磷光報(bào)告物的制作方法
【專利說(shuō)明】磯光報(bào)告物
[0001] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究/開(kāi)發(fā)的聲明
[0002] 本發(fā)明是在政府支持下由國(guó)家衛(wèi)生研究院授予的基金號(hào)U54 AI057156資助完成。 政府對(duì)本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
[0003] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0004] 本申請(qǐng)要求2013年8月19日向美國(guó)專利商標(biāo)局提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/ 867，263的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文。
[00化]戦
[0006] 已經(jīng)使用各種測(cè)試和檢測(cè)方法來(lái)特異性檢測(cè)不同應(yīng)用中的多種類(lèi)型的分析物，如 醫(yī)學(xué)診斷、食品安全和質(zhì)量保證、W及環(huán)境監(jiān)測(cè)?，F(xiàn)有的利用分析報(bào)告物的方法和系統(tǒng)在低 資源設(shè)置中的成本、效率、靈敏度、通用性和可配置性方面存在多種限制。因此，需要更有效 的技術(shù)和傳感方法來(lái)克服運(yùn)些限制。
[0007] 發(fā)明概述
[000引在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及包含憐光報(bào)告物的物質(zhì)的新組合物。在一些實(shí)施 方式中，憐光報(bào)告物是小憐光顆粒，如無(wú)機(jī)憐光體。在一些實(shí)施方式中，無(wú)機(jī)憐光體具有超 過(guò)10微秒，并優(yōu)選超過(guò)1分鐘的發(fā)光壽命。在一些實(shí)施方式中，無(wú)機(jī)憐光體具有足夠長(zhǎng)的壽 命使得可用合適激發(fā)波長(zhǎng)的光源簡(jiǎn)短地激發(fā)顆粒，然后W足夠高的強(qiáng)度W比激發(fā)源更長(zhǎng)的 波長(zhǎng)發(fā)光，并在激發(fā)后持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間用于時(shí)間分辨發(fā)光測(cè)量或成像。
[0009] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的憐光報(bào)告物包括侶酸鎖。在一些實(shí)施方式中，侶酸鎖 滲雜館和鋪(SrAb〇4:Eu2%Dy 3+)或一種或多種稀±金屬的組合，優(yōu)選銅系。在一些實(shí)施方式 中，本發(fā)明的憐光報(bào)告物包括通過(guò)在無(wú)機(jī)基質(zhì)材料（inorganic host material)中合適地 滲雜稀±或過(guò)渡金屬產(chǎn)生的無(wú)機(jī)憐光體。在一些實(shí)施方式中，無(wú)機(jī)基質(zhì)材料可包括，但不限 于，硫化鋒、硫化巧、堿±金屬娃酸鹽(例如，娃酸被、娃酸巧、娃酸儀和娃酸領(lǐng)）、堿±金屬侶 酸鹽（例如，侶酸巧、侶酸儀、侶酸被和侶酸領(lǐng)儀）、鐵酸鹽（例如，鐵酸巧、鐵酸儀、和鐵酸 鉛），及其組合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的憐光報(bào)告物可包括滲雜金屬W改變電子結(jié)構(gòu)， 生成憐光的無(wú)機(jī)金屬氧化物基質(zhì)材料。