一種建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法。該方法，以金銀花配方顆粒為檢測(cè)對(duì)象，建立了針對(duì)該藥物制劑的指紋圖譜的方法，獲得了較為全面的圖譜信息，確認(rèn)了共有特征峰1號(hào)峰新綠原酸、2號(hào)峰綠原酸、3號(hào)峰隱綠原酸、4號(hào)峰蘆丁、5號(hào)峰木犀草苷、6號(hào)峰、7號(hào)峰異綠原酸A和8號(hào)峰異綠原酸C，選擇2號(hào)峰綠原酸作為內(nèi)參考峰，確定了金銀花配方顆粒的共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，且結(jié)合該指紋圖譜中多個(gè)色譜峰的信息，能夠全面地、快速地檢測(cè)其質(zhì)量，有利于其全面質(zhì)量檢測(cè)和整體質(zhì)量控制，從而有助于提高該藥物使用的安全性和穩(wěn)定性。同時(shí)，該方法具有穩(wěn)定性高、精密度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金銀花配方顆粒是通過對(duì)中藥金銀花進(jìn)行提取、濃縮、制粒所得。金銀花為忍冬科 植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，主要含有揮發(fā)油、黃酮類、 三菇類、有機(jī)酸類、環(huán)烯醚菇類、醇類和微量元素等多種成分，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱，涼 血止痢，降血降火，消咽利膈之功效。
[0003] 《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)金銀花的質(zhì)量控制包括原植物品種、藥材性狀、理化鑒別、 含量測(cè)定等項(xiàng)目，文獻(xiàn)也對(duì)金銀花中化學(xué)成分進(jìn)行闡述，包括含有揮發(fā)油、黃酮類、三菇類、 有機(jī)酸類、環(huán)烯醚菇類、醇類和微量元素等成分。然而，一方面，通過上述單一成分的含量測(cè) 定或鑒別金銀花配方顆粒，不能從整體上檢測(cè)和控制其質(zhì)量;另一方面，通過單一成分的含 量測(cè)定聯(lián)合其他成分的鑒別金銀花配方顆粒，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難以廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。
[0004] 因此，建立一種能夠全面地、快速地檢測(cè)金銀花配方顆粒的方法，對(duì)于其全面質(zhì)量 檢測(cè)和整體質(zhì)量控制具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為此，本發(fā)明提出一種建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供一種建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，該方法包括如下步 驟：
[0008] (1)取待測(cè)金銀花的藥物制劑0.3-0.5重量份，精密稱定，精密加入40~60%甲醇 水溶液20-30體積份，稱定重量，加熱回流提取或超聲提取20-40分鐘，放冷，再稱定重量，取 40~60%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0009] (2)精密稱取綠原酸對(duì)照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002-0.00006重量份的溶液，搖勻，作為對(duì)照品A溶液；
[0010] 精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002-0.00006重量份的溶液，搖勻，作為對(duì)照品B溶液；
[0011] 精密稱取蘆丁對(duì)照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002-0.00006 重量份的溶液，搖勻，作為對(duì)照品C溶液；
[0012] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.4%的 磷酸溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫:0_15min，A:B為10% : 90% ; 15-20min，A:B Sl0%:90%4l5%:85%;20min，A:BSl5% :85%;20-50min，A:BSl5%:85% - 20%: 80% ;50min，A:B為20% :80% ;50-55min，A:B為20% :80%-30% :70% ;55min，A:B為30% : 70% ;55-60min，A:B為30% :70% - 10% :90% ;檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，柱溫為35°C，流速為ImL/ min；
[0013] (4)分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液0.010-0.020體積份，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別得供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液 和對(duì)照品C溶液的液相色譜；
[0014] (5)利用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液、對(duì)照 品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液的液相色譜分別經(jīng)過數(shù)據(jù)導(dǎo)入，多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹 配，即得指紋圖譜；
[0015] 所述重量份與所述體積份的關(guān)系為g/mL。
[0016] 優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，該方法包括如下 步驟：
[0017] (1)取待測(cè)金銀花的藥物制劑0.4重量份，精密稱定，精密加入50 %甲醇水溶液25 體積份，稱定重量，加熱回流提取或超聲提取30分鐘，放冷，再稱定重量，取50 %甲醇水溶液 補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0018] (2)精密稱取綠原酸對(duì)照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00004重量份 的溶液，搖勻，作為對(duì)照品A溶液；
