快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，尤其涉及一種無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法，適用于快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)印跡(western blot，簡(jiǎn)稱(chēng)WB)又稱(chēng)免疫印跡(immunoblotting)是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。由于we stern blot具有SD S-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，已成為當(dāng)前分析蛋白質(zhì)的常用分子生物學(xué)技術(shù)。
[0003]在蛋白質(zhì)印跡過(guò)程中，經(jīng)過(guò)PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過(guò)從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，為了避免測(cè)試試劑的特異性抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，需要對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理;后續(xù)進(jìn)行Western Blot的檢測(cè)和顯色。
[0004]蛋白質(zhì)印跡常規(guī)流程:蛋白提取與樣品制備SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜封閉一一抗體雜交一一底物染色。具體包括以下步驟:
[0005]1.提取樣本總蛋白，并濃縮純化，用超微量核酸蛋白濃度儀器測(cè)定樣品提取液蛋白濃度。
[0006]2.按樣本總蛋白梯度20mg進(jìn)行上樣，變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白。
[0007]3.目標(biāo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。按B1-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說(shuō)明組裝濾紙凝膠纖維素夾層。30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過(guò)夜。
[0008]4.為了避免測(cè)試試劑的特異性抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，需要對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。加入封閉液后，一般在室溫或者37°C在搖床上緩慢震蕩l_2h，特殊情況在4 °C過(guò)夜。
[0009]5.封閉完成后要洗膜，去除膜上未結(jié)合的封閉試劑。常規(guī)的洗滌液為T(mén)BST，洗3次，每次15分鐘。
[0010]6.抗體孵育。膜在5 %脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。用TBST洗滌3次，每次15分鐘。封閉過(guò)的膜加入一抗室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合，用TBST洗滌3次，每次15分鐘。再加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜I小時(shí)。用TBST洗滌3次，每次15分鐘。
[0011]7.壓片顯影定影后觀(guān)察。
[0012]每種動(dòng)物細(xì)胞中所含的蛋白質(zhì)一般占到7%— 10%左右，谷類(lèi)一般含蛋白質(zhì)6%-10%,薯類(lèi)含蛋白質(zhì)2 % -3 %。而在花生組織中蛋白質(zhì)含量雖然有15 %左右，但雜質(zhì)多，如色素，酚類(lèi)和糖類(lèi)多，影響蛋白質(zhì)的提取。進(jìn)一步地，植物蛋白質(zhì)與動(dòng)物蛋白質(zhì)比較，成分有所不同，如水稻蛋白缺乏賴(lài)氨酸，大豆蛋白缺乏色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。因此，一般情況下，要分析的植物目標(biāo)蛋白質(zhì)在植物總蛋白質(zhì)比例較低，采用常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測(cè)常常效果差，蛋白曝光顯影弱或者不出現(xiàn)顯影，靈敏度低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更實(shí)用、更靈敏的針對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡法。
[0014]為達(dá)到以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0015]—種快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法，其包括以下步驟:
[0016](I)使用凝膠將從樣品中提取的總蛋白質(zhì)進(jìn)行梯度分離；
[0017](2)將已梯度分離的總蛋白質(zhì)從凝膠印跡到PVDF膜；
[0018](3)將印跡有所述總蛋白質(zhì)的PVDF膜浸泡在100 %甲醇中；
[0019](4)干燥經(jīng)100%甲醇處理的所述PVDF膜；
[0020](5)對(duì)干燥的PVDF膜中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行顯色檢測(cè)。
[0021 ] 具體地，所述100 %甲醇浸泡PVDF膜的時(shí)間為8?15s。
[0022]進(jìn)一步地，所述經(jīng)100%甲醇處理的PVDF膜的干燥方法為自然晾干。
[0023 ] 優(yōu)選地，所述晾干時(shí)間為1?15min。
[0024]更優(yōu)選地，所述PVDF膜放置在濾紙上進(jìn)行晾干。
[0025]進(jìn)一步地，所述步驟(5)中對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯色檢測(cè)步驟包括:
[0026](5.1)進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)與該目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體之間的免疫性結(jié)合；