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，可用阻隔物或殼，如娃基殼（例如，氧化娃、二氧化娃、娃酸鹽 或有機(jī)官能硅烷），氧化侶，其他無(wú)機(jī)金屬氧化物，高度交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，及其組合來(lái)被覆 或包封憐光報(bào)告物。在一些實(shí)施方式中，覆層或包封可有助于防止由與周?chē)h(huán)境中的水或 化學(xué)物，或化合物的反應(yīng)導(dǎo)致的憐光忍的發(fā)光性質(zhì)的損失或降解。在一些實(shí)施方式中，可通 過(guò)Stober法或S識(shí)ber法的修改形式來(lái)進(jìn)行被覆或包封。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，可用水溶性部分，如聚乙二醇或親水性聚合物被覆或功能化 本發(fā)明的憐光報(bào)告物W使得所述報(bào)告物易于在水或水性溶液中分散。在一些實(shí)施方式中， 可用降低分析試驗(yàn)或測(cè)試中的非特異性結(jié)合的部分被覆或功能化憐光報(bào)告物。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，可用分子識(shí)別元件，如抗體或適體來(lái)修飾本發(fā)明的憐光報(bào)告 物。在一些實(shí)施方式中，分子識(shí)別元件可共價(jià)連接至憐光報(bào)告物。在一些實(shí)施方式中，分子 識(shí)別元件可非共價(jià)連接至憐光報(bào)告物，如通過(guò)物理吸附。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的憐光報(bào)告物可與接頭相聯(lián)，如=乙氧基甲娃烷基下 醒(TESBA)、聚乙二醇(PEG)、（3-氨丙基)S乙氧基硅烷(APTES)、燒控等。在一些實(shí)施方式 中，與二氧化娃表面結(jié)合并且也具有與其他分子偶聯(lián)的官能基團(tuán)的反應(yīng)性硅烷接頭可附于 憐光報(bào)告物的表面。在一些實(shí)施方式中，市售的帶有用于與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的反應(yīng)性官能基團(tuán) 的=烷氧基硅烷聚乙二醇分子可直接連接至憐光報(bào)告物的無(wú)機(jī)二氧化娃或氧化侶表面。在 一些實(shí)施方式中，可在用水溶性部分被覆憐光報(bào)告物之前、期間或之后將接頭偶聯(lián)至憐光 報(bào)告物。例如，在一些實(shí)施方式中，憐光報(bào)告物可用反應(yīng)性硅烷被覆，并隨后用聚乙二醇偶 聯(lián)。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，可用其表面上的各種官能團(tuán)官能化憐光報(bào)告物。示例性的官 能團(tuán)包括，但不限于，胺基、簇基、醒、酬、徑基、硫醇、酷阱、酸酢、締控、烘控、疊氮化物，及其 組合。在更具體的實(shí)施方式中，官能化的憐光報(bào)告物可直接偶聯(lián)至通過(guò)用高艦酸鹽氧化抗 體Fc部分上的多糖在抗體上產(chǎn)生的醒。在其他實(shí)施方式中，特異性結(jié)合抗體的Fc部分的蛋白 A或其他蛋白質(zhì)可連接至憐光報(bào)告物的表面，并然后用于W定向的方式結(jié)合抗體，W改善憐 光報(bào)告物的結(jié)合效率。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，憐光報(bào)告物可W是顆粒的形式。在一些實(shí)施方式中，顆粒的尺 寸范圍是約 1 OOOnm、600nm、400nm、300nm、200nm、1 OOnm 或 50nm。
