一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)或摩爾濃度的各組分：聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％?0.4％；核糖的濃度為10?100mM；檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1?0.5％；乙二酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2?0.6％；高硼酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01?0.05％；TMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01?0.05％。本發(fā)明是一種單組份TMB顯色液，使用時(shí)無(wú)需再單獨(dú)配制，操作更加方便，可以避免人為操作帶來(lái)的誤差，更客觀地反應(yīng)真實(shí)的數(shù)據(jù)。因該發(fā)明中加入高分子聚合物(PVA)和一種單糖分子(核糖)，只有兩者同時(shí)存在時(shí)，才能保證本發(fā)明的TMB顯色液能夠長(zhǎng)時(shí)間的保存，而不影響其靈敏度，能夠增加TMB的溶解性和穩(wěn)定性，保證了TMB長(zhǎng)時(shí)間的保存，保持單相溶液的存在。
【專利說(shuō)明】
-種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定化nzyme-linked immunosorbent assay)，簡(jiǎn)稱EILISA，是一種 在免疫學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上，將抗原-抗體的專一性反應(yīng)和酶對(duì)底物高效催化作用相結(jié)合發(fā)展起 來(lái)的一種高效簡(jiǎn)便的定性和定量的檢測(cè)方法。由于化SIA檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、快速等 優(yōu)點(diǎn)，自發(fā)明W來(lái)使其技術(shù)得到迅速發(fā)展，已被廣泛地應(yīng)用于各種生命科學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)的 許多領(lǐng)域。ELISA最終的檢驗(yàn)方法有多種，但最常見(jiàn)的都是通過(guò)酶結(jié)合物和顯色液進(jìn)行反應(yīng) 來(lái)判定的。辣根過(guò)氧化物酶是化SIA實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的，其偶聯(lián)在抗體上，能通過(guò)反應(yīng)底 物過(guò)氧化物(如過(guò)氧化氨)和顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。目前該顯色劑系統(tǒng)中有多種，但最常見(jiàn) 的是3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
[0003] TMB是一種新型安全的過(guò)氧化物酶底物，其含有脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，易形成多聚 體，和HRP活性部位反應(yīng)，可產(chǎn)生一種可溶性的藍(lán)色產(chǎn)物，目視對(duì)比明顯。TMB性質(zhì)穩(wěn)定，在過(guò) 氧化物做底物時(shí)和HRP反應(yīng)后，應(yīng)用HC1或者也S〇4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，在比色計(jì) 中可定量，最佳吸收波長(zhǎng)為450nm，通過(guò)測(cè)定吸光值，我們可W定量地判斷免疫反應(yīng)強(qiáng)度。
[0004] 目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的化ISA試劑盒還多采用雙組份TMB顯色液底物，分為A液和B液，A 液中主要成為ΤΜΒ,Β液組要成為是過(guò)氧化物，使用前需將A液和B液等體積混勻。還有部分 TMB顯色液由多種組分組成，要現(xiàn)配現(xiàn)用才可。運(yùn)些使用過(guò)程中有許多明顯的缺點(diǎn)：操作比 較繁瑣，使用不方便;每次配制都會(huì)有差異發(fā)生，從而導(dǎo)致批次差異大，影響準(zhǔn)確的結(jié)果；因 為多種成分分開(kāi)存在，在包裝運(yùn)輸?shù)确矫娑紩?huì)增加成本等。目前市場(chǎng)上有些廠家生產(chǎn)的單 組份TMB顯色液，因 TMB顯色液如果沒(méi)有穩(wěn)定劑等存在，長(zhǎng)時(shí)間保存會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性不高，保存 時(shí)間較短，靈敏度低，顯色背景高，而且進(jìn)口的TMB顯色液價(jià)格貴等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種單一組分的，且高效 穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液(TMB顯色液)及其制備方法，能夠顯著提高TMB顯色液的長(zhǎng)期 保存時(shí)間。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其包括W下各組分：
[000引聚乙締醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.!%-0.4%;核糖的濃度為lO-lOOmM;巧樣酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0.1 -0.5 % ;乙二酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2-0.6 % ;高棚酸鋼的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0Ι? ο. 05 %; TMB 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.01-0.05 %。
[0009] 進(jìn)一步地，包括W下各組分：
[0010] 聚乙締醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%;核糖的濃度為lOmM;巧樣酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%;乙 二酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2% ;高棚酸鋼的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% ;TMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%。
[0011] 進(jìn)一步地，包括W下各組分：
