一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑及其制備方法，該熒光膠乳免疫層析檢測試劑包括樣品墊、結合墊、反應膜和吸水墊，其中結合墊上涂覆有熒光膠乳標記的抗HRP?2單克隆抗體和抗兔IgG，反應膜上設有檢測線和質控線，所述的檢測線上包被有抗HRP?2單克隆抗體，所述的質控線上包被有兔IgG，本發(fā)明的檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑可以快速檢測出惡性瘧原蟲，其操作便捷，成本低廉，適于臨床和現(xiàn)場使用。
【專利說明】
一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑及其制備方法
技術領域
[0001]
本發(fā)明涉及疾病檢測領域，具體涉及一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]
瘧疾是由瘧原蟲感染引起的嚴重危害人群健康的急性寄生蟲病，它通過按蚊叮咬而傳播，在人體內先后經(jīng)過肝內無性繁殖和紅細胞內有性繁殖，成批破壞紅細胞而致病。寄生于人體的皰原蟲有四種:間日皰原蟲(P.1asmodium)、惡性皰原蟲(P.falciparum)、三日皰原蟲(P.malarial)和卵形皰原蟲(P.0vale)。我國以間日皰原蟲、惡性皰原蟲為常見，卵形皰僅發(fā)現(xiàn)幾例。瘧疾診斷是瘧疾防治工作中的重要環(huán)節(jié)，目前傳統(tǒng)的鏡檢法仍然是瘧疾診斷方法的“金標準“，用厚血膜法檢查100個視野，理論上可檢出4個瘧原蟲AU，但其缺點是費時、費力，同時檢查者需要有專業(yè)知識和經(jīng)驗。近年發(fā)展起來的血液棕黃層定量法(QBC技術)，缺點是所使用的毛細管價格較高，且不能重復使用，操作上也較為繁瑣，且難以有效地進行蟲種鑒別及原蟲計數(shù)，不適用單個瘧疾病人的診斷。而近年發(fā)展的DNA探針技術和聚合酶鏈式反應(PCR)等方法在現(xiàn)場使用時均有一定的局限性，需要較高的操作技術和復雜的設備儀器，同時也和傳統(tǒng)方法一樣不適合大規(guī)模的現(xiàn)場應用。隨著細胞生物學技術，特別是以免疫淋巴細胞與骨髓瘤細胞雜交融合后制備單克隆抗體技術的發(fā)展，，用單克隆抗體檢測瘧原蟲的特異性抗原，是目前瘧疾免疫診斷研究的主要方向。瘧疾的血清學標志物主要有各種瘧原蟲抗原和機體產(chǎn)生的各種對應抗體。目前已報道的被檢抗原主要是富組氨酸蛋白HRP-2和皰原蟲乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，pLDH)，此外還有P.f耐熱抗原Pfgst3HRPI是惡性瘧原蟲合成的含有大量組氨酸的水溶性抗原，由感染瘧原蟲的紅細胞大量分泌，其含量在整個紅細胞內期隨裂殖子的分裂逐漸升高，這一抗原只存在與無性體中和早期配子體中，相應的單克隆抗體可用于檢測惡性瘧原蟲。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，其包括:底板和依次搭接并粘貼在底板上的樣品墊、結合墊、反應膜和吸水墊，所述反應膜上遠離結合墊的一端設置有質控線，在質控線和結合墊之間還設置有檢測線，所述的結合墊上涂覆有熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體和抗兔IgG，所述的檢測線上包被有抗HRP-2單克隆抗體，所述的質控線上包被有兔I gG，所述檢測線上包被的抗HRP-2單克隆抗體的濃度為0.5mg/ml~2.0mg/ml。
[0004]所述質控線上包被的兔IgG濃度為0.8mg/ml?1.2mg/ml。
[0005]所述熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體由以下方法制備得到:使用濃度為1%的熒光膠乳溶液，調節(jié)其pH值為7.5-9.5,加入抗HRP-2單克隆抗體，使抗HRP-2單克隆抗體在所述熒光膠乳溶液中的濃度為0.4-1.0mg/ml，混合均勻，室溫下反應2?4小時得到。
