一種用于檢測豬圓環(huán)病毒2型的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸病檢測領(lǐng)域，特別涉及豬圓環(huán)病毒2型的核衣殼蛋白的單克隆抗體 及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒（Circoviridae，Circovirus，Porcine circovirus，PCV)是迄今發(fā) 現(xiàn)的一種最小的動物病毒，已知的PCV有兩個血清型，即PCV1和PCV2,其中PCV1沒有致病 性，PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PWMS)的主要病原，它不僅可以引起斷奶仔豬發(fā) 生衰竭、死亡，還與仔豬A2型先天震顫（A2CT)、豬繁殖障礙、豬皮炎腎炎綜合征（PDNS)、增 生性壞死性肺炎（PNP)和呼吸道疾病綜合征（PRDS)有關(guān)，這些疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病 (PCVD)。這些疾病的廣泛流行嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給許多國家和地區(qū)帶來了巨大的 損失。更為嚴(yán)重的是PCV2的感染可以降低抵抗力和免疫應(yīng)答反應(yīng)，引起其它各種病原微生 物的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估計。目前，PCV2已成為嚴(yán)重阻礙我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的 重要病原之一。
[0003] PCV2及其相關(guān)的豬的疾病已在世界范圍內(nèi)發(fā)生和流行，死亡率10%~30%不等， 較嚴(yán)重的地區(qū)，豬場在爆發(fā)本病時死亡淘汰率高達(dá)40%，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā) 展。而且，臨床上PCV2的感染普遍存在，但多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染和亞臨床感染，常易被忽 視，在豬群受到應(yīng)激反應(yīng)后，可能導(dǎo)致PCV2的爆發(fā)，因此，做好PCV2病原學(xué)的診斷和監(jiān)測， 對控制PCV2的感染具有重要意義。
[0004] 為了更為準(zhǔn)確的診斷PCV2,亟需開發(fā)出一種新的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了抗豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)的核衣殼蛋白 (Cap)的單克隆抗體及檢測豬圓環(huán)病毒2型的試劑盒，所述試劑盒選自ELISA檢測試劑盒或 酶免疫層析檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測豬圓環(huán)病毒2型試劑盒，所述試劑盒包括由雜交 瘤細(xì)胞系CCTCC N0:C2014199分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，和/或由雜交瘤細(xì)胞系CCTCC N0: C2014198分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。也就是說，所述試劑盒中可單獨的包括上述兩種單克 隆抗體，也可以同時包括上述兩種單克隆抗體。在本發(fā)明中，經(jīng)過發(fā)明人對篩選出的特異 性強(qiáng)、親和力常數(shù)高的單克隆抗體的配對研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時包括上述兩種單克隆抗體時，對 PCV2的檢測效果更佳。但是，當(dāng)抗體組合配對使用時，并不是簡單地將兩個親和力常數(shù)高的 單克隆抗體配對后便能達(dá)到優(yōu)良的檢測效果，因為其中受限的因素很多，包括已知的或未 知的因素，例如兩個單克隆抗體配對使用時，要考慮兩個單克隆抗體之間、兩個單克隆抗體 分別與抗原之間的相互關(guān)系，甚至包括所使用的單克隆抗體是否與非PCV2存在非特異性 的反應(yīng)和顯色本底均會影響單克隆抗體的配合使用。本申請的所述兩個單克隆抗體的配 合使用，在優(yōu)化后的條件下，ELISA試劑盒的靈敏度能夠達(dá)到1.0ng/mL，酶免疫層析檢測試 劑盒的靈敏度能夠達(dá)到2. Ong/mL。也就是說，兩種試劑盒的靈敏度均顯著地高于檢測所述 PCV2的同類別試劑盒的靈敏度。并且兩種試劑盒的特異性達(dá)到了 100%。這充分說明了包 括所述兩個單克隆抗體的試劑盒的性能顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的試劑盒。
[0007] 在本發(fā)明中，由雜交瘤細(xì)胞系CCTCC NO :C2014199分泌產(chǎn)生的單克隆抗體命名為 2F8,由雜交瘤細(xì)胞系CCTCC NO :C2014198分泌產(chǎn)生的單克隆抗體命名為3G12。
