泄漏率為50.13%，標準誤為3.48%，95%置 信區(qū)間為[35.15%，65.11%]。經(jīng)t檢驗，4°C處理24h后京欣1號品種子葉氨基酸泄漏率與對 照差異性不顯著（t=l. 151，P>0.05)，而(TC處理24h后氨基酸泄漏率平均值為50.13%，較 對照極顯著增大(t = -12.288，P<0.001)。
[0012] 表2西瓜品種晚豐早成幼苗分別經(jīng)4°C和(TC處理24h氨基酸泄露率的比較
表2表明，對照23/25°C條件下晚豐早成品種平均氨基酸泄漏率為6.02%，標準誤為 0.98%，95%置信區(qū)間為[1.82%，10.26%];4°(：處理2地平均氨基酸泄漏率為5.79%，標準誤為 0.77%，95%置信區(qū)間為[2.47%，9.10%];(TC處理24h平均氨基酸泄漏率為39.31%，標準誤為 1.19%，95%置信區(qū)間為[34.20%，44.20%]。經(jīng)t檢驗，4°C處理24h后晚豐早成品種子葉氨基 酸泄漏率與對照差異性不顯著（t = 0.202，P>0.05)，而(TC處理2地后氨基酸泄漏率平均值 為39.31%，較對照極顯著增大(t二-21.608，P<0.0 Ol)。
[0013] 綜合表1和表2顯示，對照23/25°C條件下和4°C處理2地后，京欣1號和晚豐早成品 種子葉氨基酸泄漏率分別相差0.882%和1.882%，經(jīng)*檢驗差異性均不顯著（* = -0.555，口> 0.05;* = -2.315，？>0.05)，而在0°(：處理2地后，晚豐早成品種子葉氨基酸泄漏率較京欣1 號品種降低10.821%，兩者差異性達到顯著水平(t = 2.941，P<0.05)。W上說明在幼苗期，4 °C持續(xù)2地的寒流對京欣1號和晚豐早成品種幼苗子葉影響均不顯著，但(TC持續(xù)2地的寒流 對京欣1號影響的程度顯著大于對晚豐早成影響的程度，(TC持續(xù)24h的寒流造成京欣1號幼 苗處于半致死狀態(tài)，即子葉受凍害程度因品種而異，晚豐早成品種較京欣1號品種的抗凍性 強，運與生產(chǎn)實際相符合。由此得出，通過對西瓜品種幼苗期子葉氨基酸泄漏率的測定可篩 選出抗寒性強的西瓜品種。
[0014] 實施例2 在中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所分子生物學(xué)實驗室，用本方法對荒漠植物白 刺的抗鹽性進行鑒定，測定試驗重復(fù)2次。
[0015] 本發(fā)明按照W下步驟實施： 1. 試驗準備 根據(jù)試驗處理數(shù)，準備12個IOml帶螺蓋離屯、管，用無離子水洗凈后烘干備用； 2. 準備樣品 將盆栽生長60d的白刺苗用蒸饋水沖洗，用濾紙吸干表面水分，挖出大小一致的3株，將 根分別在清水、1%和10%化化溶液浸泡處理12h，處理結(jié)束，準確稱取各處理屯、葉6份，每份 0.0501-0.0509 g，分別置上述離屯、管； 3. 浸提 在上述含子葉的浸提離屯、管各加入4mL蒸饋水，在室溫條件下浸提2 h，每隔30分鐘輕 搖1次； C.浸提 在b步驟含植物新鮮組織的離屯、管中各加入4血蒸饋水，浸提2-3 h，期間每隔30分鐘輕 搖1次或置搖床輕搖浸提； 4. 離屯、 浸提結(jié)束，立即將浸提管放置在轉(zhuǎn)速為3000rev/min的離屯、機離屯、10分鐘； 5. 去除雜蛋白干擾 吸取浸提管中上清液3.0 ml,轉(zhuǎn)入另一測試管，加入0.3ml的72%(w/v)S氯乙酸(TCA) 溶液，再在轉(zhuǎn)速為3000rev/min的離屯、機離屯、10分鐘，W沉淀去除雜蛋白干擾； 6. 測定鮮葉片的吸光度 將測試管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度計讀取波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm，空 白為蒸饋水，獲得鮮組織在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm，測定結(jié)束，將將比色杯液體回收 倒入原測試管中； 7. 局壓滅殺 將吸取浸提液后含有葉片和Iml浸提液的浸提離屯、管置高壓滅菌鍋滅菌20min，冷卻后 與對應(yīng)測試管浸提液合并； 8. 合并離屯、 將含合并液的殺滅離屯、管在轉(zhuǎn)速為3000rev/min的離屯、機離屯、10分鐘； 9. 測定殺死葉片的吸光度 將上述合并離屯、的滅殺管上清液倒入比色杯，空白為蒸饋水，再次測定吸光度值 Ak280nm，即為殺死樣品在波長280nm的吸光度值A(chǔ)k280nm; 10. 計算氨基酸泄漏率 氨基酸泄漏率為各處理葉片在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm占高壓殺死葉片在波長 280nm的吸光度值A(chǔ)k280nm的比率，按下列公式計算： 氨基酸泄漏率(％)=A280nmX 100/Ak280nm 表3白刺苗抗鹽性鑒定試驗氨基酸泄漏率測定結(jié)果
