用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的多熒光通道檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)系統(tǒng)，尤其是涉及一種采用由激發(fā)單元和檢測(cè)單元合并后的熒光檢測(cè)單元進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的多熒光通道檢測(cè)系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]1996年美國的Applied B1system公司在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase ChainReact1n，簡(jiǎn)稱PCR)的基礎(chǔ)上提出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real_time qPCR)。該方法在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的DNA熒光探針，在每一次溫度循環(huán)過程中通過采集反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度來實(shí)時(shí)的監(jiān)控目標(biāo)DNA擴(kuò)增情況。之后又有人提出多重PCR(Multiplex PCR)，即利用引物、熒光探針與目標(biāo)DNA結(jié)合的特異性，在反應(yīng)體系中針對(duì)多個(gè)目標(biāo)DNA加入多對(duì)引物和多個(gè)熒光探針，通過一次實(shí)時(shí)熒光定量PCR來檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)DNA。此方法克服了普通PCR操作繁瑣、難以定量、容易污染的缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)通量和可靠性，使得實(shí)時(shí)熒光定量PCR開始走向?qū)嵱谩?br>[0003]在多重PCR中，為了避免不同的熒光探針的熒光相互混雜無法分辨，會(huì)選用不同激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)的熒光報(bào)告基團(tuán)來合成熒光探針。這也就對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)系統(tǒng)提出多熒光通道的需求。
[0004]現(xiàn)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熒光檢測(cè)實(shí)現(xiàn)方案有如圖1所示，底部有反應(yīng)液8的試管6插入溫塊7中，溫塊7對(duì)反應(yīng)液8進(jìn)行溫控以實(shí)現(xiàn)PCR循環(huán)。在溫塊上開有孔，激發(fā)光纖5和檢測(cè)光纖9分別插入對(duì)準(zhǔn)反應(yīng)液8，激發(fā)光纖5和檢測(cè)光纖9為直徑Imm的塑料光纖，玻璃或者石英光纖束。光源I發(fā)出寬譜光，經(jīng)準(zhǔn)直透鏡2準(zhǔn)直后通過激發(fā)濾光片3過濾為該通道所需波長(zhǎng)，再經(jīng)過光纖耦合透鏡4將激發(fā)光耦合入激發(fā)光纖5 ο激發(fā)光通過激發(fā)光纖5傳導(dǎo)至樣本處。所激發(fā)出熒光的一部分經(jīng)由檢測(cè)光纖9傳導(dǎo)至光纖耦合透鏡4準(zhǔn)直后通過檢測(cè)濾光片11將激發(fā)光完全過濾掉。熒光再通過匯聚透鏡12匯聚至光電傳感器13上形成光電信號(hào)。
[0005]現(xiàn)有實(shí)現(xiàn)方案需要激發(fā)單元、檢測(cè)單元2個(gè)部分和2根光纖或光纖束完成對(duì)一個(gè)熒光通道的檢測(cè)，多熒光通道則需要多個(gè)激發(fā)和檢測(cè)單元。
