￥/￥，85:15);
[004引O.lmol/L憐酸鹽緩沖液(pH 6.7)的配制方法為：取0.111101/1憐酸氨二鋼水溶液， 用憐酸調(diào)節(jié)抑值為6.7。
[0049]柱溫:30°C;
[(K)加]檢測波長：245nm;
[0051 ]流速：ImL/min;
[0化2] 進(jìn)樣體積：2化L。
[0053]