[0019] 精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00004重量份的 溶液，搖勻，作為對(duì)照品B溶液；
[0020] 精密稱取蘆丁對(duì)照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00004重量份的溶 液，搖勻，作為對(duì)照品C溶液；
[0021 ] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.4%的 磷酸溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫:0_15min，A:B為10% : 90% ; 15-20min，A:B Sl0%:90%4l5%:85%;20min，A:BSl5% :85%;20-50min，A:BSl5%:85% - 20%: 80% ;50min，A:B為20% :80% ;50-55min，A:B為20% :80%-30% :70% ;55min，A:B為30% : 70% ;55-60min，A:B為30% :70% - 10% :90% ;檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，柱溫為35°C，流速為ImL/ min；
[0022] (4)分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液0.015體 積份，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別得供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品 C溶液的液相色譜；
[0023] (5)利用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液、對(duì)照 品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液的液相色譜分別經(jīng)過數(shù)據(jù)導(dǎo)入，多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹 配，即得指紋圖譜。
[0024] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，以4.6mm X 250mm、5ym的Dikma C18、4 · 6mm XSSOmnKSyn^aKromasillOO-SClSd· 6mmX 250mm、5ym的 Welch Ultimate XB-C18或4.6mmX 250mm、5ym的Agilent Zorbax SB-C18為色譜柱。
[0025] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述藥物 制劑為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液體制 劑或注射制劑。
[0026] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述金銀 花的藥物制劑通過以下方法制備而成：
[0027] 取金銀花，加熱回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少lOmin， 過濾，合并濾液，濾液濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05-1.10，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制 成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、 口服液體制劑或注射制劑。
[0028] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述金銀 花的藥物制劑通過以下方法制備而成：
[0029] 取金銀花，加熱回流提取1~5次，每次加入8~25重量倍量的水提取IOmin~Ih，過 濾，合并濾液，濾液濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05~1.10，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成 臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口 服液體制劑或注射制劑。
[0030] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述金銀 花的藥物制劑通過以下方法制備而成：
[0031] 取金銀花，加熱回流提取2次，第1次加入15重量倍量的水提取0.5h，第2次加入13 重量倍量的水提取〇. 5h，過濾，合并濾液，濾液濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05~1. 10，加入常 規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制 劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑或注射制劑。
[0032] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述金銀 花的藥物制劑的指紋圖譜中，共有特征峰為：1號(hào)峰新綠原酸、2號(hào)峰綠原酸、3號(hào)峰隱綠原 酸、4號(hào)峰蘆丁、5號(hào)峰木犀草苷、6號(hào)峰、7號(hào)峰異綠原酸A和8號(hào)峰異綠原酸C，以2號(hào)峰為內(nèi)參 考峰，各峰號(hào)的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰0.54~0.60、2號(hào)峰1.00、3號(hào)峰1.08~1.19、4號(hào) 峰2.79~3.09、5號(hào)峰3.04~3.36、6號(hào)峰3.51~3.88、7號(hào)峰3.72~4.11、8號(hào)峰4.30~4.75。
[0033] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在 于，所述金銀花的藥物制劑的指紋圖譜中，各峰號(hào)的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰〇.57、2號(hào) 峰1.00、3號(hào)峰1.14、4號(hào)峰2.94、5號(hào)峰3.20、6號(hào)峰3.70、7號(hào)峰3.91、8號(hào)峰4.52。