[0016] 本發(fā)明的其他實(shí)施方式設(shè)及制備前述憐光報(bào)告物的方法。在一些實(shí)施方式中，該 方法包括，通過(guò)濕研磨和沉降聯(lián)用來(lái)減小無(wú)機(jī)憐光粉末的尺寸。例如，在一些實(shí)施方式中， 用球磨機(jī)或罐磨機(jī)進(jìn)行濕研磨。然后，將干燥無(wú)機(jī)憐光粉末分散在液體中，并在研磨介質(zhì) (例如，由堅(jiān)硬、致密材料如氧化錯(cuò)組成的研磨介質(zhì))存在下放置在陶瓷、金屬或塑料研磨罐 中并研磨。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，在有機(jī)溶劑如乙酸乙醋、甲苯、環(huán)己燒、環(huán)戊燒、癸燒及其組合 存在下進(jìn)行濕研磨。在一些實(shí)施方式中，有機(jī)溶劑是疏水性的并且具有低吸濕性。在一些實(shí) 施方式中，有機(jī)溶劑并不影響無(wú)機(jī)材料的發(fā)光。在一些實(shí)施方式中，在醇，如乙醇、異丙醇、 下醇或其組合存在下進(jìn)行濕研磨。
[0018] 在其他實(shí)施方式中，可使用替代性研磨技術(shù)和設(shè)備來(lái)減小無(wú)機(jī)憐光粉末的平均粒 度。在一些實(shí)施方式中，運(yùn)類(lèi)技術(shù)包括，但不限于，冷凍研磨、振動(dòng)研磨、珠磨、干燥研磨、磨 擦研磨、噴射研磨、磨碎及其組合。在一些實(shí)施方式中，可使用除沉降W外的分級(jí)分離 (打act ionat ion)技術(shù)(例如，篩分、場(chǎng)流分級(jí)分離、切向流分離)來(lái)分離更窄的粒度分布。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及一種用于檢測(cè)樣品內(nèi)至少一種分析物的方法。運(yùn) 種方法包括提供憐光報(bào)告物的步驟。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括將憐光報(bào)告物與樣 品接觸。在一些實(shí)施方式中，該方法包括檢測(cè)憐光報(bào)告物的發(fā)光信號(hào)的步驟。在一些實(shí)施方 式中，該方法包括確定分析物存在并基于檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)對(duì)分析物進(jìn)行定量的步驟。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及一種用于體外檢測(cè)樣品內(nèi)至少一種分析物的方 法。運(yùn)種方法包括提供憐光報(bào)告物的步驟。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括將憐光報(bào)告物 加載到多孔材料中。在一些實(shí)施方式中，該方法包括將樣品與加載了憐光報(bào)告物的多孔材 料接觸。在一些實(shí)施方式中，該方法包括使樣品和憐光報(bào)告物流動(dòng)通過(guò)多孔膜。在一些實(shí)施 方式中，該方法包括檢測(cè)膜上的發(fā)光區(qū)域或發(fā)光的缺失，W指示存在或缺少至少一種分析 物。
[0021] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及一種用于體外檢測(cè)樣品內(nèi)至少一種分析物的方 法。運(yùn)種方法包括W下步驟:提供憐光報(bào)告物;并提供固定在表面上的至少一種第一分子識(shí) 別元件，其中固定的分子識(shí)別元件能夠結(jié)合至至少一種分析物。在一些實(shí)施方式中，該方法 還包括將樣品與表面接觸W允許至少一種分析物結(jié)合分子識(shí)別元件，W固定分析物。在一 些實(shí)施方式中，該方法包括將憐光報(bào)告物與表面接觸，W使憐光報(bào)告物結(jié)合至少一種固定 的分析物;并且測(cè)量來(lái)自憐光報(bào)告物的發(fā)光信號(hào)，W允許檢測(cè)或定量分析物。