[0006]所述熒光膠乳標記的抗兔IgG多克隆抗體由以下方法制備得到:使用濃度為1%的熒光膠乳溶液，調節(jié)其pH值為7.5-9.5，加入抗兔IgG多克隆抗體，使抗兔IgG多克隆抗體在所述熒光膠乳溶液中的濃度為0.2-0.4mg/ml，混合均勻，室溫下反應2?4小時得到。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供上述的檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑的制備方法，其包括以下步驟:
(1)制備熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體和抗兔IgG，并涂覆在結合墊上；
(2)在反應膜的檢測線上包被HRP-2單克隆抗體，在反應膜的質控線上包被兔IgG;
(3)把樣品墊、反應膜、吸水紙依次搭接粘貼在底板上，用切條機切成單條。
[0008]所述的底板是PVC底板，厚0.2?0.4mm，長7.0cm，寬4mm。
[0009]所述樣品墊是玻璃纖維膜。
[0010]所述結合墊是玻璃纖維膜。
[0011]所述的反應膜是硝酸纖維素膜。
[0012]所述的抗HRP-2單克隆抗體從Meridian life science , Inc.采購，純度2 95%。
[0013]使用時，將待測樣品滴加到所述熒光膠乳免疫層析檢測試劑的樣品墊，并滴加裂解液，樣品經(jīng)裂解液裂解后釋放的HRP-2抗原先與結合墊中熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體反應形成復合物，由于層析作用，反應復合物沿著硝酸纖維素膜向前移動，被硝酸纖維素膜上檢測線包被的抗HRP-2單克隆抗體捕獲而聚積，聚積的量越多，免疫熒光檢測儀掃描的信號值越高，則樣品陽性程度越強，此時檢測結果為陽性;而當樣品中沒有惡性瘧原蟲或其含量低于25個AU時，則在檢測線沒有或是有極少量復合物聚積，此時免疫熒光檢測儀掃描為無信號值或信號值低于最低檢出限的信號值，此時檢測結果為陰性。同時，質控線包被兔IgG與熒光膠乳標記的抗兔IgG反應形成具有一定熒光信號值，則表明檢測結果正常，如果該質控線上檢測不到熒光信號，說明待測樣品在反應膜上沒有正常層析，則拋棄檢測結果O
[0014]所述的裂解液由以下步驟制備得到:稱取8.0Og NH4C1 (0.15 M)、1.00g KHC03(10 mM)、0.37g Na2EDTA(l mM)，溶于980ml的三蒸水中，用IN HCl或IN NaOH調節(jié)pH值到6.0?6.4之間，加三蒸水定容到1000ml，備用。
[0015]本發(fā)明提供的一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，利用熒光免疫層析技術，采用雙抗夾心法，可以在加樣后15分鐘內有效檢測出人全血中是否含帶惡性瘧原蟲代謝產(chǎn)物抗組氨酸富集蛋白HRP-2，從而確定人體是否感染了惡性瘧原蟲，其操作簡便，成本低廉，非常適合現(xiàn)場的及時檢測。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明的檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑的結構示意圖。
[0017]附圖標記說明:1、樣品塾;2、結合塾;3、檢測線;4、反應I旲；5、質控線;6、吸水塾;7、底板。
【具體實施方式】
[0018]
實施例1
一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，由玻璃纖維樣品墊1，玻璃纖維結合墊2，硝酸纖維素反應膜4和吸水紙6依次搭接并粘貼固定在PVC底板7上組成，所述PVC底板7裁切平整，厚0.2 mm，長7.0 cm，寬4mm，在所述硝酸纖維素反應膜4上臨接結合墊2的一端的距離1.75cm處設置有檢測線3，并在距離檢測線3的0.65cm處設置有質控線5，所述結合墊2上涂覆有熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體，濃度均為0.4mg/ml，所述結合墊還涂覆有熒光膠乳標記的抗兔IgG，濃度為0.2mg/ml，所述檢測線3包被有抗HRP-2單克隆抗體，濃度均為0.5 mg/ml，所述質控線5包被有抗兔IgG多克隆抗體，濃度0.8/ml。
[0019]實施例2
