模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法，包括以下步驟：將農(nóng)藥殺菌劑配制成梯度濃度的試驗(yàn)藥液；將生物藻原液用無菌水稀配制成藻稀釋液；將試驗(yàn)藥液與藻稀釋液混合，密封條件下培養(yǎng)72h，每隔24h對藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，并記錄藻細(xì)胞的生物效應(yīng)和試驗(yàn)液的理化參數(shù)；根據(jù)藻細(xì)胞的生物效應(yīng)參數(shù)計(jì)算農(nóng)藥殺菌劑對藻細(xì)胞的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50，判斷農(nóng)藥殺菌劑的毒性。本發(fā)明的方法具有易操作、實(shí)用性強(qiáng)、周期短，評價終點(diǎn)容易判斷等優(yōu)勢。
【專利說明】
模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，對水體的平衡和穩(wěn)定起著極其重要的作 用。生物測試中的藻類測試是水生生態(tài)毒理學(xué)研究中必不可少的方法，農(nóng)藥在田間使用后 會迀移進(jìn)入水體中，會對藻類的生長產(chǎn)生影響，從而影響整個生態(tài)系統(tǒng)。藻常被用于新化學(xué) 物質(zhì)登記中的藻類生長抑制毒性試驗(yàn)研究和農(nóng)藥登記藻類生長抑制毒性試驗(yàn)研究。
[0003] 目前，國內(nèi)外關(guān)于農(nóng)藥殺菌劑毒性篩選的研究報(bào)道較少，即使有部分報(bào)道和相關(guān) 研究性的模型，但是缺乏相關(guān)的研究數(shù)據(jù)評估該模型的適宜性和可靠性，并成為成熟和認(rèn) 可的毒性篩選模型。因此，提供一種易操作、實(shí)用性強(qiáng)的藻類篩選農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法尤 其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種易操作、實(shí)用性強(qiáng)的 模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，提供了一種模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法，包括 以下步驟：
[0006] Sl、將農(nóng)藥殺菌劑配制成梯度濃度的試驗(yàn)藥液；
[0007] S2、將生物藻原液用無菌水稀配制成藻稀釋液；
[0008] S3、將所述試驗(yàn)藥液與所述藻稀釋液混合，密封條件下培養(yǎng)72h，每隔24h對藻細(xì)胞 計(jì)數(shù)，并記錄藻細(xì)胞的生物效應(yīng)和試驗(yàn)液的理化參數(shù)；
[0009] S4、根據(jù)藻細(xì)胞的生物效應(yīng)參數(shù)計(jì)算農(nóng)藥殺菌劑對藻細(xì)胞的半數(shù)效應(yīng)濃度EC5〇,判 斷農(nóng)藥殺菌劑的毒性。
[0010] 上述的方法，優(yōu)選的，所述Sl步驟具體為：將農(nóng)藥殺菌劑與BGll培養(yǎng)基稀釋液混 合，配制成梯度濃度的試驗(yàn)藥液。
[0011] 上述的方法，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基稀釋液為將BGll培養(yǎng)基稀釋10倍后的溶液。
[0012] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟S2中所述生物藻原液為處于對數(shù)生長期的純種藻。
[0013] 上述的方法，優(yōu)選的，所述、藻稀釋液中藻細(xì)胞的濃度為1.0 XIO4~1.0 X IO5個/ mL〇
[0014] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟S3中所述，試驗(yàn)藥液與所述藻稀釋液的體積比為1: Io
[0015] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟S3中所述培養(yǎng)的條件為:溫度為21°C~24tC、光照 強(qiáng)度為4440Lux~8880Lux、光照比為16h/8h。
[0016]上述的方法，優(yōu)選的，培養(yǎng)期間，每隔24h搖動三角瓶中溶液的次數(shù)不少于5次。
[0017] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟S3中所述藻細(xì)胞的生物反應(yīng)效應(yīng)包括藻細(xì)胞的抑 制率和藻細(xì)胞的中毒情況;所述藻細(xì)胞的中毒情況包括:藻細(xì)胞畸形、藻液變白、藻細(xì)胞體 積變小、藻細(xì)胞粘連或聚結(jié)。
[0018] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟S3中所述試驗(yàn)液的理化參數(shù)包括:試驗(yàn)液的水溫、 pH值和光照強(qiáng)度。