[0022] 在一些實(shí)施方式中，所述表面包括微流體忍片，或紙微流體，或膜，或微板，或用于 浮選的微氣泡、或透明表面。在一些實(shí)施方式中，憐光報(bào)告物包括至少一種無(wú)機(jī)憐光顆粒、 包封至少一種憐光顆粒的殼，和位于殼上的第二分子識(shí)別部分。在一些實(shí)施方式中，第二分 子識(shí)別部分結(jié)合至少一種固定的分析物W生成發(fā)光信號(hào)。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及磁性憐光報(bào)告物。在一些實(shí)施方式中，磁性憐光報(bào) 告物包括至少一種無(wú)機(jī)憐光顆粒。在一些實(shí)施方式中，磁性憐光報(bào)告物包括包封至少一種 無(wú)機(jī)憐光顆粒的殼和位于殼上的至少一種磁性部分。在一些實(shí)施方式中，磁性憐光報(bào)告物 包括位于殼上的至少一種分子識(shí)別部分。在一些實(shí)施方式中，無(wú)機(jī)憐光顆粒形成憐光報(bào)告 物的忍。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，磁性憐光報(bào)告物包括至少一種無(wú)機(jī)憐光顆粒和至少一種磁性 顆?；虼判圆牧蠈?。在一些實(shí)施方式中，殼包封至少一種無(wú)機(jī)憐光顆粒和至少一種磁性顆 粒或磁性材料層。在一些實(shí)施方式中，磁性憐光報(bào)告物包括位于殼上的至少一種分子識(shí)別 部分。在一些實(shí)施方式中，無(wú)機(jī)憐光顆粒和至少一種磁性顆粒或磁性層形成憐光報(bào)告物的 忍。
[0025] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及一種用于檢測(cè)樣品內(nèi)至少一種分析物的方法。運(yùn) 種方法包括提供磁性憐光報(bào)告物。在一些實(shí)施方式中，磁性憐光報(bào)告物包括至少一種無(wú)機(jī) 憐光顆粒和至少一種磁性顆?；虼判圆牧蠈印Ｔ谝恍?shí)施方式中，磁性憐光報(bào)告物還包括 包封至少一種無(wú)機(jī)憐光顆粒和至少一種磁性顆?；虼判圆牧蠈拥臍?。在一些實(shí)施方式中， 報(bào)告物包括針對(duì)位于殼上的分析物有特異性的至少一種第一分子識(shí)別部分。
[00%]在一些實(shí)施方式中，該方法還包括將前述磁性憐光報(bào)告物與樣品接觸。在一些實(shí) 施方式中，該方法包括通過(guò)使用磁場(chǎng)來(lái)濃縮磁性憐光報(bào)告物。在一些實(shí)施方式中，該方法包 括將濃縮的磁性憐光報(bào)告物與表面接觸。在一些實(shí)施方式中，用針對(duì)分析物有特異性的至 少一種第二分子識(shí)別部分來(lái)使表面功能化。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括檢測(cè)磁性憐 光報(bào)告物的發(fā)光信號(hào);和，基于檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)來(lái)確定分析物存在或?qū)Ψ治鑫锒俊Ｔ谝?些實(shí)施方式中，第一分子識(shí)別部分結(jié)合至少一種分析物W生成發(fā)光信號(hào)。
[0027]在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及在各種方案設(shè)置(setting)中，如診斷方案設(shè)置中 檢測(cè)憐光報(bào)告物的方法(例如，圖31)。在一些實(shí)施方式中，該方法包括檢測(cè)來(lái)自憐光報(bào)告物 的發(fā)光。在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)激發(fā)憐光報(bào)告物來(lái)檢測(cè)來(lái)自憐光報(bào)告物的發(fā)光。在多個(gè) 實(shí)施方式中，可通過(guò)電子、磁場(chǎng)、光子或其組合來(lái)激發(fā)憐光報(bào)告物。在一些實(shí)施方式中，使用 波長(zhǎng)選擇性機(jī)制在激發(fā)的同時(shí)檢測(cè)發(fā)光。