[0027](5.2)進(jìn)行所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體與顯色標(biāo)記物之間的免疫性結(jié)合；
[0028](5.3)進(jìn)行顯色反應(yīng)并且展示顯色結(jié)果。
[0029]進(jìn)一步地，所述步驟(5.1)還包括將未結(jié)合的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行漂洗的步驟:將結(jié)合有所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體的PVDF膜置于含有TBST的洗滌液中漂洗兩次，每次8?15s0
[0030]優(yōu)選地，所述步驟(5.2)還包括將未結(jié)合的所述顯色標(biāo)記物進(jìn)行漂洗的步驟:將結(jié)合有所述顯色標(biāo)記物的PVDF膜置于含有TBST的洗滌液中漂洗兩次，每次8?15s。
[0031 ]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述樣品來(lái)源于植物或動(dòng)物。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì):
[0033](I)本發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，利用PVDF膜進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)膜步驟之后，用100 %甲醇浸泡該P(yáng)VDF膜，以增強(qiáng)該P(yáng)VDF膜對(duì)已附著在膜上的蛋白質(zhì)分子的吸附能力，避免低豐度的蛋白分子在操作過(guò)程中彌散或者逃逸；
[0034](2)本發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，讓固著有蛋白質(zhì)的PVDF膜干燥，以恢復(fù)PVDF膜的疏水性，也可以避免在抗體孵育過(guò)程中發(fā)生非特異性結(jié)合，以此替代常規(guī)的用脫脂奶粉進(jìn)行非特異性位點(diǎn)的封閉步驟；
[0035](3)本發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，甲醇是公知的溶劑，也易于揮發(fā)，用甲醇處理PVDF膜不僅可以洗去膜上的其他溶液，也輔助該膜迅速干燥；
[0036](4)本發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法中，由于對(duì)PVDF膜進(jìn)行了改進(jìn)性的處理，對(duì)應(yīng)地對(duì)抗體的漂洗過(guò)程也需要進(jìn)行優(yōu)化，具體是只需要進(jìn)行短時(shí)間的漂洗，即可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間；
[0037](5)本發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法，減少了長(zhǎng)時(shí)間封閉和漂洗過(guò)程中對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的損失，極大地提高了低豐度的目標(biāo)蛋白質(zhì)在PVDF膜的固著量，并且，避免了一抗孵育過(guò)程中脫脂奶粉和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間發(fā)生對(duì)抗體的吸附競(jìng)爭(zhēng)，由此對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯色也更明顯、更清晰；
[0038](6)本發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法，沒(méi)有引入專(zhuān)用設(shè)備和專(zhuān)用試劑，易于實(shí)現(xiàn)，并且簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，因此對(duì)推動(dòng)蛋白質(zhì)印跡法在蛋白質(zhì)研究中的作用具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1為用常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法對(duì)提取的花生葉片總蛋白進(jìn)行檢測(cè)，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)AhNCED蛋白的曝光顯影弱。
[0040]圖2為用常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法中的電泳和轉(zhuǎn)膜對(duì)提取的花生葉片蛋白進(jìn)行印跡，之后將PVDF膜用100%甲醇處理，后續(xù)進(jìn)行常規(guī)的抗體孵育步驟和顯色，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)AhNCED蛋白曝光顯影明顯可見(jiàn)。
[0041]圖3為用發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法對(duì)提取的花生葉片蛋白進(jìn)彳丁檢測(cè)，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)AhNCED蛋白曝光顯影突出。
[0042]圖4為本發(fā)明快速檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的無(wú)封閉的蛋白質(zhì)印跡法的流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0044]以下以花生葉片低豐度9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶(簡(jiǎn)稱(chēng)AhNCED蛋白)的檢測(cè)為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)介紹。
[0045]對(duì)比例
[0046]常規(guī)的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AhNCED蛋白
[0047](I)取約2g花生葉片放在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨至白綠色粉末，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入蛋白提取液5mL，在40C的條件下以12000rpm