一種針對(duì)vegf靶向治療藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)VEGF祀向治療藥物的生物學(xué) 活性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF)是一類(lèi)能促 進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)新生血管的形成、提高血管通透性的生長(zhǎng)因子。它能夠通過(guò)與血 管內(nèi)皮上的相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并增加血管通透性，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo) 腫瘤血管生成，維持腫瘤的繼續(xù)生長(zhǎng)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血管生成因子，與諸多生理及病 理過(guò)程有關(guān)。已有研究證明，腫瘤的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段，分別是無(wú)血管的緩慢生長(zhǎng) 期和有血管的快速增殖期，血管的生成使腫瘤能獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)而完成血管切換期，如果 沒(méi)有血管的生成，原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)不超過(guò)l-2mm，轉(zhuǎn)移則無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因此血管生成是惡性腫 瘤生長(zhǎng)中的一個(gè)重要過(guò)程，抑制腫瘤血管生成被認(rèn)為是當(dāng)前最具有前途的腫瘤治療方法之 一。因此，VEGF已成為具有良好前景的腫瘤治療祀點(diǎn)。
[0003] 在藥物的研制過(guò)程中，生物學(xué)活性檢測(cè)方法是藥物篩選W及質(zhì)量控制的重要評(píng)價(jià) 指標(biāo)，該方法必須通過(guò)方法驗(yàn)證，滿(mǎn)足專(zhuān)屬性、精密度、準(zhǔn)確度等方法驗(yàn)證方面的要求，送樣 才能保證生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果的可靠性，才能用于指導(dǎo)藥物的篩選W及質(zhì)量控制，因此建 立切實(shí)可靠的生物學(xué)活性檢測(cè)方法，對(duì)于VEGF祀向治療藥物的研究開(kāi)發(fā)、質(zhì)量控制乃至臨 床應(yīng)用都具有重要的意義。
[0004] 目前常用的針對(duì)VEGF祀向治療藥物的生物學(xué)活性測(cè)定方法，是依據(jù)VEGF能夠促 進(jìn)細(xì)胞增殖分化，而藥物可W中和VEGF活性，從而對(duì)細(xì)胞具有增殖抑制作用的原理進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的，使用的細(xì)胞系主要是HUVEC細(xì)胞，從文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，該細(xì)胞增殖抑制的生物學(xué) 活性方法并未得到公認(rèn)或標(biāo)準(zhǔn)化，由于HUVEC細(xì)胞屬于原代細(xì)胞，細(xì)胞貼壁性不好，采用普 通的細(xì)胞培養(yǎng)板，得不到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要提前在96孔板預(yù)鋪一 層明膠W幫助HUVEC進(jìn)行貼壁，并且明膠鋪設(shè)的情況直接影響到細(xì)胞狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使 得實(shí)驗(yàn)繁復(fù)且難W標(biāo)準(zhǔn)化。另外，顯色方式和顯色條件也各不相同，從文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，大 多采用的是放射性同位素（3H-TdR)標(biāo)記法、AlamarBlue或Cell titer Glo顯色法，前者 是同位素標(biāo)記法，對(duì)環(huán)境和人員存在一定的福射與傷害，不利于方法推廣W及質(zhì)量控制； AlamarBlue是一種英光顯色法，顯色操作方便，但是實(shí)驗(yàn)必須采用不透明96孔細(xì)胞板進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不便進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)的觀(guān)察，并且復(fù)孔間RLU值的變異系數(shù)比較大； Cell titer Glo顯色法是基于A(yíng)TP的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法，同樣需要采用不透明96孔細(xì)胞板 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不便于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)的觀(guān)察；此外，由于底物和緩沖液的儲(chǔ)存條件 為-2(TC，因此顯色前必須化凍，并且需要將底物與緩沖液混合恢復(fù)至室溫才可W用于顯 色，配好的顯色液在4°C的條件下只能穩(wěn)定48小時(shí)。除此W外，更重要的是，在已經(jīng)報(bào)道的 針對(duì)VEGF祀向治療藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)方法中，缺乏對(duì)檢測(cè)體系專(zhuān)屬性、精密度、準(zhǔn)確 度、線(xiàn)性和范圍等方面的方法驗(yàn)證與評(píng)價(jià)，難W確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。
