在線spe瘦肉精的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在線SPE瘦肉精的方法，旨在提供一種檢測方法簡單，檢測速率高，可重復(fù)性好的在線SPE瘦肉精的方法；該方法依次包括下述步驟：稱取粉碎樣品2.00g加提取液至20ml，震蕩5min，4000r/min離心5min，0.22μm濾膜過濾，注入全自動在線固相萃取，所述的SPE柱為TurboFlow XL色譜柱C18；稱取粉碎樣品2.00g，加入1μg/ml標準對照液1.00ml，加提取液至20ml，震蕩5min，4000r/min離心5min，0.22μm濾膜過濾，注入全自動在線固相萃取，所述的SPE柱為TurboFlow XL色譜柱C18；屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【專利說明】
在線SPE瘦肉精的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明公開了一種萃取瘦肉精的方法，具體地說，是一種在線SPE瘦肉精的方法， 屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘦肉精是一類動物用藥，而不是一種特定的物質(zhì)，是指能夠促進瘦肉生長的飼料 添加劑。任何能夠促進瘦肉生長、抑制肥肉生長的物質(zhì)都可以叫做"瘦肉精，有數(shù)種藥物被 稱為瘦肉精，例如萊克多巴胺(Ractopamine)及克倫特羅(Clenbuterol)等。將瘦肉精添加 于飼料中，可以增加動物的瘦肉量、減少飼料使用、使肉品提早上市、降低成本。但因為考慮 對人體會產(chǎn)生副作用，各國開放使用的標準不一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測方法簡單，檢測速率高，可重復(fù)性 好的在線SPE瘦肉精的方法。
[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：
[0005] -種在線SPE瘦肉精的方法，依次包括下述步驟：
[0006] 1)樣品提取
[0007] 稱取粉碎樣品2.00g加提取液至20ml，震蕩5min，4000r/min離心5min，0.22ym濾膜 過濾，注入全自動在線固相萃取，所述的SPE柱為TurboFlow XL色譜柱C18;
[0008] 2)回收樣的制備
[0009] 稱取粉碎樣品2.00g，加入lμg/ml標準對照液1.00ml，加提取液至20ml，震蕩5min， 4000r/min離心5min，0.22μηι濾膜過濾，注入全自動在線固相萃取，所述的SPE柱為 TurboFlow XL色譜柱C18;
[0010] 其中：步驟1)和步驟2)所述的提取液是1%乙酸水和甲醇按照體積比20:80混合而 得。
[0011] 進一步的，上述的一種在線固相萃取檢測瘦肉精的方法，所述的閥切換時間為 lmin〇
[0012] 進一步的，上述的一種在線固相萃取檢測瘦肉精的方法，所述的SPE沖洗時采用沖 洗液為水與甲醇按照體積80:20混合。
[0013] 進一步的，上述的一種在線固相萃取檢測瘦肉精的方法，所述的所述的SP E沖洗 時沖洗速率為1.2ml/min。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案，本發(fā)明提供的技術(shù)方案克服了 quechers法存在明顯基質(zhì)效應(yīng);SPE-PCX因為專屬性更好，基質(zhì)效應(yīng)較低，在線SPE法:通過 考察用純水配制線性與基質(zhì)提取液配制的線性以及同同等濃度的回收樣數(shù)據(jù)比較，其相差 較小，可排除基質(zhì)效應(yīng);另外，在線SPE法人工參與少，結(jié)果重現(xiàn)性好，只需稱樣、加提取液、 震蕩、離心、過濾即可，樣品量不大時優(yōu)勢較大;quechers法次之，人工參與最多，強度大，但 成本較低;SPE-PCX最慢，人工參與較多，成本最高，但批量很大時，時間效率最高。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對 本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā) 明的權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。