[0012] 聚乙締醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4% ;核糖的濃度為lOOmM;巧樣酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% ; 乙二酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6 % ;高棚酸鋼的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0 5 % ; T Μ B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.05%。
[0013] 進(jìn)一步地，包括W下各組分：
[0014] 聚乙締醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% ;核糖的濃度為75mM;巧樣酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.21 % ; 乙二酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.42% ;高棚酸鋼的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03% ; TMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.025%。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)方面公開(kāi)了一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的制備方法， 具體包括W下步驟：
[0016] (1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 0. lg-0.5g的TMB，在磁力攬拌器上攬拌均勻使其充分溶解；
[0017] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入l-4g的聚乙締醇，加入核糖 lO-lOOmM，加入巧樣酸l-5g;加入乙二酸四乙酸2-6g，加入高棚酸鋼0.1-0.5g，攬拌使其充 分溶解。
[001引（3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分?jǐn)埌杈鶆颍?容至1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過(guò)濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C環(huán)境下。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)方面公開(kāi)了一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的使用方法， 具體包括W下步驟：
[0020] (1)待ELISA實(shí)驗(yàn)加入皿P結(jié)合物后，且溫育一段時(shí)間，清洗3次ELISA板之后，每孔 加入lOOul上述TMB顯色液；
[0021] (2)根據(jù)反應(yīng)體系避光解育5-30分鐘；
[0022] (3)每孔加入50ul反應(yīng)終止液(2M出S〇4或1N肥1)終止
[0023] (4)在波長(zhǎng)450nm測(cè)定吸光度。
[0024] 聚乙締醇外觀為白色粉末，是一種廣泛應(yīng)用的水溶性高分子聚合物，具有極高的 安全性的有機(jī)物，對(duì)人體無(wú)毒，無(wú)副作用。在本發(fā)明中加入了聚乙締醇，能提高TMB的溶解度 和增強(qiáng)穩(wěn)定性。核糖是一種五碳醒糖，一般常見(jiàn)的型態(tài)為D-核糖，加入核糖能夠和聚乙締醇 協(xié)同增強(qiáng)TMB顯色液的穩(wěn)定性。巧樣酸能夠?yàn)門(mén)MB顯色液提供一個(gè)酸性環(huán)境，使其抑值維持 在4.0-6.0之間。邸TA具有馨合的作用，使得TMB顯色液更加穩(wěn)定。本發(fā)明中所使用的過(guò)氧化 物底物為高棚酸鋼，比過(guò)氧化氨更穩(wěn)定，更好的氧化性，該物質(zhì)的底物的酶是辣根過(guò)氧化物 酶化RP)"TMB外觀是白色結(jié)晶粉末，難溶于水，因此需要N-甲基化咯燒酬、二甲基亞諷、二甲 基甲酯胺等有機(jī)溶劑溶解。
[0025] 本發(fā)明所達(dá)到的有益效果是：
[0026] 本發(fā)明是一種單組份TMB顯色液，使用時(shí)無(wú)需再單獨(dú)配制，操作更加方便，可W避 免人為操作帶來(lái)的誤差，更客觀地反應(yīng)真實(shí)的數(shù)據(jù)。因該發(fā)明中加入高分子聚合物(PVA)和 一種單糖分子(核糖），只有兩者同時(shí)存在時(shí)，才能保證本發(fā)明的TMB顯色液能夠長(zhǎng)時(shí)間的保 存，而不影響其靈敏度，能夠增加 TMB的溶解性和穩(wěn)定性，保證了 TMB長(zhǎng)時(shí)間的保存，保持單 相溶液的存在。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1與對(duì)照顯色液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] W下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí) 施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0030] 實(shí)施例1
[0031 ] (1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 0.25g的TMB，攬拌均勻使其充分溶解。
[0032] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入2.5g的聚乙締醇，加入核糖 7.5g，加入巧樣酸2. Ig;加入乙二酸四乙酸4.2g，加入高棚酸鋼0.3g，攬拌使其充分溶解。
[0033] (3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分?jǐn)埌杈鶆颍?容至1000ml。經(jīng)0.45um的濾膜過(guò)濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C。
[0034] 實(shí)施例2
[003引（1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 O.lg的TMB，在磁力攬拌器上攬拌均勻使其充分溶解；
[0036] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入Ig的聚乙締醇，加入核糖 0.0 lmol，加入巧樣酸Ig;加入乙二酸四乙酸2g，加入高棚酸鋼0.1 g，攬拌使其充分溶解。
[0037] (3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分?jǐn)埌杈鶆?，?容至1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過(guò)濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C環(huán)境下。
[003引實(shí)施例3
[0039] (1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 0.5g的TMB，在磁力攬拌器上攬拌均勻使其充分溶解；