在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)施加熱來(lái)增強(qiáng)發(fā)光。在 一些實(shí)施方式中，可在激發(fā)停止的1、10、100、1000或10000000毫秒內(nèi)檢測(cè)到發(fā)光。在一些實(shí) 施方式中，可通過(guò)電子機(jī)制、光學(xué)機(jī)制、光電子機(jī)制、機(jī)械遮蔽、旋轉(zhuǎn)、流動(dòng)或重新定位機(jī)制 來(lái)檢測(cè)發(fā)光。
[0028] 在一些實(shí)施方式中，通過(guò)用膜基或數(shù)字照相機(jī)(例如，帶CM0S、CCD或其他類(lèi)型的傳 感器的數(shù)字照相機(jī))成像，發(fā)光被用來(lái)定性或定量地獲得試驗(yàn)中的信號(hào)。在一些實(shí)施方式 中，可用發(fā)光計(jì)、巧光計(jì)、分光光度計(jì)或能夠測(cè)量光強(qiáng)度的其他類(lèi)似設(shè)備來(lái)測(cè)量發(fā)光。
[0029] 在一些實(shí)施方式中，可使用手機(jī)，智能手機(jī)，或便攜式電子裝置，諸如但不限于平 板電腦、個(gè)人數(shù)字助理或筆記本電腦來(lái)檢測(cè)來(lái)自憐光報(bào)告物的發(fā)光，用于定性或定量試驗(yàn) 讀取。在一些實(shí)施方式中，手機(jī)或便攜式電子裝置可與附屬裝置禪合，W允許檢測(cè)來(lái)自憐光 報(bào)告物的發(fā)光，W檢測(cè)來(lái)測(cè)試樣品中是否存在分析物。
[0030] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及增強(qiáng)憐光報(bào)告物的檢測(cè)的方法。在一些實(shí)施方式 中，使用平均技術(shù)，如圖36-40所示的那些來(lái)在檢測(cè)分析物是否存在的試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)來(lái)自所用 憐光報(bào)告物的發(fā)光信號(hào)的更高信噪比。
[0031] 在一些實(shí)施方式中，可在多種試驗(yàn)方案設(shè)置中使用本發(fā)明的憐光報(bào)告物。在一些 實(shí)施方式中，試驗(yàn)方案設(shè)置可包括但不限于，橫向流動(dòng)，表面-結(jié)合試驗(yàn)，流通試驗(yàn)，與漂浮 材料相關(guān)的試驗(yàn)，或用于濃縮或力壓縮的與磁性材料相關(guān)的試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā) 明設(shè)及包含憐光報(bào)告物的物質(zhì)和多孔膜(諸如但不限于硝酸纖維素、玻璃纖維和棉花纖維） 的組合物。在一些實(shí)施方式中，在用于分析物檢測(cè)的試驗(yàn)中使用包含憐光報(bào)告物的物質(zhì)和 多孔膜的組合物。
[00創(chuàng)附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0033] 圖1顯示了在不同波長(zhǎng)下發(fā)射的侶酸鎖憐光粉末的不同樣品。材料的不同顏色允 許進(jìn)行基于光譜的多重試驗(yàn)。
[0034] 圖2顯示了購(gòu)得的侶酸鎖憐光粉末的能量色散X-射線光譜化DS)數(shù)據(jù)，標(biāo)出了 C、0、 Al、Dy、S;rXa、Eu 和 Dy 的峰。
[0035] 圖3A-3B顯示了各種方案。示意性地顯示了用于通過(guò)一般罐磨機(jī)或球磨機(jī)減小憐 光顆粒的尺寸的研磨工藝（圖3A)。繪圖顯示了可能會(huì)在研磨期間導(dǎo)致壓裂和尺寸減小的顆 粒的各種缺陷（圖3B)(改自陶瓷加工原理介紹（Introduction the Principles of Ceramic Processing)-]".Reed，1988)。