[0019] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟S4中采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS，以農(nóng)藥殺菌劑濃度的對數(shù) 值為自變量X，以抑制率的機(jī)率值(抑制機(jī)率值即藻細(xì)胞的濃度變化值)為因變量y，建立毒 力回歸方程，計(jì)算受試物對藻類生長抑制的半數(shù)效應(yīng)濃度EC 50。
[0020]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟S4中所述農(nóng)藥毒級判斷標(biāo)準(zhǔn)為EC5Q<0.3mg a.i./ L，高毒；0.300<EC5〇<3.00mg a.i./L，中毒;EC5〇>3.0mg a.i./L，低毒。
[0021] 上述的方法，優(yōu)選的，所述模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法還設(shè)有空白對 照組，所述空白對照組以藻稀釋液與培養(yǎng)基的混合物培養(yǎng)生物藻。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0023] (1)本發(fā)明提供了一種操作簡便、實(shí)用性強(qiáng)的模式生物藻類篩選農(nóng)藥殺菌劑毒性 的方法;該方法可初步判斷出農(nóng)藥殺菌劑的毒性，速度快，精確度高。
[0024] (2)本發(fā)明提供了一種模式生物藻類測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法，急性毒性試驗(yàn) 周期短，評價終點(diǎn)容易判斷，具有簡單、易操作的優(yōu)勢。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0026] 實(shí)施例
[0027]以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0028] 實(shí)施例1:
[0029] -種本發(fā)明的模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法，包括以下步驟：
[0030] Sl、試驗(yàn)藥液的配制：
[0031] 配制BGll培養(yǎng)基稀釋液:按照表1的配方配制BGll培養(yǎng)基配方，其制備方法為:將 表1中的成分配制成相應(yīng)母液濃度，并按照標(biāo)明順序依次將相應(yīng)母液用量轉(zhuǎn)移至1000 rnL容 量瓶中，并用蒸餾水定容至1000 mL，在121°C下高壓滅菌15min，密封并貼好標(biāo)簽，4°C冰箱保 存，有效期2個月。將BGll培養(yǎng)基用蒸餾水稀釋10倍后即為BGll培養(yǎng)基稀釋液。
[0032] 稱取50%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑O.lOOOg，以BGll培養(yǎng)基稀釋液溶解并定容至IOOmL容 量瓶，得到濃度為500mg a.i./L的儲備液。依次移取上述儲備液0.100、0.200、0.400、 0.800、1.600、3.200mL于250mL容量瓶中，用8611培養(yǎng)基稀釋液定容至25〇11^，得到濃度分別 為0·200、0·400、0.800、1·60、3·20、6.40mg a.i./L的試驗(yàn)藥液。
[0033] 表1: BGl 1培養(yǎng)基配方
[0035] S2、藻稀釋液的配制：用血球計(jì)數(shù)法測定藻原液(羊角月牙藻）的細(xì)胞濃度為4.00 X IO6個/mL，并用無菌水稀釋100倍得到藻稀釋液，藻稀釋液中藻細(xì)胞濃度為4.OOX IO4個/ mL〇
[0036] S3、染毒：
[0037]實(shí)驗(yàn)組:取步驟Sl中配制的梯度濃度的實(shí)驗(yàn)藥液50mL分別加入步驟S2中50mL的藻 稀釋液，得到梯度濃度的生物藻用培養(yǎng)基。試驗(yàn)中藻起始濃度為2.00 X IO4個/mL。
[0038] 空白對照組:取50mL藻稀釋液與50mL BGl 1培養(yǎng)基稀釋液混勻得到生物藻用培養(yǎng) 基。
[0039]分別將實(shí)驗(yàn)組和空白對照組的生物藻用培養(yǎng)基裝入三角瓶中，用錫箱紙封口，并 置于智能人工氣候箱中培養(yǎng)，控制在光照條件下放置16h，黑暗環(huán)境下放置8h;每天白天每 隔2小時搖動1次，共搖動5次。
[0040] S4、試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄：
[0041 ] 測得試驗(yàn)期間各濃度組的水溫為22.2°C~23.5 °C，pH值為6.88~7.26，培養(yǎng)箱中 的光照強(qiáng)度為5200LUX~5650LUX。染毒后48h、72h受抑制藻液細(xì)胞體積變小，觀察并記錄染 毒后Oh、24h、48h、72h藻細(xì)胞濃度(具體數(shù)據(jù)見表2)。
[0042]表2:50 %苯醚甲環(huán)唑懸浮劑對羊角月牙藻生長抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表