[0006]如圖2所示，以2熒光通道48試管孔位為例。光纖盤I為俯視圖，光纖盤15上兩個(gè)直徑不同的圓周，分別為激發(fā)圓周和檢測(cè)圓周，在激發(fā)圓周和檢測(cè)圓周上均勻垂直的插入48根激發(fā)光纖或激發(fā)光纖束和48根檢測(cè)光纖或檢測(cè)光纖束，在一個(gè)圓周上相鄰兩根光纖或光纖束之間夾角360°-48 = 7.5°。在激發(fā)圓周上的每個(gè)光纖或光纖束為與檢測(cè)圓周上與其夾角90°的光纖或光纖束為一組，插入溫塊7的一個(gè)試管孔位。圖2中SI試管孔位對(duì)應(yīng)EXl和EMl兩根光纖或光纖束，S2對(duì)應(yīng)EX2和EM2兩根光纖或光纖束，以此類推。在EXl端放置激發(fā)單元，同時(shí)在EMl端放置檢測(cè)單元即可完成對(duì)SI試管孔位的熒光檢測(cè)。只要沿著光纖盤I的圓心轉(zhuǎn)動(dòng)激發(fā)單元和檢測(cè)單元一周，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)48個(gè)試管孔位的熒光檢測(cè)。
[0007]圖3為轉(zhuǎn)盤16的俯視圖，上面同樣有激發(fā)圓周和檢測(cè)圓周。在激發(fā)圓周上均布著2個(gè)通道的激發(fā)單元CHlEX，CH2EX，檢測(cè)圓周上均布檢測(cè)單元CHlEM，CH2EM。每一個(gè)通道的激發(fā)單元與檢測(cè)單元與圓心的夾角也為90°，這樣激發(fā)單元對(duì)準(zhǔn)光纖盤15上的任意一個(gè)試管孔位的光纖或光纖束時(shí)，該通道檢測(cè)單元也對(duì)準(zhǔn)該試管孔位的另一個(gè)光纖或光纖束。
[0008]圖4為將光纖盤15和轉(zhuǎn)盤16通過機(jī)械結(jié)構(gòu)裝在同一個(gè)軸上的水平視圖。用電機(jī)18驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)盤16繞光纖盤15圓心轉(zhuǎn)動(dòng)一圈，即可依次檢測(cè)48個(gè)試管孔位2個(gè)熒光通道的熒光信號(hào)。
[0009]如若檢測(cè)4個(gè)熒光通道，需在轉(zhuǎn)盤上布置4個(gè)激發(fā)單元和4個(gè)檢測(cè)單元，并根據(jù)布置方案調(diào)整光纖盤15上每個(gè)試管孔位所插入的光纖對(duì)或光纖束對(duì)的角度間隔。同樣的原理也可以擴(kuò)展到更多試管孔位的系統(tǒng)中。
[0010]上述現(xiàn)有方案的缺點(diǎn)在于:
[0011]1、每一個(gè)試管孔位需要2根光纖，光學(xué)系統(tǒng)的成本比較高。
[0012]2、在溫塊上每一個(gè)試管孔位都需要加工2個(gè)孔來插入光纖，當(dāng)溫塊的試管孔位較多時(shí)(如96孔)，溫塊的機(jī)械結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和加工非常困難。很難設(shè)計(jì)出體積小，還能加工這么多光纖插孔的溫塊。
[0013]3、若擴(kuò)展至多熒光通道，需要2倍的熒光激發(fā)和檢測(cè)單元布置在轉(zhuǎn)盤上，激發(fā)和檢測(cè)單元的體積限制使得轉(zhuǎn)盤的激發(fā)圓周和檢測(cè)圓周的直徑必須增大才可布置得下更多的單元。這樣會(huì)大幅增加整個(gè)轉(zhuǎn)動(dòng)部分的轉(zhuǎn)動(dòng)慣量和質(zhì)量，導(dǎo)致電機(jī)負(fù)載增加，轉(zhuǎn)動(dòng)速度不得不降低，熒光檢測(cè)周期變長(zhǎng)。
[0014]4、激發(fā)單元與檢測(cè)單元必須同時(shí)對(duì)正激發(fā)光纖與檢測(cè)光纖，這對(duì)整個(gè)機(jī)械零件的加工和裝配精度提出了很高的要求。微小的加工與裝配誤差就會(huì)導(dǎo)致熒光激發(fā)與檢測(cè)的差異，最終導(dǎo)致各個(gè)試管孔位之間的熒光信號(hào)一致性差。