[0036] 圖4顯示了用Retsch MM301高速混合研磨機(jī)在不誘鋼研磨罐中在乙醇中濕研磨之 后侶酸鎖憐光粉末的圖像。侶酸鎖顯示對(duì)于不誘鋼球和罐而言磨蝕性太強(qiáng)，導(dǎo)致鋼顆粒明 顯污染產(chǎn)品，產(chǎn)生灰色。用其他研磨流體來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，W確保污染是來(lái)自對(duì)鋼物理磨損的機(jī) 械作用，而不是化學(xué)現(xiàn)象。
[0037] 圖5顯示了侶酸鎖憐光顆粒的光學(xué)顯微圖像。（A)最細(xì)級(jí)別的市售侶酸鎖粉末，有 效顆粒直徑超過(guò)SOwiiD(B)濕研磨后侶酸鎖憐光顆粒產(chǎn)生直徑低于IOwii的顆粒。
[0038] 圖6顯示了研磨的侶酸鎖憐光顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。相當(dāng)大部分的顆 粒具有亞微米直徑。
[0039] 圖7顯示了綠色侶酸鎖憐光體的發(fā)射光譜，W及在激發(fā)后幾秒拍攝的研磨的憐光 顆粒的膠體分散體的照片。研磨的顆粒沒(méi)有快速沉降，并且也保留了長(zhǎng)的發(fā)光壽命。
[0040] 圖8顯示了研磨的和尺寸分級(jí)的侶酸鎖憐光體的粒度分布。用懸浮的微通道共振 器設(shè)備來(lái)獲得數(shù)據(jù)。
[0041 ] 圖9顯示了四乙氧基硅烷(TEOS)和水反應(yīng)生成二氧化娃，并顯示隨著二氧化娃層 隨時(shí)間的生長(zhǎng)，初始半徑為ro且總半徑為r(t)的憐光顆粒的二氧化娃包封的示意圖。
[0042] 圖10顯示了四乙氧基硅烷及其在二氧化娃包封過(guò)程中的水解產(chǎn)物的瞬時(shí)濃度的 模型預(yù)測(cè)。顯示了初始水濃度的兩種不同的起始條件。（左）5體積％的起始水濃度。（右)20 體積％的起始水濃度。
[0043] 圖11顯示了隨時(shí)間變化的、針對(duì)初始水濃度的不同起始條件計(jì)算的環(huán)繞起始直徑 為500nm的顆粒周?chē)亩趸逇ず穸取?br>[0044] 圖12顯示了用不同摩爾比的水與四乙氧基硅烷的二氧化娃包封實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。來(lái)自 不同包埋方案的顆粒在純水中重懸，W形成相同濃度的膠體，并且測(cè)量隨時(shí)間變化的發(fā)光 W觀察二氧化娃殼對(duì)防止水解的效果。（左)20mM四乙氧基硅烷，0.5M氨，（右)40mM四乙氧基 硅烷，0.5M氨。
[0045] 圖13顯示了裸的未包封的侶酸鎖憐光顆粒和二氧化娃包封的侶酸鎖憐光體的XPS 譜。
[0046] 圖14顯示了二氧化娃包封的侶酸鎖憐光體，和用中性親和素(Neu化Avidin)功能 化的二氧化娃包封的憐光體的譜。
[0047] 圖15顯示了 PEG官能化的二氧化娃包封的侶酸鎖憐光體的粒度分布。用尺寸可調(diào) 納米孔設(shè)備(IZON)來(lái)獲取數(shù)據(jù)。
[004引圖16是顯示使二氧化娃包封的憐光顆粒與S乙氧基甲娃烷基下醒(TESBA)反應(yīng)， W引入供于部分與表面的共價(jià)連接的表面醒的反應(yīng)的示意圖。
[00例圖17顯示了通過(guò)由TESBA引入的表面醒和來(lái)自蛋白質(zhì)的胺之間的還原胺化而帶有 偶合至表面的抗體的二氧化娃包封的憐光報(bào)告物的示意圖。
[0050] 圖18A-18B顯示了用如圖17所示功能化的抗-溶菌酶曲肥心5憐光報(bào)告物進(jìn)行的憐 光體LFA實(shí)驗(yàn)。2個(gè)標(biāo)記V'的LFA試條具有通過(guò)將雞蛋溶菌酶直接點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜上制 備的測(cè)試線。標(biāo)記的試條是沒(méi)有溶酶體的陰性對(duì)照。亮場(chǎng)照明下的LFA試條（圖18A)。光 激發(fā)和發(fā)光成像模式之后的LFA試條(圖18B)。