[0034] 本發(fā)明還提供上述方法在金銀花的藥物制劑的質(zhì)量檢測(cè)和質(zhì)量控制中的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0036] 本發(fā)明所述建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，以金銀花配方顆粒為檢測(cè) 對(duì)象，建立了針對(duì)該藥物制劑的指紋圖譜的方法，獲得了較為全面的圖譜信息，確認(rèn)了共有 特征峰1號(hào)峰新綠原酸、2號(hào)峰綠原酸、3號(hào)峰隱綠原酸、4號(hào)峰蘆丁、5號(hào)峰木犀草苷、6號(hào)峰、7 號(hào)峰異綠原酸A和8號(hào)峰異綠原酸C，選擇2號(hào)峰綠原酸作為指紋圖譜中的內(nèi)參考峰，確定了 金銀花配方顆粒的共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，且結(jié)合該指紋圖譜中多個(gè)色譜峰的信息， 能夠全面地、快速地檢測(cè)金銀花配方顆粒的質(zhì)量，有利于其全面質(zhì)量檢測(cè)和整體質(zhì)量控制， 從而有助于提高該藥物使用的安全性和穩(wěn)定性。同時(shí)，該方法具有穩(wěn)定性高、精密度高、重 復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0037] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中：
[0038]圖1~圖5分別是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中梯度1、2、3、4、5的色譜圖；
[0039] 圖6~圖9分別是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中不同流動(dòng)相的色譜圖；
[0040] 圖10~圖13是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中不同色譜柱的色譜圖；
[0041] 圖14~圖16是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中不同流速的色譜圖；
[0042]圖17~圖20是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中不同柱溫的色譜圖；
[0043]圖21~圖24是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中不同進(jìn)樣量的色譜圖；
[0044]圖25~圖31是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2中不同提取溶劑的色譜圖；
[0045]圖32~35是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2中不同提取時(shí)間的色譜圖；
[0046]圖36~38是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2中不同溶劑加入量的色譜圖；
[0047]圖39是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例3中18批金銀花配方顆粒的特征指紋圖譜；；
[0048]圖40是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例3中金銀花配方顆粒的對(duì)照特征指紋圖譜；
[0049] 圖41是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例3中不同特征峰的對(duì)照品定位圖；
[0050] 圖42是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4中精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[00511圖43是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4中重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0052]圖44是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4中專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0053]圖45是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4中穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 實(shí)施例1
[0055] 以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例中，金銀花配方顆粒的制備方法為:取金銀花，加熱回流提取 2次，第1次加入15重量倍量的水提取0.5h，第2次加入13重量倍量的水提取0.5h，過濾，合并 濾液，濾液濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05~1.10，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成顆粒劑。
[0056] 實(shí)施例2
[0057]本實(shí)施例建立金銀花配方顆粒的指紋圖譜的方法，包括如下步驟：
[0058] (1)取待測(cè)金銀花的藥物制劑0.4g，精密稱定，精密加入50 %甲醇水溶液25mL，稱 定重量，加熱回流提取或超聲提取30分鐘，放冷，再稱定重量，取50 %甲醇水溶液補(bǔ)足減失 的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0059] (2)精密稱取綠原酸對(duì)照品，加50%甲醇水溶液制成每ImL含0.00004g的溶液，搖 勻，作為對(duì)照品A溶液；
[0060] 精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加50%甲醇水溶液制成每ImL含0.00004g的溶液，搖 勻，作為對(duì)照品B溶液；
[0061 ] 精密稱取蘆丁對(duì)照品，加50 %甲醇水溶液制成每ImL含0.00004g的溶液，搖勻，作 為對(duì)照品C溶液；
[0062] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.4%的磷酸溶液為流動(dòng)相B按照 如下程序進(jìn)行梯度洗脫：〇-15min，A:B為 10% :90% ;15-20min，A:B為 10% :90% - 15% : 85% ;20min，A:B為 15% :85% ;20-50min，A:B為 15% :85%-20% :80% ;50min，A:B為20% : 80% ;50-55min，A:B為20% :80%-30% :70% ;55min，A:B為30% :70% ;55-60min，A:B為 30%:70%410%:90%;檢測(cè)波長(zhǎng)為35011111，柱溫為35°(：，流速為1111171^11 ;