結(jié)果經(jīng)檢驗表明，將生長60d的白刺苗用濃度為1%化化溶液浸泡處理1化后，白刺葉 片氨基酸泄漏率與對照清水浸泡差異性不顯著（* = 0.550，？>0.05)，兩處理平均氨基酸泄 漏率分別為19.1%和16.3%，而用濃度為10%化化溶液浸泡白刺葉片1化處理后，其氨基酸泄 漏率較清水浸泡白刺葉片對照顯著增大(t = -4.637，P<0.05)，說明1%鹽溶液處理1化對白 刺苗無傷害，而且有利于白刺膜系統(tǒng)加固，但10%化化溶液對白刺苗有較大影響，葉片已受 到傷害，平均氨基酸泄漏率為39.0%，部分葉片已脫落。W上結(jié)果也說明，氨基酸泄漏率指標 可W用來進行植物抗鹽性快速鑒定。
[0016]實施例1-2說明，本發(fā)明通過測定氨基酸泄漏率，可鑒定植物對低溫、鹽害的抗性 程度，運對選育抗寒性和抗鹽性強的植物新品種提供了技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)，有利于植物 品種抗寒性和抗鹽性改良選育的早期鑒定。同時，通過鑒定植物對環(huán)境因子的耐受性，可確 定植物對環(huán)境因子適應(yīng)的范圍，確立新品種適宜推廣的區(qū)域，運對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的田間管理和 作物布局結(jié)構(gòu)的調(diào)整均具有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。本方法可推廣應(yīng)用于植物對低溫、鹽脅 迫的抗性鑒定研究中，也可在其他抗逆性鑒定研究中參考應(yīng)用。
【主權(quán)項】
1. 一種測定植物組織氨基酸泄漏率的方法，其步驟是： a. 試驗準備 根據(jù)試驗處理數(shù)，準備足量5-10ml帶螺蓋離心管，用無離子水洗凈后烘干備用； b. 準備樣品 處理前用蒸餾水沖洗待測植物組織，用濾紙吸干表面水分；處理結(jié)束，準確稱取各處 理植物新鮮組織0.0401-0.0509 g，置a步驟準備的離心管中； c.浸提 在b步驟含植物新鮮組織的離心管中各加入4mL蒸餾水，在室溫條件下，浸提2-3 h，搖 床輕搖浸提3 h; d. 離心 浸提結(jié)束，立即將c步驟的浸提管放置在轉(zhuǎn)速為300〇rev/min的離心機離心5-10分鐘； e. 去除雜蛋白干擾 上述d步驟離心結(jié)束，吸取浸提管中的上清液3.0 ml，轉(zhuǎn)入另一測試管，加入0.3ml的 72%(w/v)三氯乙酸溶液，再在3000rev/min離心5-10分鐘，以沉淀去除雜蛋白干擾； f. 測定鮮組織的吸光度 將e步驟離心后的測試管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度計讀取波長280nm的吸光 度值A(chǔ)280nm，空白為蒸餾水，獲得鮮組織在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm，測定后將比色杯 液體倒回測試管中； g. 尚壓滅殺 將e步驟吸取上清液后留有植物組織和lml浸提液的浸提管上蓋置高壓滅菌鍋滅殺 20min，浸提管稱滅殺管； h. 合并離心 將e步驟測試管測試液全部回倒入其g步驟對應(yīng)滅殺管中，合并后再在300〇rev/min離 心5-10分鐘，以沉淀去除雜蛋白干擾； i. 測定殺死組織的吸光度 將上述h步驟合并離心的滅殺管上清液倒入比色杯，空白為蒸餾水，再次測定吸光度值 Ak280nm，即為殺死樣品在波長280nm的吸光度值A(chǔ)k280nm; j. 計算氨基酸泄漏率 氨基酸泄漏率為各處理鮮組織在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm占殺死樣品在波長 280nm的吸光度值A(chǔ)k280nm的比率，按下列公式計算： 氨基酸泄漏率(％)=A280nmX 100/Ak280nm。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種測定植物細胞氨基酸泄漏率的方法，其步驟包括a.試驗準備；b．準確稱樣；c．浸提；d．離心；e．去除雜蛋白干擾；f．測定吸光度；g．計算氨基酸泄漏率。利用本方法測定生物細胞氨基酸泄漏率簡單方便，整個測定工作耗時不到3.5h，可對一次試驗中各處理成批測定，處理間可比性強，穩(wěn)定性好，誤差小，在植物抗逆性研究中應(yīng)用性廣，可推廣應(yīng)用于植物對高溫、低溫、輻射、重金屬、鹽害、干旱抗逆性鑒定研究中，也可應(yīng)用于生物細胞對其他非生物脅迫因子的抗逆性鑒定研究中。
【IPC分類】G01N21/33
【公開號】CN105717057
【申請?zhí)枴緾N201610068943
【發(fā)明人】陳翔
【申請人】中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2016年2月1日