[0005] 因此，一種能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效地評(píng)價(jià)VEGF祀向治療藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)方 法仍是目自U所急需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)現(xiàn)有VEGF祀向治療藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)方法存在的問(wèn)題 與不足，研究了一種能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效地評(píng)價(jià)VEGF祀向治療藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)方 法，該方法能夠滿(mǎn)足方法驗(yàn)證過(guò)程中對(duì)專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、日間差、人員 操作誤差）、線(xiàn)性和范圍等方面的要求，該方法對(duì)于VEGF祀向治療藥物的研究開(kāi)發(fā)，質(zhì)量控 制乃至臨床應(yīng)用都具有重要的意義。
[0007] 具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種評(píng)價(jià)VEGF祀向治療藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)方法，包括 下列步驟：
[000引 （1)細(xì)胞鋪板：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔 中，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁；
[0009] (2)參考品及供試品稀釋?zhuān)蝗⒖计芳肮┰嚻罚鶕?jù)標(biāo)示濃度，先預(yù)稀釋至一定濃 度，再進(jìn)行系列梯度稀釋?zhuān)?br>[0010] (3) VEGF稀釋?zhuān)话凑諛?biāo)示濃度稀釋至一定濃度，與步驟（2)稀釋好的系列梯度濃度 的參考品及供試品溶液進(jìn)行等比例混合并預(yù)賠。
[0011] (4)加樣；將步驟（3)預(yù)賠溶液依次加入步驟（1)中的細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，然后將細(xì) 胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0012] (5)顯色；采用檢測(cè)活細(xì)胞或死細(xì)胞量的檢測(cè)體系對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行顯色反應(yīng)；
[0013] (6)測(cè)定分析；步驟（5)顯色反應(yīng)完成后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板混勻，放入酶標(biāo)儀，對(duì)顯 色反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算供試品的細(xì)胞增殖抑制生物學(xué)活性。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（1)所述的細(xì)胞鋪板，是取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞經(jīng)膜蛋白酶消化 后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整至合適的細(xì)胞密度，W 100 μ 1/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然 后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。步驟（4)所述加樣，是 將步驟（3)預(yù)賠溶液W 100 μ 1/孔依次加入步驟（1)所述的細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將細(xì)胞培 養(yǎng)板放置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68-74小時(shí)。步驟（6)所述供試品細(xì)胞增殖 抑制生物學(xué)活性是通過(guò)W下方法獲得，用參考品孔和供試品孔測(cè)定值與加樣濃度的量效關(guān) 系進(jìn)行4參數(shù)擬合，確定參考品與供試品的ECw值，曲線(xiàn)擬合常數(shù)R2,并按照下列公式計(jì)算 供試品的細(xì)胞增殖抑制生物學(xué)活性：
[0015]
[0016] 在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地，所述VEGF祀向治療藥物是單克隆抗體、融合蛋白、激酶 抑制劑、反義寡核甘酸、化合物、中藥提取物或中藥復(fù)方提取物之一或它們的任意組合，其 中優(yōu)選為單克隆抗體（貝伐珠單抗）和融合蛋白（VEGF-Trap)