[0063] ( 4 )分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液 0.015mL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別得供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì) 照品C溶液的液相色譜；
[0064] (5)利用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液、對(duì)照 品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液的液相色譜分別經(jīng)過數(shù)據(jù)導(dǎo)入，多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹 配，即得指紋圖譜。
[0065] 實(shí)施例3
[0066] 本實(shí)施例建立金銀花配方顆粒的指紋圖譜的方法，包括如下步驟：
[0067] (1)取待測(cè)金銀花的藥物制劑0.3g，精密稱定，精密加入60 %甲醇水溶液20mL，稱 定重量，加熱回流提取或超聲提取40分鐘，放冷，再稱定重量，取60 %甲醇水溶液補(bǔ)足減失 的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0068] (2)精密稱取綠原酸對(duì)照品，加60%甲醇水溶液制成每ImL含0.00002g的溶液，搖 勻，作為對(duì)照品A溶液；
[0069] 精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加60%甲醇水溶液制成每ImL含0.00002g的溶液，搖 勻，作為對(duì)照品B溶液；
[0070] 精密稱取蘆丁對(duì)照品，加 60 %甲醇水溶液制成每ImL含0.00002g的溶液，搖勻，作 為對(duì)照品C溶液；
[0071] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.4%的磷酸溶液為流動(dòng)相B按照 如下程序進(jìn)行梯度洗脫：〇-15min，A:B為 10% :90% ;15-20min，A:B為 10% :90% - 15% : 85% ;20min，A:B為 15% :85% ;20-50min，A:B為 15% :85%-20% :80% ;50min，A:B為20% : 80% ;50-55min，A:B為20% :80%-30% :70% ;55min，A:B為30% :70% ;55-60min，A:B為 30%:70%410%:90%;檢測(cè)波長(zhǎng)為35011111，柱溫為35°(：，流速為1111171^11 ;
[0072] ( 4 )分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液 O.OlOmL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別得供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì) 照品C溶液的液相色譜；
[0073] (5)利用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液、對(duì)照 品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液的液相色譜分別經(jīng)過數(shù)據(jù)導(dǎo)入，多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹 配，即得指紋圖譜。
[0074] 實(shí)施例4
[0075] 本實(shí)施例建立金銀花配方顆粒的指紋圖譜的方法，包括如下步驟：
[0076] (1)取待測(cè)金銀花的藥物制劑0.5g，精密稱定，精密加入40 %甲醇水溶液30mL，稱 定重量，加熱回流提取或超聲提取20分鐘，放冷，再稱定重量，取40 %甲醇水溶液補(bǔ)足減失 的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0077] (2)精密稱取綠原酸對(duì)照品，加40%甲醇水溶液制成每ImL含0.00006g的溶液，搖 勻，作為對(duì)照品A溶液；
[0078] 精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加 40%甲醇水溶液制成每ImL含0.00006g的溶液，搖 勻，作為對(duì)照品B溶液；
[0079] 精密稱取蘆丁對(duì)照品，加 40 %甲醇水溶液制成每ImL含0.00006g的溶液，搖勻，作 為對(duì)照品C溶液；
[0080] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.4%的磷酸溶液為流動(dòng)相B按照 如下程序進(jìn)行梯度洗脫：〇-15min，A:B為 10% :90% ;15-20min，A:B為 10% :90% - 15% : 85% ;20min，A:B為 15% :85% ;20-50min，A:B為 15% :85%-20% :80% ;50min，A:B為20% : 80% ;50-55min，A:B為20% :80%-30% :70% ;55min，A:B為30% :70% ;55-60min，A:B為 30%:70%410%:90%;檢測(cè)波長(zhǎng)為35011111，柱溫為35°(：，流速為1111171^11 ;
[00811 ( 4 )分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液 0.020mL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別得供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì) 照品C溶液的液相色譜；
[0082] (5)利用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液、對(duì)照 品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液的液相色譜分別經(jīng)過數(shù)據(jù)導(dǎo)入，多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹 配，即得指紋圖譜。
[0083] 實(shí)驗(yàn)例
[0084] 1、儀器與試藥
[0085] 儀器包括:高效液相色譜儀;天平;超聲波發(fā)生器;超純水系統(tǒng)；
[0086] 試藥包括:乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純;金銀花配方顆粒(序 號(hào)1-15)由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，按照實(shí)施例1的制備方法制備而成。
