定量分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分析方法，具體涉及同時(shí)定量分析甘油作原料微生物生產(chǎn) 1，3-丙二醇發(fā)酵液中1，3-丙二醇、甘油、乙酸、乙醇、2, 3-丁二醇、乳酸和琥珀酸的方法，它 是一種高效液相色譜法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1，3_丙二醇是無色無味的粘稠液體，可溶于水、醇、醚等多種有機(jī)溶劑。近年來，作 為重要的有機(jī)合成原料和中間體具有廣泛的應(yīng)用。主要用于增塑劑、洗滌劑、防腐劑、乳化 劑的合成，也可用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。特別是在聚酯合成方面具有獨(dú)特的性能， 不但可以使聚酯塑料具有易于自然循環(huán)的可生物降解特性，而且是制造性能優(yōu)異的新型聚 酯纖維（PTT)的重要單體原料。
[0003] 甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇過程中，產(chǎn)生乙酸、乙醇、2, 3-丁二醇、乳酸、琥 珀酸、檸檬酸等副產(chǎn)物。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜法測定1，3-丙二醇發(fā)酵液中的 有機(jī)酸，有用化學(xué)分析法測定發(fā)酵液中甘油含量，有用FTIR法直接測定丙二醇的含量，有 用色質(zhì)聯(lián)用衍生法測定1，3-丙二醇等多羥基醇類，有用高效液相色譜方法測定2, 3- 丁二 醇的含量等，但上述方法均不能滿足我們的需要。在1，3_丙二醇項(xiàng)目前期，我們用氣相色 普法分析發(fā)酵液中的1，3_丙二醇含量，但其重現(xiàn)性較差等，不能滿足工藝的需要。后來，我 們逐步建立了 HPLC分析方法。該分析方法操作簡便簡單，準(zhǔn)確度高，可以同時(shí)分析1，3-丙 二醇發(fā)酵液中1，3-丙二醇、甘油、乙酸、乙醇、2, 3-丁二醇、乳酸和琥珀酸的含量，對生物發(fā) 酵工藝起到了很大的指導(dǎo)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于能夠提供一種快速、簡便、實(shí)用的分析方法，能夠同時(shí)定量分析 1，3-丙二醇發(fā)酵液中1，3-丙二醇、甘油、乙酸、乙醇、2, 3-丁二醇、乳酸和琥珀酸的含量，對 發(fā)酵工藝起指導(dǎo)作用，提高1，3-丙二醇的發(fā)酵收率。
[0005] 本發(fā)明提供一種定量分析方法，用于同時(shí)定量分析1，3-丙二醇發(fā)酵液中1，3-丙 二醇、甘油、乙酸、乙醇、2, 3-丁二醇、乳酸和琥珀酸，包括下述步驟：
[0006] (a)樣品的處理
[0007] 取經(jīng)離心除去克雷伯菌體和高蛋白的1，3-丙二醇發(fā)酵液，用載液進(jìn)行稀釋，過 濾，得到待測樣品；
[0008] (b)液相色譜分離條件的確定
[0009] 色譜柱為配位體交換柱子，采用示差折光率檢測儀，配位體交換柱子在進(jìn)樣前進(jìn) 行活化；
[0010] (C)進(jìn)樣檢測
[0011] 將步驟（a)得到的待測樣品進(jìn)樣至經(jīng)步驟（b)活化后的配位體交換柱子進(jìn)行檢 測；
[0012] (d)計(jì)算
[0013] 以外標(biāo)法計(jì)算所述1，3-丙二醇、甘油、乙酸、乙醇、2, 3- 丁二醇、乳酸和琥珀酸的 含量。
[0014] 其中，所述步驟（a)中過濾時(shí)使用的濾膜孔徑優(yōu)選在0. 22 μπι以下。
[0015] 所述步驟（b)中示差折光率檢測儀的檢測器溫度優(yōu)選為60°C。
[0016] 所述步驟（b)中活化條件為：流動(dòng)相流速優(yōu)選為0. 6mL/min、柱溫優(yōu)選為65°C條件 下，活化時(shí)間優(yōu)選150個(gè)小時(shí)以上。
[0017] 所述步驟（c)中檢測條件為：流動(dòng)相優(yōu)選為0. 005mol/L的硫酸水溶液，流速優(yōu)選 為0. 6mL/min，柱溫優(yōu)選為65°C，進(jìn)樣量優(yōu)選為20 μ L。
[0018] 本發(fā)明適用于以甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的控制分析方法。
[0019] 本發(fā)明有益效果：
[0020] 本發(fā)明分析方法操作簡便簡單，易實(shí)現(xiàn)，準(zhǔn)確度高，可以同時(shí)分析1，3-丙二醇發(fā) 酵液中1，3-丙二醇、甘油、乙酸、乙醇、2, 3-丁二醇、乳酸和琥珀酸的含量，對生物發(fā)酵工藝 起到了很大的指導(dǎo)作用。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :實(shí)例1條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖（1 一檸檬酸；2-琥珀酸；3-乳酸；4一甘油 5-乙酸；6 - 1，3-丙二醇；7、8 -2, 3- 丁二醇；9一乙醇）；
[0022] 圖2 :實(shí)例2條件下發(fā)酵液的色譜圖（1 一檸檬酸；2-琥珀酸；3-乳酸；4一甘油 5-乙酸；6 - 1，3-丙二醇；7、8 -2, 3- 丁二醇；9一乙醇）；