[0017] 在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地，步驟（1)所述細(xì)胞培養(yǎng)板是一種對(duì)微孔板表面進(jìn)行特 殊處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)板，優(yōu)選多聚賴(lài)氨酸表面涂覆處理和等離子技術(shù)表面親水處理的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，送種經(jīng)過(guò)表面特殊處理過(guò)的細(xì)胞板可促進(jìn)細(xì)胞的吸附和貼壁，減少了明膠 預(yù)鋪板的復(fù)雜步驟，不但提高了工作效率，減少了實(shí)驗(yàn)影響因素，而且保證了實(shí)驗(yàn)的可靠 性。
[0018] 在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地，步驟（2)所述的系列梯度稀釋是倍比稀釋?zhuān)鼉?yōu)選所述 的參考品溶液和供試品溶液濃度預(yù)稀釋至l-20ug/mL。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地，步驟（3) 所述的VEGF稀釋至一定濃度是50-300ng/mL。
[0019] 在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地，在步驟巧）中，所述檢測(cè)活細(xì)胞或死細(xì)胞量的檢測(cè)體系 為包括但不限于；四哇類(lèi)化合物氧化還原檢測(cè)體系、ATP總量檢測(cè)體系等。更優(yōu)選地，所述 四哇類(lèi)化合物為MTT、MTS、CCK-8等，最優(yōu)選為CCK-8,改用CCK-8顯色液，便于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn) 行細(xì)胞狀態(tài)的觀(guān)察，不需要進(jìn)一步的溶解處理，避免了反復(fù)凍融對(duì)顯色液靈敏度的影響， 而且顯色結(jié)果穩(wěn)定，可操作性強(qiáng)，質(zhì)量更加可控。。
[0020] 本發(fā)明采用的體外細(xì)胞增殖抑制法評(píng)價(jià)VEGF祀向治療藥物的生物學(xué)活性，該方 法專(zhuān)屬性好，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，線(xiàn)性和范圍能夠達(dá)到50-150%;精密度高、重復(fù)性、日間 差W及人員操作誤差RSD均小于20%，參考品和供試品的4參數(shù)擬合曲線(xiàn)的擬合常數(shù)r2均 大于0. 95。因此，采用本發(fā)明提供的方法能夠簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，高效地評(píng)價(jià)VEGF祀向治療藥物的 生物學(xué)活性，送對(duì)于VEGF祀向治療藥物的研究開(kāi)發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應(yīng)用都具有重要的 意義。
【附圖說(shuō)明】
[002。 圖1抗VEGF單克隆抗體藥物參考品和供試品的生物學(xué)活性4參數(shù)曲線(xiàn)擬合圖（A : 最大吸光值，B ;斜率；C ;ECw值；D ;最小吸光值；ΙΓ2 ;曲線(xiàn)擬合常數(shù)）；
[0022] 圖2抗VEGF單克隆抗體藥物和陰性對(duì)照的生物學(xué)活性4參數(shù)曲線(xiàn)擬合圖（A ;最 大吸光值，B ;斜率；C ;ECw值；D ;最小吸光值；ΙΓ2 ;曲線(xiàn)擬合常數(shù)）；
【具體實(shí)施方式】
[0023] W下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。下列 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均是按照常規(guī)條件或制造廠(chǎng)商所建議的條件；除非 另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)均是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的含義， 例如，ECs。（指半數(shù)有效濃度）、0D (指吸光值）、CV (指變異系數(shù)）、RSD (指相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）、 SD (指標(biāo)準(zhǔn)偏差）等等。
[0024] 下列實(shí)施例涉及到的材料和試劑，實(shí)驗(yàn)條件和方法如下：
[00幼一、材料和試劑
[0026] 材料；VEGF祀向治療單克隆抗體藥物參考品（上?？贵w藥物國(guó)家工程研究中必有 限公司提供），VEGF祀向治療單克隆抗體藥物供試品（上海抗體藥物國(guó)家工程研究中必有 限公司提供）。
[0027] 試劑；染色液CCK-8 (購(gòu)于Dojindo)，ECM培養(yǎng)基（購(gòu)于A(yíng)TCC)，，膜蛋白酶（購(gòu)于 GIBC0)，F(xiàn)BS (購(gòu)于 GIBC0)。
[0028] 細(xì)胞株；HUVEC細(xì)胞株（購(gòu)于A(yíng)TCC)。
[002引二、檢測(cè)方法步驟
[0030] 1、細(xì)胞鋪板：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞經(jīng)膜蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)， 調(diào)整細(xì)胞密度后，W 100μ 1/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。
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