[0087]實(shí)施例1色譜分析條件的確定 [0088] (1)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
[0089] 分析不同吸收波長(zhǎng)(327腦、35〇]1111、35411111、21〇11111)下的色譜圖，以色譜峰數(shù)量和峰 高作為指標(biāo)，確定350nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0090] (2)梯度的選擇
[0091] 不同的梯度洗脫程序如表1~5所示，不同梯度洗脫程序的色譜圖如圖1~5所示。 由圖1~5可知，梯度4和梯度5洗脫呈現(xiàn)的圖譜，其色譜信息較豐富，主要色譜峰分離度高， 基線較平穩(wěn)且分析時(shí)間較為合理，確定了流動(dòng)相梯度為梯度5。
[0092]表1梯度1的梯度洗脫程序
[0096]表3梯度3的梯度洗脫程序 L0102」（3)流動(dòng)相成分的選擇
[0103] 選擇流動(dòng)相分別為0.3 %磷酸-乙腈、0.4%磷酸-乙腈、0.5 %磷酸-乙腈、0.5 %冰 醋酸-乙腈的金銀花配方顆粒分離效果，各流動(dòng)相的色譜圖如圖6~9所示。由圖6~9可知， 與其他流動(dòng)相比，0.4%磷酸-乙腈更適合于金銀花配方顆粒所有成分的分離。
[0104] (4)不同色譜柱的考察
[0105] 取同一份金銀花配方顆粒樣品的供試品溶液，考察了實(shí)驗(yàn)室中現(xiàn)有的色譜柱：（1) DikmaC18(2)5ym 4.6mmX250mm Ser#201042495; (2)Kromasil 100-5C18 5ym 4.6mmX 250mm S/N:E75576;(3)welch Ultimate XB-C18 5ym4.6mmX250mm S/N:211203667;(4) Agilent Zorbax SB-C18 5ym4.6mmX 250mm PN:880975_902。按I .OmL/min的流速進(jìn)行梯度 洗脫分析，不同色譜柱的色譜圖如圖10~13所示。由圖10~13可知，Agilent Zorbax SB-C18對(duì)金銀花配方顆粒的分離效果較好。
[0106] (5)不同流速的考察
[0107] 分別以0.8mL/min、1.0 mL/min，1.2mL/min流速測(cè)定，不同流速的色譜圖如圖14~ 16所示。由圖14~16可知，流速為1.0 mL/min流速的色譜效果較好。
[0108] (6)不同柱溫的選擇
[0109] 取同一份金銀花配方顆粒樣品的供試品溶液，考察不同柱溫25°C、30°C、35°C、40 °C對(duì)本品的分離效果，不同柱溫的色譜圖如圖17~20所示，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)如表6所示。由 圖17~20和表6可知，柱溫為35°C、40°C的色譜圖，其各成分分離效果較好，結(jié)合綠原酸和木 犀草苷的色譜峰系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)以及色譜峰的個(gè)數(shù)，故選擇柱溫為35°C。
[0110] 表6柱溫為35°C、40°C的色譜峰系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)
[0112] (7)進(jìn)樣量考察
[0113] 進(jìn)樣量為5yL、IOyU 15yL、20yL的色譜圖如圖21~24所示，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)如表7 所示。由圖21~24和表7可知，進(jìn)樣量為15yL的色譜圖的效果較好。
[0114] 表7不同進(jìn)樣量的色譜峰的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)

[0117] (8)最終色譜條件
[0118] 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250mm，4.6mm，5ym);以乙臆-0.4%磷酸 溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫如表8所示;流速：1.0 mL/min;柱溫為35°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，理論 板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，進(jìn)樣量:15yL。
[0119] 表8梯度洗脫稈序
[0121 ]實(shí)驗(yàn)例2供試品溶液的制備 [0122] (1)提取溶劑的選擇
[0123] 提取溶劑為水、乙醇、甲醇、70%乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇色譜圖如圖 25~31所示，主要特征峰的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)如表9所示。由圖25~31和表9可知，提取溶劑為 50 %的甲醇時(shí)，所得色譜圖的峰型較好，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)相對(duì)較優(yōu)。
[0124] 表1不同提取溶劑的色譜圖的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)

[0127] (2)提取時(shí)間的選擇
[0128] 提取時(shí)間為15111丨11、3〇111丨11、45111丨11、6〇111丨11的色譜圖如圖32~35所示，系統(tǒng)適應(yīng)性參 數(shù)如表10所示。由圖32~35和表10所示，不同的超聲時(shí)間的溶解效果及色譜圖無明顯差異， 故選擇提取時(shí)間為30min。
[0129] 表2不同提取時(shí)間下金銀花配方顆粒色譜圖參數(shù)

[0132] (3)提取溶劑加入量的選擇
[0133] 根據(jù)確定的提取溶劑，考察50 %甲醇的不同加入量：15mL、25mL、50mL，以綠原酸和 木犀草苷的分離效果和系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)作為考察指標(biāo)，不同提取溶劑的加入量的色譜圖36 ~38所示，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)如表11所示。如圖36~38和表11可知，加入不同體積的提取溶劑 對(duì)金銀花配方顆粒的提取效果相近，色譜分離效果無明顯差異。因此選擇25mL的50%甲醇 的色譜圖的效果較好。
[0134] 表3不同提取溶劑量的色譜峰的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)