[0044] 注：f表示藻細(xì)胞平均濃度(個/mL)
[0045] S5、數(shù)據(jù)處理：
[0046]采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0，以藥劑濃度的對數(shù)值為自變量X，以（校正)抑制率的機(jī)率 值為因變量y，建立毒力回歸方程。計(jì)算該供試物對藻類生長抑制的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50和 95%置信限，計(jì)算結(jié)果列于表3中。
[0047]表3:50 %苯醚甲環(huán)唑懸浮劑對羊角月牙藻生長抑制試驗(yàn)結(jié)果表
[0049] 通過上述方法計(jì)算得到50 %苯醚甲環(huán)唑懸浮劑對羊角月牙藻生長抑制的EC50 (72h)為0.759mg a.i./L，95%置信限為0.603~0.973mg a.i./L。
[0050] S6、結(jié)果評價：
[0051] 根據(jù)EC5q值判斷農(nóng)藥毒級。農(nóng)藥對藻類的生長抑制毒性按EC5Q(72h)的大小劃分為 三個等級：高毒(EC 5〇< 0.300mg a.i./L);中毒（0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L); 低毒(EC5〇>3.00mg a.i./L)。
[0052] 在本試驗(yàn)條件下，50%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑對羊角月牙藻生長抑制的EC5Q(72h)為 0.759mg a.i./L，0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L，毒性等級為"中毒"。
[0053] 實(shí)施例2
[0054] 一種本發(fā)明的模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法，包括以下步驟：
[0055] 1、試驗(yàn)藥液配制：
[0056] 移取80克/升戊唑醇懸浮種衣劑0.625mL，以BGll培養(yǎng)基稀釋液(BGll稀釋液的成 分與實(shí)施例1相同）溶解并定容至IOOmL容量瓶，得到濃度為500mg a. i . /L的儲備液。依次移 取上述儲備液〇. 300、0.600、1.200、2.400、4.800mL，分別用BGl 1培養(yǎng)基稀釋液定容至250mL 容量瓶中，配制成濃度為〇. 600、1.20、2.40、4.80、9.60mg a. i . /L的2倍試驗(yàn)藥液。
[0057] S2、藻稀釋液的配制：用血球計(jì)數(shù)法測定藻原液(羊角月牙藻）的細(xì)胞濃度為4.00 X 1〇6,并用無菌水稀釋100倍得到藻稀釋液，藻稀釋液中藻細(xì)胞濃度為4.OOX IO4個/mL。 [0058] S3、染毒：
[0059]實(shí)驗(yàn)組:取步驟Sl中配制的梯度濃度的實(shí)驗(yàn)藥液50mL分別加入步驟S2中50mL的藻 稀釋液，得到梯度濃度的生物藻用培養(yǎng)基。試驗(yàn)中藻起始濃度為2.00 X IO4個/mL。
[0060] 空白對照組:取50mL藻稀釋液與50mL BGll培養(yǎng)基稀釋液混勻。
[0061] 分別將實(shí)驗(yàn)組和空白對照組的生物藻用培養(yǎng)基裝入三角瓶中，用錫箱紙封口，并 置于智能人工氣候箱中培養(yǎng)，控制在光照條件下放置16h，黑暗環(huán)境下放置8h;每天白天每 隔2小時搖動1次，共搖動5次。
[0062] S4、試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄：
[0063] 測得試驗(yàn)期間各濃度組的水溫為22. (TC~23 . TC，pH值為6.74~7.16，培養(yǎng)箱中 的光照強(qiáng)度為5200LUX~5700LUX。染毒后48h、72h受抑制藻液細(xì)胞體積變小，觀察并記錄染 毒后Oh、24h、48h、72h藻細(xì)胞濃度(具體數(shù)據(jù)見表4)。
[0064]表4:80克/升戊唑醇懸浮種衣劑對羊角月牙藻生長抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表
[0067] 注：T表示藻細(xì)胞平均濃度(個/mL)
[0068] S5、數(shù)據(jù)處理：
[0069]采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0，以藥劑濃度的對數(shù)值為自變量X，以（校正)抑制率的機(jī)率 值為因變量y，建立毒力回歸方程。計(jì)算該供試物對藻類生長抑制的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50和 95%置信限，計(jì)算結(jié)果列于表5中。
[0070]表5:80克/升戊唑醇懸浮種衣劑對羊角月牙藻生長抑制試驗(yàn)結(jié)果表
[0072]通過上述方法計(jì)算得到80克/升戊唑醇懸浮種衣劑對羊角月牙藻生長抑制的EC50 (72h)為 1.37mg a.i./L，95%置信限為 1.15~1.66mg a.i./L。
[0073] S6、結(jié)果評價：