[0008] 術(shù)語"豬圓環(huán)病毒2型Cap全蛋白"是指豬圓環(huán)病毒2型的核衣殼蛋白全蛋白 (Capsid protein，Cap)，是一種單體磷酸化的多肽，分子量大小約為27. 8kDa，是PCV2的主 要免疫原性蛋白（Nawagitgul.P, Morozov. I，Bolin. S R，et al. Open reading frame 2of porcine circovirus type 2encodes a major capsid protein. J Gen Virol. , 2000, 81(Pt 9):2281-2287);該全蛋白具有特異性，且可以自我裝配成病毒衣殼顆粒（陳燕凌等，豬圓 環(huán)病毒2型0RF2基因及其編碼蛋白的研究概況，湖北畜牧獸醫(yī)，2013, 34(1) :78-81)。
[0009] 術(shù)語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個 體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語"單克隆"是指該抗體的性質(zhì) 不是離散抗體的混合物。優(yōu)選地，所述單克隆抗體包括單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌 合抗體、人源化抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
[0010] 術(shù)語"抗體"應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因 子。因而，這個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的。抗體 的實例是免疫球蛋白亞型（如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和雙鏈抗體（diabodies)。融合至另一多肽 的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達(dá) 在 EP. A. 0120694 和 EP. A. 0125023 中描述。
[0011] 術(shù)語"抗體"可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗體特異 性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)性決 定區(qū)（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，EP.A. 184187， GB2188638A或EP. A. 239400。還可以對雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或 其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。
[0012] 用于本發(fā)明的"單克隆抗體"可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發(fā)明鼠源化抗體的 DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成 或用PCR法擴(kuò)增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入 合適的表達(dá)載體中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然 后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。
[0013] 在一個具體的實施方式中，所述試劑盒為ELISA檢測試劑盒。
[0014] 在一個具體的實施方式中，所述ELISA檢測試劑盒中還包括樣品稀釋液、洗滌液、 顯色液、終止液、陽性豬血清對照以及陰性豬血清對照。
[0015] 在一個具體的實施方式中，所述ELISA檢測試劑盒中的所述樣品稀釋液為含有脫 脂奶的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為含有10% (W/V)脫脂奶的磷酸鹽緩沖液；
[0016] 所述洗滌液為含有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為含有0? 05 % (V/V) Tween-20 的磷酸鹽緩沖液；
[0017] 所述顯色液包括顯色液A和顯色液B，所述顯色液A含3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯 胺（TMB)20mg、無水乙醇10ml，并用ddH20定容至100ml ;所述顯色液B含梓檬酸2. lg、無水 Na2HP042. 82g、0. 75% (V/V)的過氧化氫尿素 0. 64ml，并用 ddH20 定容至 100ml ;
[0018] 所述終止液為2mol/L H2S04。
[0019] 術(shù)語"磷酸鹽緩沖液"是指含有磷酸或其鹽并被調(diào)至理想pH值的溶液，是生物化 學(xué)研究中使用最為廣泛的一種緩沖液。一般地，磷酸鹽緩沖液是從磷酸或磷酸鹽（包括但 不限于鈉和鉀鹽）制備的。本領(lǐng)域已經(jīng)知道一些磷酸鹽，例如磷酸二氫鈉和磷酸二氫鉀、磷 酸氫二鈉和磷酸氫二鉀、磷酸鈉和磷酸鉀。已經(jīng)知道磷酸鹽是以鹽的水合物形式存在的。由 于緩沖液的二級解離作用，緩沖的pH值范圍很寬，例如約pH 4至約pH 10的范圍，優(yōu)選約 pH 5至pH 9的范圍，更有選約pH 6至約pH 8的范圍，最優(yōu)選約pH 7. 4。進(jìn)一步優(yōu)選地， 所述磷酸鹽緩沖液為含氯化鈉和氯化鉀的磷酸鹽緩沖液。
