馬尾松病死木中失活線蟲的分離液及其分離方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物樣品內(nèi)失活線蟲的分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬尾松病死木中失活線蟲的分離液及其分離方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]松材線蟲病是重要的檢疫性病害，截至2012年底，我國先后有17個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)的275個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生過松材線蟲病，占縣級(jí)行政區(qū)域總數(shù)9.6%，給我國森林資源和生態(tài)環(huán)境造成了巨大破壞(宋玉雙，2013)。截至2013年，全國仍有15個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)的179個(gè)縣(市、區(qū))發(fā)生松材線蟲病(國家林業(yè)局2013年第2號(hào)公告)。但是中國幅員遼闊，針葉樹占森林面積的42.7%，而松樹約占整個(gè)針葉林面積的58%，適宜松材線蟲病流行的地區(qū)較廣。根據(jù)研究，松材線蟲病在平均溫度10°C的地區(qū)就能發(fā)生，我國的海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、浙江、江西、云南、貴州、四川、湖南、湖北、江蘇、安徽、河南、陜西、山東、河北、山西、北京、上海、天津、香港均為松材線蟲的適生區(qū)，而遼寧、新疆、西藏、甘肅的部分地區(qū)也適合松材線蟲的發(fā)生(何龍喜等，2014)。
[0003]關(guān)于松木中線蟲的分離技術(shù)，目前常用的方法有:貝爾曼漏斗法和淺盤法兩種技術(shù)，具體步驟如下所述:
[0004]1.貝爾曼漏斗法:①置備一只直徑10?15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段長約15cm的乳膠管，置于漏斗架上，在乳膠管上裝一止水夾(彈簧夾)。②對(duì)松木樣品細(xì)木條(或木片、木肩)進(jìn)行線蟲分離時(shí)，用剪刀將其剪碎或用尖頭鑷子、解剖針將其撕碎，剪取大小合適的2層紗布將碎體包裹后，放入漏斗中，關(guān)閉漏斗下端乳膠管上的止水夾。然后從漏斗壁慢慢注入清水，使清水充滿漏斗和下面乳膠管，水要漫過紗布包。③在25 °C下，浸泡24h后，將培養(yǎng)皿置于乳膠管下，打開止水夾，接取15ml浸泡液，供顯微鏡檢驗(yàn)或計(jì)數(shù)。
[0005]2.淺盤法:①淺盤分離裝置由2個(gè)口徑不同的用不銹鋼或鋁合金等材料制成的淺盤組成，將其中口徑略小、底部為粗網(wǎng)篩的淺盤放在另一個(gè)淺盤上面。②將大小合適的2層紗布平鋪于篩盤上，松木樣品細(xì)木條(或木片、木肩)置于篩盤紗布上面，慢慢注入清水，使清水浸泡全部樣品。③在25°C下，浸泡24h后，移去篩盤，把大淺盤內(nèi)的樣品浸泡液倒入燒杯。燒杯內(nèi)浸泡液中的線蟲可通過自然沉降或離心方法，移去多余的水分，濃縮至適宜的量，以便顯微鏡檢驗(yàn)或計(jì)數(shù)。
[0006]這兩種分離線蟲的原理是線蟲是喜水動(dòng)物，遇水便會(huì)從植物體游出。線蟲個(gè)體小，可穿過紗布，同時(shí)由于線蟲身體比重比水大，所以線蟲便會(huì)下沉到浸泡樣品的液體底部(馮志新，2000)。這也決定了這兩種技術(shù)只能分離出活動(dòng)性較強(qiáng)的線蟲，無法分離出樣本中失活線蟲。
[0007]線蟲的活動(dòng)度受溫度和本身生命力影響。生產(chǎn)上存在大量含有失活線蟲的植物樣品。比如冬天低溫和夏天高溫，線蟲活動(dòng)減慢；比如冰凍樣本內(nèi)，線蟲已經(jīng)死亡。如何分離出植物樣本內(nèi)失活線蟲，國內(nèi)未見報(bào)道。