[0074] 根據(jù)EC5q值判斷農(nóng)藥毒級。農(nóng)藥對藻類的生長抑制毒性按EC5Q(72h)的大小劃分為 三個等級：高毒(EC5〇< 0.300mg a.i./L);中毒（0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L); 低毒(EC5〇>3.00mg a.i./L)。
[0075] 在本試驗(yàn)條件下，80克/升戊唑醇懸浮種衣劑對羊角月牙藻生長抑制的EC5Q(72h) 為1.37mg a.i./L，0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L，毒性等級為"中毒"。
[0076] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖 然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi) 容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此， 凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單 修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種模式生物藻測定農(nóng)藥殺菌劑毒性的方法，其特征在于，包括以下步驟： 51、 將農(nóng)藥殺菌劑配制成梯度濃度的試驗(yàn)藥液； 52、 將生物藻原液用無菌水稀配制成藻稀釋液； 53、 將所述試驗(yàn)藥液與所述藻稀釋液混合，密封條件下培養(yǎng)72h，每隔24h對藻細(xì)胞計(jì) 數(shù)，并記錄藻細(xì)胞的生物效應(yīng)和試驗(yàn)液的理化參數(shù)； 54、 根據(jù)藻細(xì)胞的生物效應(yīng)參數(shù)計(jì)算農(nóng)藥殺菌劑對藻細(xì)胞的半數(shù)效應(yīng)濃度EC5Q，判斷農(nóng) 藥殺菌劑的毒性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1步驟具體為:將農(nóng)藥殺菌劑與培養(yǎng) 基稀釋液混合，配制成梯度濃度的試驗(yàn)藥液;所述培養(yǎng)基稀釋液為將BG11培養(yǎng)基稀釋10倍 后的溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中所述生物藻原液為處于對數(shù) 生長期的純種藻。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中所述，試驗(yàn)藥液與所述藻稀 釋液的體積比為1:1，所述藻稀釋液中藻細(xì)胞的濃度為1. 〇 X 1〇4~1. 〇 X 1〇5個/mL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中所述培養(yǎng)的條件為:溫度為 21°C~24°C、光照強(qiáng)度為4440Lux~8880Lux、光照比為16h/8h;培養(yǎng)期間，每隔24h將所述試 驗(yàn)藥液與所述藻稀釋液的混合液搖動5次以上。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中所述藻細(xì)胞的生物效應(yīng)包括 藻細(xì)胞的抑制率和藻細(xì)胞的中毒情況;所述藻細(xì)胞的中毒情況包括:藻細(xì)胞畸形、藻液變 白、藻細(xì)胞體積變小、藻細(xì)胞粘連或聚結(jié)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中所述試驗(yàn)液的理化參數(shù)包 括:試驗(yàn)液的水溫、pH值和光照強(qiáng)度。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟S4中采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS，以農(nóng)藥殺菌劑濃度的對數(shù)值為自變量X，以抑制率的機(jī)率值為因變量y，建立毒力回歸 方程，計(jì)算受試物對藻類生長抑制的半數(shù)效應(yīng)濃度EC 50。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟S4中所述農(nóng)藥毒級 判斷標(biāo)準(zhǔn)為EC5〇<0.3mg a.i./L，高毒；0.300<EC5〇<3.00mg a.i./L，中毒；EC5〇> 3 · Omga · i · /L，低毒。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模式生物藻測定農(nóng)藥殺 菌劑毒性的方法還設(shè)有空白對照組，所述空白對照組以藻稀釋液與培養(yǎng)基的混合物培養(yǎng)生 物藻。
【文檔編號】G01N33/00GK105842399SQ201610185811
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月29日
【發(fā)明人】劉勇, 張德詠, 羅香文, 陳源, 蔣桂芳, 羅杰, 陳昂, 奚慶, 羅源華, 劉志邦, 嚴(yán)清平, 何安頔, 劉建宇
【申請人】湖南省植物保護(hù)研究所