[0051] 圖19顯示了采用抗-溶菌酶Dl.3測(cè)試線的憐光體LFA實(shí)驗(yàn)。在特定濃度下使用雞蛋 溶菌酶化EU牛血清白蛋白（BSA)作為分析物。如圖17所示的功能化的抗-溶菌酶曲肥心5憐 光顆粒用作報(bào)告物。
[0052] 圖20顯示了用在所有試條中用雞蛋溶菌酶直接點(diǎn)樣在膜上作為測(cè)試線的憐光體 LFA實(shí)驗(yàn)。（左)抗-溶菌酶曲肥心5憐光體用作報(bào)告物(右)二氧化娃包封的憐光體用作對(duì)照， W評(píng)價(jià)表面部分對(duì)憐光報(bào)告物通過(guò)膜的運(yùn)輸?shù)挠绊憽?br>[0053] 圖21顯示點(diǎn)樣在化Sion 5玻璃纖維膜上的溶菌酶測(cè)試線的憐光體LFA實(shí)驗(yàn)，有6個(gè) 重復(fù)?？?溶菌酶曲肥心5憐光體用作報(bào)告物。
[0054] 圖22A-22C顯示，利用用來(lái)自TESBA的憐光體上的表面醒的還原性胺化作用，用生 物素-PEG-胺官能化的憐光報(bào)告物的示意圖（圖22A)。用中性親和素測(cè)試線官能化并且用生 物素-PEG憐光體作為報(bào)告物運(yùn)行的LFA試條的亮場(chǎng)圖像（圖22B)。顯示來(lái)自結(jié)合的生物素-PEG憐光報(bào)告物的測(cè)試線的發(fā)光的LFA試條的暗場(chǎng)圖像（圖22C)。左起第2試條和第4試條沒(méi) 有用憐光體點(diǎn)樣，W顯示從第1試條和第3試條的測(cè)試線發(fā)出的光來(lái)自憐光體而不是來(lái)自在 測(cè)試線上吸附的蛋白質(zhì)。
[0055] 圖23顯示了帶有通過(guò)帶末端簇酸基團(tuán)的接枝PEG部分與抗體上的伯氨基之間的碳 二亞胺化學(xué)反應(yīng)形成的酷胺鍵共價(jià)連接的抗體的憐光報(bào)告物。陽(yáng)G通過(guò)與來(lái)自TESBA的醒的 還原性胺化作用枝接憐光報(bào)告物。
[0056] 圖24是顯示通過(guò)抗-溶菌酶抗體和中性親和素憐光報(bào)告物之間的夾屯、法檢測(cè)生物 素化的溶菌酶的示意圖。
[0057] 圖25顯示了生物素化的溶菌酶分析物、曲肥心5現(xiàn)聯(lián)線、中性親和素-PEG憐光報(bào)告 物，和生物素化的BSA對(duì)照線的LFA實(shí)驗(yàn)。
[005引圖26顯示了圖25中LFA實(shí)驗(yàn)的重復(fù)，還測(cè)試了其它的更低分析物濃度。
[0059] 圖27顯示了用如圖25和圖26所示的中性親和素憐光報(bào)告物和生物素化的溶菌酶 作為分析物，但在測(cè)試線Dl.3處采用不同的單克隆抗-溶菌酶抗體的LFA實(shí)驗(yàn)。
[0060] 圖28顯示了采用圖27所示的中性親和素憐光體、生物素化的溶菌酶分析物、Dl. 3 測(cè)試線和生物素化的BSA對(duì)照線，但采用脫脂奶粉純化(passivize)的膜的LFA實(shí)驗(yàn)。
[0061] 圖29顯示了憐光報(bào)告物的時(shí)間口選或時(shí)間解析的發(fā)光試驗(yàn)的原理。在一段起始時(shí) 間中，來(lái)自憐光顆粒和背景的光強(qiáng)度接近0。應(yīng)用激發(fā)光源導(dǎo)致來(lái)自憐光報(bào)告物的發(fā)光增 加，并且背景發(fā)光同時(shí)含有自體巧光和散射的激發(fā)光。當(dāng)關(guān)閉激發(fā)光時(shí)，背景迅速衰減，而 憐光報(bào)告物信號(hào)緩慢衰減，產(chǎn)生更高的信背比和較低的檢測(cè)限。
[0062] 圖30顯示在方案的進(jìn)一步優(yōu)化之后用圖25和圖26所示的中性親和素憐光報(bào)告物 的LFA實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)限接近10化g/mL。