[0016] 本發(fā)明所涉及到的百分濃度，沒有特別說明的，液體均為體積濃度，溶質(zhì)為固體的 指質(zhì)量濃度。
[0017] 樣品提取:稱取粉碎樣品2.00g加提取液至20ml，震蕩5min，4000r/min離心5min， 0.22yi4i膜過濾。上機。
[0018] 回收樣的制備:稱取粉碎樣品2.00g，加入標準對照液（lμg/ml) 1.00ml，加提取液 至20ml，震蕩5min，4000r/min離心5min，0 · 22μηι濾膜過濾。上機。
[0019] 對照溶液：50ng/ml。
[0020] -、柱子峰型以及對目標物保留比較
[0021 ]考察目的:選擇spe柱對對照溶液沖洗后，富集容量。以響應(yīng)值與峰型評價。
[0022]在各優(yōu)化條件下，分別使用三根柱子對對照溶液中瘦肉精三個目標物進行測定， 考察其對目標物的保留效果，結(jié)果如下：
[0023] 分別為：
[0024] CAPCELLPAKMFC82. OOmmid X 50mm5ym以下簡稱資生堂C8(主要是通過排阻原理去 除大分子雜質(zhì)以及C8的反相作用富集小分子待測成分）
[0025] TurboFlow XL色譜柱C180.5mmidX50mm以下簡稱TurboFlow XL色譜柱C18(禍流 色譜原理，快速清除大分子，利用反相作用富集小分子待測成分，相對于Cyclone對于極性 較大的目標物吸附力更強。）
[0026] TurbolflowCyclone 0.5mmidX50mm以下簡稱C18 [0027]三根不同柱子對目標物的響應(yīng)值：
[0029] 相比較下，峰型：資生堂C8>Cyclone>TurboFlow XL色譜柱C18;響應(yīng)值:TurboFlow XL色譜柱C18>資生堂C8>Cycl〇ne，并且Cyclone柱對沙丁胺醇近乎毫無保留，綜合以上， TurboFlow XL色譜柱C18柱子較好；
[0030] 二、提取液不同甲酸濃度的考察
[0031] 考察目的：我們選用不同的溶劑對目標物的提取率進行考察，以樣品加標回收率 評價。
[0032] 基于之前所做的實驗數(shù)據(jù)顯示，樣品用水、中性緩沖鹽、有機溶劑提取不完全。原 因可能是瘦肉精都是生物堿，為了提高提取率，因此，分別用0.1%乙酸水、0.5%乙酸水、 1.0%乙酸水與甲醇的比例均為9:1提取回收樣品，以及單純提取基質(zhì)液配制對照液，比較 其數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在提取過程，提取液經(jīng)4000r/min離心5min后，回收率是1.0 %乙酸水> Ο . 5 % 乙酸水>0.1%乙酸水，而通過比較純對照液與取基質(zhì)液配制的對照液比較，樣品的相應(yīng)仍 然受到干擾，因此選擇用1. 〇 %乙酸水溶液與甲醇(80:20)作為樣品提取液。
[0033]三、提取液有機相比例考察：
[0034] 考察目的：選用適當?shù)挠袡C相比例對目標物的最大提取率。以樣品加標回收率評 價。
[0035] 確定提取液乙酸水的濃度后，為篩選出相對好的提取液并且提高樣品回收率，我 們通過改變1 %乙酸水與甲醇的比例，來觀察其回收率，結(jié)果如下：
[0036] 柱子：TurboFlow XL色譜柱C18
[0037] 提取液1 %乙酸水：甲醇
[0040] 由數(shù)據(jù)可看出，提取液1 %乙酸水：甲醇=20:80時回收率較高
[0041] 四、渦流流速的比較
[0042] 考察目的：選取在沖洗階段，選擇適宜的渦流流速，將基質(zhì)排阻最大化。以對照溶 液的響應(yīng)值評價。
[0043] 基于TurboFlow )(L色譜柱C18最佳渦流速度為0.5-4ml/min。因此分別實驗了 0 · 5、1、2、3ml/min. 口向應(yīng)值 1 · 2ml/min>2 · 4ml/min>3 · 6ml/min>0 · 5ml/min〇