[0040] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入4g的聚乙締醇，加入核糖 0.1mol，加入巧樣酸5g;加入乙二酸四乙酸6g，加入高棚酸鋼0.5g，攬拌使其充分溶解。
[0041 ] (3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分?jǐn)埌杈鶆?，?容至1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過(guò)濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C環(huán)境下。
[0042]( - )使用實(shí)施例1~3的制備方法獲得的TMB顯色液與現(xiàn)有技術(shù)中某公司商品化的 TMB顯色液經(jīng)行比較(簡(jiǎn)稱:對(duì)照顯色液），WPD-1化uman化LISA Kit為例經(jīng)行測(cè)試。顯色時(shí) 間為20分鐘，在吸光值為450nm處測(cè)得0D值如下表：
[0043]
[0044] 從表1中可W得出：實(shí)施案例1~3中的TMB顯色液要比對(duì)照顯色液靈敏度要高的 多;此外實(shí)施案例1~3中的顯色液在PD-Uhuman)濃度為l.OOng/ul時(shí)的信噪比是0.28414/ 0.05958 = 4.77左右，而對(duì)照顯色液在PD- U human)濃度為1. OOng/u 1時(shí)的信噪比是 0.25519/0.06489 = 3.93，實(shí)施案例1~3中的TMB顯色液顯著優(yōu)于對(duì)照TMB顯色液。
[0045] (二)穩(wěn)定性試驗(yàn):分別將使用實(shí)施案例1制備的TMB顯色液和現(xiàn)有技術(shù)中某公司商 品化的TMB顯色液(簡(jiǎn)稱:對(duì)照顯色液)避光放置37°C溫箱中，分別在1、5、10、15、20天后取出 觀察物理變化，并WPD-UHumar〇ELISA Kit為例，測(cè)試PD-Uhuman)抗原的標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為 4ng/ml)，經(jīng)行靈敏度檢測(cè)。對(duì)比結(jié)果如圖1所示。
[0046] 由圖1可知，相對(duì)于市場(chǎng)上商品化的某公司TMB顯色液，本發(fā)明單組份TMB顯色液更 加穩(wěn)定，在溫度加速試驗(yàn)可W看出，本發(fā)明的TMB顯色液可W長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，且不影響其靈 敏度。
[0047] 最后應(yīng)說(shuō)明的是：W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可 W對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %-〇 . 4% ;核糖的濃度為10-100mM;檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1-0.5% ;乙二酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2-0.6% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01-0.05% ; TMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01-0.05%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各 組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 % ;核糖的濃度為10mM;檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 % ;乙二酸 四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 % ;TMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各 組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4 % ;核糖的濃度為100mM;檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 % ;乙二 酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05% ;TMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各 組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% ;核糖的濃度為75mM;檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.21 % ;乙二 酸四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.42% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03% ;TMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%。5. -種權(quán)利要求1~4任一所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的制備方法，具體 包括以下步驟： (1) 制備含TMB的N-甲基吡咯烷酮溶液：取2 0 m 1 N-甲基吡咯烷酮為溶劑，緩慢加入 0. lg-0.5g的TMB，在磁力攪拌器上攪拌均勻使其充分溶解； (2) 在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入l-4g的聚乙烯醇，加入核糖10-100mM，加入檸檬酸l-5g;加入乙二酸四乙酸2-6g，加入高硼酸鈉0.1-0.5g，攪拌使其充分溶 解。 (3) 將含TMB的N-甲基吡咯烷酮溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，定容?1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過(guò)濾，獲得均一的溶液，保存在棕色的塑料瓶中，密封避光保存在 2-8 °C環(huán)境下。6. -種權(quán)利要求1~4任一所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的使用方法，具體 包括以下步驟： (1) 待ELISA實(shí)驗(yàn)加入HRP結(jié)合物后，且溫育一段時(shí)間，清洗3次ELISA板之后，每孔加入 100ul上述TMB顯色液； (2) 根據(jù)反應(yīng)體系避光孵育5-30分鐘； (3) 每孔加入50u 1反應(yīng)終止液終止 (4) 在波長(zhǎng)450nm測(cè)定吸光度。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK105823871SQ201610239243
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月18日
【發(fā)明人】楊勇, 劉永雙
【申請(qǐng)人】蘇州新賽美生物科技有限公司