[0063] 圖31顯示橫跨來(lái)自圖30所示的實(shí)驗(yàn)的LFA試條的寬度的測(cè)試線強(qiáng)度概況。該圖顯 示了對(duì)分析物濃度定量的潛力并且有助于證明低檢測(cè)限。
[0064] 圖32A-32B顯示了檢測(cè)生物素化溶菌酶的LFA中的憐光報(bào)告物和金納米顆粒的比 較。圖32A和圖32B是獨(dú)立試驗(yàn)。
[0065] 圖33顯示了生物素化的溶菌酶分析物和憐光報(bào)告物的LFA實(shí)驗(yàn)的定量分析。作圖 顯示了測(cè)試線與對(duì)照線的強(qiáng)度比隨分析物濃度的變化。
[0066] 圖34是顯示用固定在表面上的捕獲抗體和憐光報(bào)告物，在夾屯、免疫試驗(yàn)中檢測(cè)任 意分析物的一般示意圖。
[0067] 圖35A-35B顯示了用于檢測(cè)分析物的憐光報(bào)告物的浮選試驗(yàn)。浮動(dòng)的物體，如玻璃 微泡，用抗體功能化并且結(jié)合至分析物，所述分析物由于浮動(dòng)物體的漂浮而再位移至液體 頂部（圖35A)。檢測(cè)到來(lái)自液體頂部的發(fā)光，并且，通過(guò)液體內(nèi)的染料吸附來(lái)封閉來(lái)自未結(jié) 合的憐光報(bào)告物的背景發(fā)光。SBl圖像顯示在預(yù)浮選分析試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中結(jié)合至玻璃微泡的憐 光報(bào)告物(圖35B)。
[0068] 圖36A-36B顯示沿側(cè)流試條的長(zhǎng)度向下的線掃描（line scan),其用中性親和素憐 光報(bào)告物和用作分析物的Ing/mL生物素化的溶菌酶運(yùn)行。用iPhone 5s獲取圖像。從來(lái)自單 一圖像的側(cè)流試條的中間開(kāi)始線掃描（圖36A)。從同一側(cè)流試條的中間開(kāi)始，但來(lái)自40個(gè)圖 像的平均的線掃描顯示了源自圖像平均化的噪音減少(圖36B)。
[0069] 圖37顯示了用于獲得高信噪比的LFA試條的線掃描的圖像平均化的替代性方法， 使用采用了與圖36相同的中性親和素憐光報(bào)告物和Ing/mL的生物素化的溶菌酶分析物的 模型系統(tǒng)。在運(yùn)種情況中，單一圖像取自側(cè)流試條，并且對(duì)沿該單一圖像的試條的長(zhǎng)度向下 的多個(gè)線掃描進(jìn)行平均化。
[0070] 圖38顯示了圖37所示的成像平均化方法，但是分析物濃度為0.1 ng/mL。在單個(gè)線 掃描中，噪音遮蔽了測(cè)試線，但是在通過(guò)平均化多個(gè)線掃描來(lái)減少噪音之后，來(lái)自測(cè)試線的 信號(hào)變得易于區(qū)分。
[0071] 圖39A-39B顯示了用iPhone 5s獲取的，采用O.lng/mL生物素化的溶菌酶和中性親 和素憐光報(bào)告物運(yùn)行的LFA試條的灰度圖像。圖39A顯示了單個(gè)圖像。圖39B顯示了 16個(gè)圖像 的平均化。
[0072] 圖40A-40B顯示了檢測(cè)Ing/mL生物素化的溶菌酶的中性親和素憐光報(bào)告物的LFA 結(jié)果。用iPhone 5s獲取的40RGB色圖像的平均圖像(圖40A)。相應(yīng)的強(qiáng)度概況(圖40B)。
[0073] 圖41顯示用于檢測(cè)分析物的本發(fā)明的優(yōu)選方法和實(shí)施方式。憐光報(bào)告物應(yīng)用在側(cè) 流試驗(yàn)中，在分析物存在下結(jié)合在測(cè)試線處。對(duì)照線確保試驗(yàn)正常發(fā)揮功能。憐光報(bào)告物加 載在偶聯(lián)墊中，該偶聯(lián)墊連接至樣品墊。吸收墊發(fā)揮槽的作用W輔助通過(guò)測(cè)試條忍吸液體。
[0074] 圖42顯示了具有電子發(fā)光讀取的側(cè)流試驗(yàn)。側(cè)流試條被部分或完全地夾屯、于2個(gè) 電極之間，其中至少一個(gè)是透明的W允許光透過(guò)。在電極之間施加恒定