[0137] (3)最終提取方案
[0138] 供試品溶液的制備方法為:取本品粉末約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密 加入50%甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率35kHz)30分鐘，取出，放冷， 再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0139] 實(shí)驗(yàn)例3金銀花配方顆粒特征指紋圖譜的建立
[0140]參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)指南(試行)》，利用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的 "中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版"軟件，通過對(duì)所得指紋圖譜的進(jìn)行相似度比較 (以平均數(shù)建立參照特征指紋圖譜），并進(jìn)行方法學(xué)考察。
[0141]根據(jù)實(shí)驗(yàn)例1和2,確定金銀花配方顆粒HPLC特征指紋圖譜按如下方法建立：（1)供 試品溶液的制備：取金銀花配方顆粒粉末約〇.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 50 %甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率35kHz) 30分鐘，取出，放冷，再稱 定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得;參照物溶液的制備:取綠 原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加 50%甲醇分別制成每ImL含40yg的溶液，即得（HTC以下保存）。取木犀草苷對(duì)照品適量，精 密稱定，加50 %甲醇制成每ImL含40yg的溶液，即得。取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加50 % 甲醇制成每ImL含40yg的溶液，即得。（2)高效液相HPLC色譜分析條件：色譜柱：Agi lent 2〇^&138-(：18色譜柱(250111111，4.6111111，5以111);以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫如 表8所示;流速：I .OmL/min;柱溫為35°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，理論板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)算應(yīng) 不低于2000,進(jìn)樣量：15yL。按上述方法進(jìn)行金銀花配方顆粒特征指紋圖譜的共有模式的建 立。
[0142] 取18個(gè)批次的金銀花配方顆粒樣品作為供試品溶液，通過高效液相色譜得到金銀 花配方顆粒特征指紋圖譜，圖39為18批金銀花配方顆粒的特征指紋圖譜(SI~S18依次為批 號(hào)Sl:130602 S2:130603 S3:130604 S4:A1300777 S5:A1300855 S6:A1300856 S7: 1307001S S8：1307002S S9：1307003S S10：1305399 Sll：1305400 S12：1305401 S13： 1303093 S14:1303105 S15:1303117 S16:G1305004 S17:G1305005 S18:G1305006)，圖40 為金銀花配方顆粒對(duì)照特征指紋圖譜。
[0143] 采用藥典委員會(huì)編制的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件"中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 系統(tǒng)2012版"，生成對(duì)照特征指紋圖譜，對(duì)配方顆粒特征圖的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析、比較。由圖 39可知，金銀花配方顆粒HPLC特征指紋圖譜共有色譜峰8個(gè)，其中7個(gè)峰(峰1、2、3、4、5、7、8) 為已知成分峰;選取2號(hào)峰綠原酸為內(nèi)參考峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì) 保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的± 5 %范圍之內(nèi)，規(guī)定值分別為:0.57 (1號(hào)峰，新綠原酸）、1.0 O (2號(hào) 峰，綠原酸）、1.14(3號(hào)峰，隱綠原酸）、2.94(4號(hào)峰，蘆?。?、3.20(5號(hào)峰，木犀草苷）、3.70(6 號(hào)峰）、3.91 (7號(hào)峰，異綠原酸A)、4.52(8號(hào)峰，異綠原酸C)。所得結(jié)果如表12~15所示，不同 特征峰的對(duì)照品定位見圖41所示。
[0144] 表4金銀花配方顆粒共有模式相對(duì)保留時(shí)間
[0149]表6 18批金銀花配方顆粒特征指紋圖譜測(cè)定結(jié)果

[0154] 實(shí)驗(yàn)例4金銀花配方顆粒特征圖譜的方法學(xué)驗(yàn)證
[0155] 4.1精密度
[0156] 4.1.1精密度實(shí)驗(yàn)
[0157] 取同一份供試品溶液(批號(hào)1307002S)，按實(shí)驗(yàn)例3項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè) 定8個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果如表16~17所示，精密度實(shí)驗(yàn)的色譜圖如圖42所示。由 表16~17和圖42可知，各特征峰與參照物S峰(2號(hào)峰）的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.33%、 0%、0.05%、0.36 %、0.35 %、0.32%、0.32%、0.30 %，與金銀花配方顆粒對(duì)照特征圖譜的 相似度分別大于〇. 998，這表明精密度較好。
[0158] 表8精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0160]表9精密度實(shí)驗(yàn)相似度結(jié)果
[0162] 4.1.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