[0015]上述現(xiàn)有方案的一個(gè)變形方案如圖5所示，一分二的Y型光纖束代替了原有的激發(fā)光纖和檢測(cè)光纖，Y型光纖束內(nèi)包含多根玻璃或石英光纖，每根光纖直徑為30um或50um。在公共端17，激發(fā)端5和檢測(cè)端9光纖的截面如圖5中放大視圖所示。激發(fā)端5，檢測(cè)端9的光纖數(shù)量相等，在公共端17來自激發(fā)端5的光纖和檢測(cè)端9的光纖被規(guī)則或隨機(jī)的排列成直徑Imm的光纖束。在Y型光纖束分叉處，所有的激發(fā)光纖和檢測(cè)光纖被分至各自的激發(fā)端5和檢測(cè)端9形成兩束單獨(dú)的光纖束。當(dāng)激發(fā)單元對(duì)準(zhǔn)激發(fā)端5，檢測(cè)單元對(duì)準(zhǔn)檢測(cè)端9時(shí)，激發(fā)光和檢測(cè)光分別通過各自的光纖在Y型光纖束內(nèi)傳輸，互不干擾。變形方案的其他轉(zhuǎn)盤部分結(jié)構(gòu)不變，檢測(cè)熒光的方式也一樣。
[0016]上述變形方案的缺點(diǎn):
[0017]1、Y型光纖束的成本要高于2根獨(dú)立的光纖。
[0018]2、由于溫塊結(jié)構(gòu)限制，公共端光纖束的直徑與現(xiàn)有方案需保持一致。那么激發(fā)端和發(fā)射端光纖的有效截面積變?yōu)楝F(xiàn)有方案的一半，對(duì)激發(fā)光的耦合效率與熒光的接收效率也會(huì)隨之下降一半，導(dǎo)致最終的熒光信號(hào)強(qiáng)度降為現(xiàn)有方案的四分之一，這會(huì)嚴(yán)重降低熒光信號(hào)的信噪比。
[0019]4、無法避免現(xiàn)有方案擴(kuò)展至多個(gè)熒光通道所帶來的轉(zhuǎn)盤直徑增大，熒光檢測(cè)周期變長(zhǎng)的問題。
[0020]5、無法避免現(xiàn)有方案不同試管孔位的熒光信號(hào)一致性差的問題。
[0021 ]綜上所示，上述現(xiàn)有的兩種方案仍然無法根本性的解決以下問題:
[0022]1、單個(gè)試管孔位對(duì)應(yīng)的光纖數(shù)量與熒光信號(hào)信噪比之間的矛盾。
[0023]2、熒光通道數(shù)量與檢測(cè)速度之間的矛盾。
[0024]3、熒光信號(hào)一致性差的問題。
[0025]這些缺點(diǎn)使得現(xiàn)有技術(shù)方案在實(shí)時(shí)熒光定量PCR領(lǐng)域應(yīng)用受到極大限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0026]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種縮短熒光檢測(cè)周期、機(jī)械加工與調(diào)試的精度要求降低、試管孔位之間的一致性得到提高、檢測(cè)效率高、熒光信號(hào)信噪比高、易加工、生產(chǎn)成本低的用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的多熒光通道檢測(cè)系統(tǒng)。
[0027]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案:一種用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的多熒光通道檢測(cè)系統(tǒng)，包括:
[0028]溫塊，所述溫塊上具有一個(gè)或多個(gè)試管孔位；
[0029]熒光檢測(cè)單元，所述熒光檢測(cè)單元包括光源、激發(fā)濾光片、二向色鏡、光纖耦合透鏡、光纖、檢測(cè)濾光片和光電傳感器，所述激發(fā)濾光片設(shè)置在光源的出方向上，所述二向色鏡與光源射出的光呈傾斜設(shè)置，所述光纖插入試管孔位中，光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)濾光片過濾為相應(yīng)波長(zhǎng)的激發(fā)光，再通過二向色鏡進(jìn)入光纖耦合透鏡耦合，最后經(jīng)光纖射入樣本中，激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，一部分熒光從光纖返回到光纖耦合透鏡被準(zhǔn)直，再通過二向色鏡入射給檢測(cè)濾光片過濾出純凈的熒光，過濾出的熒光最后入射到光電傳感器形成光電信號(hào)；
[0030]光纖盤，所述光纖盤的圓周方向上均勻的垂直插入有η根所述光纖；
[0031 ]轉(zhuǎn)盤，所述轉(zhuǎn)盤上分布有m個(gè)熒光通道的所述熒光檢測(cè)單元，且所述轉(zhuǎn)盤和光纖盤同軸安裝，所述轉(zhuǎn)盤