[0023] 圖3 :實(shí)例2條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖（1 一檸檬酸；2-琥珀酸；3-乳酸；4一甘油 5-乙酸；6 - 1，3-丙二醇；7、8 -2, 3- 丁二醇；9一乙醇）；
[0024] 圖4 :實(shí)例2條件下發(fā)酵液的色譜圖（1 一檸檬酸；2-琥珀酸；3-乳酸；4一甘油 5-乙酸；6- 1，3-丙二醇；7、8- 2, 3-丁二醇；9一乙醇）。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例，下列實(shí)施 例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0026] 濾臘孔釋：
[0027] 過濾時(shí)使用的濾膜孔徑在0. 22 μ m以下
[0028] 在本發(fā)明中，對濾膜孔徑并無特別限定，通常過濾時(shí)使用的濾膜孔徑在0. 22 μ m 以下，如果過濾時(shí)使用的濾膜孔徑大于0. 22 μ m，則造成堵塞或污染液相色譜柱子，將導(dǎo)致 柱前壓升高并影響分離效果。
[0029] 示差折光率檢測儀的檢測器淵度：
[0030] 在本發(fā)明中，對示差折光率檢測儀的檢測器溫度并無特別限定，通常示差折光率 檢測儀的檢測器溫度為60°C，如果不是60°C，會(huì)出現(xiàn)溫度太高會(huì)產(chǎn)生氣泡，增加噪聲，影響 靈敏度；而溫度太低會(huì)出現(xiàn)流動(dòng)相粘度增大，阻力增高，檢測儀池子受壓增加，損壞檢測儀。
[0031] 步驟（b)中活化條件:
[0032] 在本發(fā)明中，對步驟（b)中活化條件并無特別限定，通常流動(dòng)相流速為0.6mL/ min、柱溫為65°C條件下，活化150個(gè)小時(shí)以上；在此條件下活化，能夠提高液相色譜柱子的 分離能力；如果流動(dòng)相流速不是〇. 6mL/min、柱溫不是65°C條件下，活化則不能滿足測量條 件，不能得到正確的測量結(jié)果，得不到本文中的精密度和準(zhǔn)確度。
[0033] 步驟（c)中檢測條件:
[0034] 在本發(fā)明中，對步驟（c)中檢測條件并無特別限定，通常步驟（c)中檢測條件為： 流動(dòng)相為〇. 〇〇5mol/L的硫酸水溶液，流速為0. 6mL/min，柱溫為65°C，進(jìn)樣量為20 μ L ;選 擇此條件的有益點(diǎn)是分離效果好，定量準(zhǔn)確；若改變步驟（c)中檢測條件，選擇其他條件， 不能夠分離混合物中的各種成分，影響定性、定量分析，并無其他益處。
[0035] 主要儀器：
[0036] 日本島津LC-10AT高效液相色譜栗、
[0037] RID-10A不差折光率檢測儀、
[0038] 日本島津C0T-10A柱箱、
[0039] 日本島津C-R6A積分儀、
[0040] 大連化物所6J-60IF六通閥進(jìn)樣器（樣品勺的體積為20 μ L)、
[0041 ] 50 μ L微量平頭注射器、
[0042] 美國Millipore公司Milli-Q型超純水器、
[0043] Elix 10 純水器、
[0044] 色譜柱為PL Hi-Plex H[300mm*7. 7mm I.D.，8μπι，英國聚合物實(shí)驗(yàn)室有限公司 (Polymer Laboratories Ltd，UK)生產(chǎn)];
[0045] 主要試劑：
[0046] 甘油（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠）、
[0047] 無水乙酸鈉（分析純，天津石英鐘廠霸州市化工分廠）、
[0048] 1，3-丙二醇（分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司）、
[0049] 乙醇（分析純，沈陽新興試劑廠）、
[0050] 檸檬酸（分析純，北京化工廠）、
[0051] 琥泊酸（分析純，Sigma-Aldrich Laborchemikalien Gmb H. D-30926 Seelze， COUNTRY OF ORIGIN GERMANY)、
[0052] 乳酸（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）、
[0053] 2, 3- 丁二醇（化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、
[0054] 硫酸（優(yōu)級純，北京市北郊化工廠）、
[0055] 水是經(jīng)過純水器之后再經(jīng)超純水器產(chǎn)出的水。
[0056] 實(shí)施例1
[0057] (a)樣品的處理
[0058] 取經(jīng)離心（12000r/min, 20min)除去克雷伯菌體和高蛋白的1，3-丙二醇發(fā)酵液 742. lmg于25mL容量瓶中，用載液進(jìn)行稀釋至刻度，然后以0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，得到 待測樣品；
[0059] (b)液相色譜分離條件的確定
[0060] 色譜柱為配位體交換柱子，其活化條件為：流動(dòng)相流速為0. 6mL/min、柱溫為65°C 條件下，活化150個(gè)小時(shí)；采用示差折光率檢測儀，示差折光率檢測儀的檢測器溫度為 60 °C ；
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