[0163] 取同一批號(hào)供試品（批號(hào)為1307002S)6份，按實(shí)驗(yàn)例3的方法分別測(cè)定8個(gè)共有峰 的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果如表18~19所示，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的色譜圖如圖43所示。由表18~19和圖 43可知，結(jié)果各特征峰與內(nèi)參考峰（2號(hào)峰）的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.19%、0 %、 0.05%、0.23%、0.23%、0.22%、0.23%、0.21%，與金銀花配方顆粒對(duì)照特征圖譜的相似 度分別大于〇. 997，表明本方法重復(fù)性較好。
[0164] 表10重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n = 6)
[0168] 4.2專屬性實(shí)驗(yàn)
[0169] 供試品采用提取溶劑為50%甲醇，精密吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液(50%甲醇 +麥芽糊精）各15yL，分別注入高效液相色譜儀，按實(shí)驗(yàn)例的方法，結(jié)果如圖44所示。由圖44 可知，空白溶劑在相應(yīng)保留時(shí)間處無色譜峰，無干擾，符合要求。
[0170] 4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0171] 取同一批號(hào)供試品（批號(hào)1307002S)，按實(shí)驗(yàn)例3方法操作，分別在0、1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定8個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果如表20~21所示，穩(wěn)定 性實(shí)驗(yàn)的色譜圖如圖45所示。由表20~21和圖45所示，各特征峰與參照物S峰（2號(hào)峰）的相 對(duì)保留時(shí)間的 RSD 分別為 0.29%、0%、0.09%、0.42%、0.41%、0.38%、0.37%、0.32%，與 金銀花配方顆粒對(duì)照特征圖譜的相似度分別大于0.998;這表明供試品溶液在21小時(shí)內(nèi)穩(wěn) 定，符合測(cè)定要求。
[0172] 表20穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0174]表21穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的相似度結(jié)果
[0176]顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì) 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或 變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于， 該方法包括如下步驟： (1) 取待測(cè)金銀花的藥物制劑0.3-0.5重量份，精密稱定，精密加入40~60 %甲醇水溶 液20-30體積份，稱定重量，加熱回流提取或超聲提取20-40分鐘，放冷，再稱定重量，取40~ 60%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液； (2) 精密稱取綠原酸對(duì)照品，加4 0~6 0 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.0 0 0 0 2 - 0.00006重量份的溶液，搖勻，作為對(duì)照品A溶液； 精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002-0.00006 重量份的溶液，搖勻，作為對(duì)照品B溶液； 精密稱取蘆丁對(duì)照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002-0.00006重量 份的溶液，搖勻，作為對(duì)照品C溶液； (3) 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.4%的磷酸 溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0-15min，A: B為10 % : 90% ; 15-20min，A: B為 10% :90% - 15% :85% ;20min，A:B為 15% :85% ;20-50min，A:B為 15% :85%-20% :80% ; 50min，A:B為20% :80% ;50-55min，A:B為20% :80%-30% :70% ;55min，A:B為30% :70% ; 55-60min，A:B為30% :70% - 10% :90% ;檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，柱溫為35°C，流速為lmL/min; (4) 分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液0.010-0.020 體積份，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別得供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照 品C溶液的液相色譜； (5) 利用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液、對(duì)照品A 溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液的液相色譜分別經(jīng)過數(shù)據(jù)導(dǎo)入，多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，即 得指紋圖譜； 所述重量份與所述體積份的關(guān)系為g/mL。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，該方 法包括如下步驟： (1) 取待測(cè)金銀花的藥物制劑〇 . 