一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，由玻璃纖維樣品墊1，玻璃纖維結合墊2，硝酸纖維素反應膜4和吸水紙6依次搭接并粘貼固定在PVC底板7上組成，所述PVC底板7裁切平整，厚0.2 mm，長7.0 cm，寬4mm，在所述硝酸纖維素反應膜4上臨接結合墊2的一端的距離1.75cm處設置有檢測線3，并在距離檢測線3的0.65cm處設置有質控線5，所述結合墊2上涂覆有熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體，濃度均為1.0mg/ml，所述結合墊還涂覆有熒光膠乳標記的抗兔IgG，濃度為0.4mg/ml，所述檢測線3包被有抗HRP-2單克隆抗體，濃度均為2.0mg/m I，所述質控線5包被有抗兔I gG多克隆抗體，濃度1.2mg/m I。
[0020]實施例3
一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑的制備方法如下:
(I)按以下步驟制備結合墊:
a)標記洗滌液的配制:將2%BSA加入pH值為7.5的0.0lM PBS溶液，置于2?8°C備用。
[0021 ] b)膠乳交聯(lián)劑的配制:將50mg/mlEDC(碳二亞胺)溶液加入pH值為7.5的0.05Μ PBS溶液緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。
c)膠乳保存液的配制:將1%BSA，0.5%脫脂奶，0.05%NaN3、0.1%的Tween-20和pH值為7.5的0.0IM PBS溶液混合均勻，置于2?8 °C備用。
[0022]d)熒光膠乳的活化:按每10毫升熒光膠乳中加入I毫升膠乳交聯(lián)劑，室溫反應I小時后，離心15min，用0.05M PBS反復離心3次。
e)熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體的制備:按每毫升活化的熒光膠乳加入0.4mg的抗HRP-2單克隆抗體，混合后，室溫攪拌反應2?4h，離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用相同熒光膠乳體積的膠乳保存液溶解，置于2?8°C備用。
f)熒光膠乳標記的抗兔IgG多克隆抗體的制備:將活化的熒光膠乳恢復原始體積，按每毫升焚光膠乳加入0.2mg的抗兔IgG單克隆抗體，混合后，室溫攪拌反應2?4h，離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用相同熒光膠乳體積的膠乳保存液溶解，置于2?8 °C備用。
[0023]g)將上述步驟得到的熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體和抗兔IgG多克隆抗體涂覆在結合墊上。
[0024](2)按以下步驟制備反應膜:
h)包被緩沖液的配制:將0.49g Na2CO3.1OH20,2.94g NaHCO3、8.5g NaCl混合，加入純化水至100ml，調節(jié)pH至7.5，置于2?8°C備用。
[0025]i)檢測線制備:取0.5mg/ml的抗HRP-2單克隆抗體，涂覆在硝酸纖維素膜上得到檢測線T。
[0026]j)質控線制備:取0.8mg/ml的兔IgG，涂覆在硝酸纖維素膜上得到質控線。
[0027]k)干燥:將包被了檢測線和質控線的硝酸纖維素膜放置于50°C烘箱干燥24以上，封袋保存?zhèn)溆谩?br>[0028](3)按以下步驟制備熒光膠乳免疫層析檢測試劑:把上述步驟得到的結合墊、包被膜和樣品墊、吸水紙依次搭接并粘貼在PVC底板上，用切條機切成單條。
[0029]實施例4
一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑的制備方法如下:
(1)按以下步驟制備結合墊:
a)標記洗滌液的配制:將2%BSA加入pH值為9.5的0.0lM PBS溶液，置于2?8°C備用。
[0030]b)膠乳交聯(lián)劑的配制:將50mg/mlEDC(碳二亞胺)溶液加入0.05M pH值為9.5的I3BS溶液緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。
c)膠乳保存液的配制:將1%的BSA，0.5%脫脂奶，5/萬NaN3、0.1%的Tween-20和pH值為7.5的0.0lM PBS溶液，置于2?8°C備用。
[0031]d)熒光膠乳的活化:按每10毫升熒光膠乳中加入I毫升膠乳交聯(lián)劑，室溫反應I小時后，離心15min，用0.05M PBS反復離心3次。