[0008]鑒于松材線蟲病是我國的頭號(hào)森林病害，防治馬尾松松材線蟲病的最有效途徑是抗病育種，而抗病育種需要檢測(cè)數(shù)量巨大的樣本內(nèi)的松材線蟲，因此需要將這些樣本冰凍儲(chǔ)藏起來，因此必須發(fā)明植物樣本內(nèi)失活線蟲的分離技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種馬尾松病死木中失活線蟲的分離液。該液體對(duì)分離馬尾松松木內(nèi)線蟲具有高特異性，可用于分離馬尾松病死木中的線蟲。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述分離液進(jìn)行馬尾松病死木中失活線蟲的分離方法。
[0011]本發(fā)明的再一目的在于提供上述分離液制備而成的用于分離馬尾松病死木中失活線蟲的試劑盒。
[0012]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0013]—種馬尾松病死木中失活線蟲的分離液，該分離液由pH為4.40的鹽酸溶液、纖維素酶和果膠酶組成，其中纖維素酶的濃度為0.005mg/yl，果膠酶的濃度為0.0Olmg/μΙ。
[0014]所述pH為4.40的鹽酸溶液是用濃鹽酸調(diào)節(jié)雙蒸水的pH至4.40制備而成。
[0015]—種利用上述的分離液進(jìn)行馬尾松病死木中失活線蟲的分離方法，按照以下操作步驟:
[0016](I)用手術(shù)刀片縱切馬尾松病死木材料，切成長0.8?1.0cm，厚0.1?Imm的切片，用電子天平稱取0.2g材料切片置于1ml離心管，并且置于-20°C的冰箱中保存；
[0017](2)用移液槍取2000μ1分離液于裝有材料切片的1ml離心管，用鑷子使切片全部浸入溶液;把離心管固定在恒溫振蕩器中，設(shè)置振蕩器的參數(shù)為溫度50°C、轉(zhuǎn)速250R，振蕩6h后，將材料切片取出，于-200C冰箱保存。
[0018]—種利用上述分離液制備而成的用于分離馬尾松病死木中失活線蟲的試劑盒，可以使得馬尾松病死木中失活線蟲的分離更加快速、便利。
[0019]本發(fā)明人通過分析可以分解木材的液體之后，篩選液體組分，確定使用該分離液各組分的濃度配比和使用該分離液處理木材的時(shí)間，然后統(tǒng)計(jì)利用該技術(shù)分離出的線蟲數(shù)量。運(yùn)用本發(fā)明篩選的分離液，分離出的線蟲形態(tài)完整;本發(fā)明還提供該分離液各組分的最佳濃度配比，在此濃度下，分離出的線蟲數(shù)量最多；本發(fā)明還提供該分離液最佳處理時(shí)段，在此時(shí)段內(nèi)，分離出的線蟲數(shù)量最多。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0021](I)本發(fā)明的技術(shù)可以分離出馬尾松病木中的失活線蟲。分離出的線蟲完整，可以用于單條計(jì)數(shù)，可以用于定量松材內(nèi)的線蟲數(shù)量比較。
[0022](2)由于松材線蟲病的復(fù)雜性，如何快速、有效地從病木中分離出線蟲，一直是松材線蟲病鑒定的難點(diǎn)，本發(fā)明提供一種從病木中分離失活線蟲技術(shù)，擴(kuò)大了可用于檢測(cè)線蟲的樣本來源，提高了分離效率。
[0023](3)用分離液處理松材時(shí)，處理時(shí)所用液體成分是關(guān)鍵的技術(shù)參數(shù)，本發(fā)明通過篩選，得出鹽酸\雙蒸水\纖維素酶\果膠酶四種最佳組分組合。
[0024](4)用分離液處理松材時(shí)，處理時(shí)所用液體濃度是關(guān)鍵的技術(shù)參數(shù)，本發(fā)明通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)，篩選出了最佳濃度，提高了分離效率；
[0025](5)用分離液處理松材時(shí)，分離液體處理時(shí)間是關(guān)鍵的技術(shù)參數(shù)。本發(fā)明通過處理時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)，篩選出了最佳時(shí)間，提高了分離效率；
[0026](6)本發(fā)明的分離技術(shù)可制備相應(yīng)檢測(cè)試劑盒，從而使得檢測(cè)更加簡單程