4重量份，精密稱定，精密加入50%甲醇水溶液25體積 份，稱定重量，加熱回流提取或超聲提取30分鐘，放冷，再稱定重量，取50 %甲醇水溶液補(bǔ)足 減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液； (2) 精密稱取綠原酸對(duì)照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00004重量份的溶 液，搖勻，作為對(duì)照品A溶液； 精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加50 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00004重量份的溶 液，搖勻，作為對(duì)照品B溶液； 精密稱取蘆丁對(duì)照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00004重量份的溶液，搖 勻，作為對(duì)照品C溶液； (3) 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.4%的磷酸 溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0-15min，A: B為10 % : 90% ; 15-20min，A: B為 10% :90% - 15% :85% ;20min，A:B為 15% :85% ;20-50min，A:B為 15% :85%-20% :80% ; 50min，A:B為20% :80% ;50-55min，A:B為20% :80%-30% :70% ;55min，A:B為30% :70% ; 55-60min，A:B為30% :70% - 10% :90% ;檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，柱溫為35°C，流速為lmL/min; (4) 分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品A溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液Ο . 015體積 份，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別得供試品溶液、對(duì)照品Α溶液、對(duì)照品Β溶液和對(duì)照品C 溶液的液相色譜； (5) 利用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液、對(duì)照品A 溶液、對(duì)照品B溶液和對(duì)照品C溶液的液相色譜分別經(jīng)過數(shù)據(jù)導(dǎo)入，多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，即 得指紋圖譜。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于， 以4.6mmX250mm、5ym的Dikma C18、4.6mmX250mm、5ym的Kromasil 100-5 C18、4.6mmX 250mm、5ym的Welch Ultimate XB-C18或4.6mmX250mm、5ym的Agilent Zorbax SB-C18為色 譜柱。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征 在于，所述藥物制劑為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制 劑、口服液體制劑或注射制劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征 在于，所述金銀花的藥物制劑通過以下方法制備而成： 取金銀花，加熱回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少lOmin，過濾， 合并濾液，濾液濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05-1.10，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床 上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液 體制劑或注射制劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，所述 金銀花的藥物制劑通過以下方法制備而成： 取金銀花，加熱回流提取1~5次，每次加入8~25重量倍量的水提取lOmin~lh，過濾， 合并濾液，濾液濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05~1.10，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨 床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服 液體制劑或注射制劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，所述 金銀花的藥物制劑通過以下方法制備而成： 取金銀花，加熱回流提取2次，第1次加入15重量倍量的水提取0.5h，第2次加入13重量 倍量的水提取〇. 5h，過濾，合并濾液，濾液濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05~1.10，加入常規(guī)輔 料，按照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、 速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑或注射制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征 在于，所述金銀花的藥物制劑的指紋圖譜中，共有特征峰為：1號(hào)峰新綠原酸、2號(hào)峰綠原酸、 3號(hào)峰隱綠原酸、4號(hào)峰蘆丁、5號(hào)峰木犀草苷、6號(hào)峰、7號(hào)峰異綠原酸A和8號(hào)峰異綠原酸C，以 2號(hào)峰為內(nèi)參考峰，各峰號(hào)的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰0.54~0.60、2號(hào)峰1.00、3號(hào)峰 1.08~1.19、4號(hào)峰2.79~3.09、5號(hào)峰3.04~3.36、6號(hào)峰3.51~3.88、7號(hào)峰3.72~4.11、8 號(hào)峰4.30~4.75。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的建立金銀花的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，所述 金銀花的藥物制劑的指紋圖譜中，各峰號(hào)的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰0.57、2號(hào)峰1.00、3
【文檔編號(hào)】G01N30/86GK105842373SQ201610421439
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】譚沛, 鄭曉英, 張輝, 馬鵬崗, 高雅, 石子儀
【申請(qǐng)人】華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司