e)熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體的制備:按每毫升活化的熒光膠乳加入1.0mg的抗HRP-2單克隆抗體，混合后，室溫攪拌反應2?4h，離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用相同熒光膠乳體積的膠乳保存液溶解，置于2?8°C備用。
f)熒光膠乳標記的抗兔IgG多克隆抗體的制備:將活化的熒光膠乳恢復原始體積，按每毫升焚光膠乳加入0.4mg的抗兔IgG單克隆抗體，混合后，室溫攪拌反應2?4h，離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用相同熒光膠乳體積的膠乳保存液溶解，置于2?8 °C備用。
[0032]g)將上述步驟得到的熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體和抗兔IgG多克隆抗體涂覆在結合墊上
(2)按以下步驟制備反應膜:
h)包被緩沖液的配制:將0.49g Na2CO3.1OH20,2.94g NaHCO3、8.5g NaCl混合，加入純化水至100ml，調節(jié)pH至9.5，置于2?8°C備用。
[0033]i)檢測線制備:取2.0mg/ml的抗HRP-2單克隆抗體，涂覆在硝酸纖維素膜上得到檢測線T。
[0034]j)質控線制備:取1.2mg/ml的兔IgG，涂覆在硝酸纖維素膜上得到質控線。
[0035]k)干燥:將包被了檢測線和質控線的硝酸纖維素膜放置于50°C烘箱干燥24以上，封袋保存?zhèn)溆谩?br>[0036](3)按以下步驟制備熒光膠乳免疫層析檢測試劑:把上述步驟得到的結合墊、包被膜和樣品墊、吸水紙依次搭接并粘貼在PVC底板上，用切條機切成單條。
【主權項】
1.一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，包括底板和依次搭接并粘貼在底板上的樣品墊、結合墊、反應膜和吸水墊，所述反應膜上遠離結合墊的一端設置有質控線，在質控線和結合墊之間還設置有檢測線，所述的結合墊上涂覆有熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體和抗兔IgG，所述的檢測線上包被有抗HRP-2單克隆抗體，所述的質控線上包被有兔IgG。2.如權利要求1所述的一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，其特征在于，所述檢測線上包被的抗HRP-2單克隆抗體的濃度為0.5?2.0mg/ml。3.如權利要求1所述的一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，其特征在于，所述質控線上包被的兔IgG濃度為0.8 ~1.2mg/ml。4.如權利要求1所述的一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，其特征在于，所述熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體由以下方法制備得到:使用濃度為1%的熒光膠乳溶液，調節(jié)其PH值為7.5-9.5,加入抗HRP-2單克隆抗體，使抗HRP-2單克隆抗體在所述熒光膠乳溶液中的濃度為0.4?1.0mg/ml，混合均勻，室溫下反應2?4小時得到。5.如權利要求1所述的一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑，其特征在于，所述熒光膠乳標記的抗兔IgG多克隆抗體由以下方法制備得到:使用濃度為1%的熒光膠乳溶液，調節(jié)其PH值為7.5?9.5，加入抗兔IgG多克隆抗體，使抗兔IgG多克隆抗體在所述熒光膠乳溶液中的濃度為0.2?0.4mg/ml，混合均勻，室溫下反應2?4小時得到。6.如權利要求1所述的一種檢測惡性瘧疾的熒光膠乳免疫層析檢測試劑的制備方法，其包括以下步驟: 制備熒光膠乳標記的抗HRP-2單克隆抗體和抗兔IgG，并涂覆在結合墊上； 在反應膜的檢測線上包被HRP-2單克隆抗體，在反應膜的質控線上包被兔IgG; 把樣品墊、反應膜、吸水紙依次搭接粘貼在底板上，用切條機切成單條。
【文檔編號】G01N33/577GK105823892SQ201610315808
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】陳飛, 康可人, 王繼華
【申請人】廣州萬孚生物技術股份有限公司