[0020] 用于檢測PCV2的ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟：
[0021] (1)克隆所述PCVlap全蛋白（如SEQ ID N0. 2所示的序列）的DNA(如SEQ ID NO. 1所不的序列），并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)；
[0022] (2)利用所述Cap全蛋白免疫小鼠產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，然后通過大量的篩選，得到性 能優(yōu)良的分泌抗豬圓環(huán)病毒2型Cap全蛋白的單克隆抗體2F8和抗豬圓環(huán)病毒2型Cap全 蛋白的單克隆抗體3G12 ;其中，單克隆抗體2F8由保藏號為CCTCC NO :C2014199的雜交瘤 細(xì)胞分泌產(chǎn)生，單克隆抗體3G12由保藏號為CCTCC NO :C2014198的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。
[0023] 在一個具體的實施方式中，所述ELISA檢測試劑盒的制備方法還包括上述步驟 (2)之后的步驟（3):將步驟（2)所制得的單克隆抗體2F8在酶標(biāo)板上進(jìn)行包被；將單克隆 抗體3G12進(jìn)行酶標(biāo)記；
[0024] (4)配制樣品稀釋液、洗滌液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、陽性豬血清對照以 及陰性豬血清對照；（5)將步驟（3)和/或（4)所制備的各成分組裝成ELISA檢測試劑盒。
[0025] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的所述ELISA檢測試劑盒的制備方法 中，所述步驟（3)中包被時所用的包被液為碳酸鹽緩沖液，優(yōu)選為pH9. 6的碳酸鹽緩沖液， 4°C包被過夜或37°C包被2小時，封閉時所用的封閉液為1% (W/V)BSA的磷酸鹽緩沖液、 5% (W/V)脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液、1. 5% (V/V)明膠的磷酸鹽緩沖液或5% (V/V)犢牛血 清FCS的磷酸鹽緩沖液中的任一種，37°C封閉2小時，洗滌時所用洗滌液為含有Tween-20 的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為含有0. 05% (V/V) Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
[0026] 本發(fā)明的所述ELISA檢測試劑盒的使用方法包括以下步驟：
[0027] (1)將待檢血清按100 y 1/孔加入包被有單克隆抗體2F8的酶標(biāo)板上，37°C反應(yīng) 60min，加入200 y 1/孔洗滌液洗3-5次，lmin/次，洗完后在吸水紙上拍干。
[0028] (2)將100 y 1/孔的1:8000倍（V/V)稀釋的HRP標(biāo)記的單克隆抗體3G12加入至 包被有單克隆抗體2F8的酶標(biāo)板上，37°C反應(yīng)60min，之后加入200 y 1/孔洗滌液洗3-5次， lmin/次，洗完后在吸水紙上拍干。
[0029] (3)加入底物顯色液A和顯色液B的混合液100 y 1/孔，室溫避光放置15min。
[0030] (4)加入50 y 1/孔終止液以終止反應(yīng)。
[0031] (5)在酶標(biāo)儀上讀取0D45。的值，并按照判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計算和判定。
[0032] 在一個具體的實施方式中，所述ELISA檢測試劑盒的使用方法還包括：與上述步 驟（1)同時進(jìn)行的步驟（I):將陰性豬血清對照、陽性豬血清按100 yl/孔加入包被有單克 隆抗體2F8的酶標(biāo)板上，37°C反應(yīng)60min，加入200 y 1/孔洗滌液洗3-5次，lmin/次，洗完 后在吸水紙上拍干。
[0033] 在一個具體的實施方式中，本發(fā)明提供的試劑盒為酶免疫層析檢測試劑盒，其包 括緩沖液供應(yīng)單元和檢測單元，所述緩沖液供應(yīng)單元用于將底物緩沖液供給所述檢測單 J L 〇
[0034] 在一個具體的實施方式中，所述酶免疫層析檢測試劑盒中，所述緩沖液供應(yīng)單元 通過展開液墊用于將底物緩沖液供給所述檢測單元；所述展開液墊的第一端與緩沖液供應(yīng) 單元接觸，所述展開液墊的第二端與所述檢測單元的第一端接觸。
[0035] 在一個具體的實施方式中，所述檢測單元包括：
[0036] 基板；和在基板上依次設(shè)置的底物供應(yīng)區(qū)、樣品供應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)；
[0037] 所述底物供應(yīng)區(qū)包括底物墊，所述底物墊位于遠(yuǎn)離檢測線方向的基板的一端，且 所述底物墊上吸附有酶