[0044] 因此，為保證盡可能去雜、且不影響目標物的截留，選用1.2ml/min。
[0045] 五、六通閥閥時間切換的考察
[0046] 考察目的：選用適宜閥切換時間，為確保前期雜質(zhì)的沖洗更徹底以及目標化合物 富集在SPE柱更完全。以加標溶液的響應(yīng)值評價。
[0047] 我們分別考察了六通閥閥時間切換的最優(yōu)時間，結(jié)果如下：
[0049]結(jié)果顯示，在lmin切換閥能讓目標物富集在柱子上更多，更能在將大分子雜質(zhì)沖 洗更完全的情況下，讓目標物損失更少。
[0050] 六、SPE柱沖洗流動相比例考察
[0051] 考察目的：為了提高目標物的更高響應(yīng)，檢測限可以做到更低，優(yōu)化SPE柱的條件， 通過改變SPE柱沖洗流動相比例來觀察其變化，其結(jié)果如下：
[0052]考察條件：
[0054]由于甲醇大于10時，沙丁胺醇基本無保留，只有兩個成分峰，所以最終選擇比例為 水：甲醇(97:3)和(80:20)來比較，其響應(yīng)值分別為
[0055]
[0056] 以上表格顯示表明，SPE柱沖洗流動相比例水：甲醇（80 : 20)的峰高值比水：甲醇 (97:3)高出一倍多，因此，最終確定選擇其流動相為水：甲醇(80:20)。
[0057] 七、重復(fù)性考察
[0058] 篩選好以上各方面的條件，保存其方法，由于之前一直是只用一份樣品做回收樣 考察其條件，為消除不同樣品對回收率的影響，我們分別取了7份不同樣品（均加入標準液 一樣，最終濃度一致，50ng/ml)做樣品加標，統(tǒng)計其數(shù)據(jù)，考察其樣品重復(fù)性，（沖洗SPE柱流 速為1.2ml/min)結(jié)果如下：
[0059]
[0060]以上數(shù)據(jù)顯示，在不同樣品中，其三個目標物的相應(yīng)差距較小，相對標準偏差均小 于5%，證明其重復(fù)性較好
[0061 ]八.SPE沖洗后的物質(zhì)考察
[0062]對溶劑空白、樣品空白，進行在線SPE后的scan，另色譜柱的沖洗設(shè)為3min，可保證 將色譜柱內(nèi)雜質(zhì)沖洗干凈，保護色譜柱與質(zhì)譜。本次實驗檢出限可遠低于0.〇lng/ml，即0.1 yg/kg(方法檢出限）。
[0063]由上述結(jié)果可知，雖然在樣品空白相對應(yīng)出峰出存在m/z400~500干擾，但總體不 影響三個目標物的響應(yīng)，無基質(zhì)效應(yīng)。且方法檢出限在未加電子倍增器電壓和進樣量為5μ1 下，目標物信噪比還有11.1。
[0064] 九、標準曲線線性對比
[0065]考察目的：2位實驗人員，分別用純化水和基質(zhì)空白配制線性作對比。
[0066] 分別是:混合標準對照液（100ng/ml)
[0067] 線性曲線（1)分別吸取上述混合標準對照液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0ml至10ml容量 瓶中，用超純水定容至刻度；
[0068] 線性曲線（2)，稱取SP20150050樣品兩份4·00g，加入提取液0· 1 %甲酸-甲醇（1:9) 定容至40ml，震蕩提取5min，取上清液混合備用，分別吸取上述混合標準對照液0.1、0.5、 1.0、2.0、5.0ml至10ml容量瓶中，用上述備用清液定容至刻度;得線性曲線(2)其結(jié)果如下： [0069] 實驗人員1:
[0070]
[0071] R 均大于 0.998 [0072]實驗人員2:
[0073]
[0074] R 均大于 0.998
[0075] 基質(zhì)+s/s:
[0076] 取(兩份基質(zhì)對照液響應(yīng)平均)/(兩份對照液響應(yīng)平均)X100 %
[0078]從以上數(shù)據(jù)看出，線性曲線（1)的純對照液與線性曲線（2)數(shù)據(jù)基本一致，同時比 較濃度均為50ng/ml的兩個對照與上述比較，回收率接近100%，因此可排除基質(zhì)效應(yīng)問題。
[0079]十、綜合考察條件
[0080] 提取液：0 · 1 %乙酸水：甲醇=20:80
[0081 ] SPE柱：TurboFlow XL色譜柱C180.5mmidX50mm
[0082] 閥切換時間：lmin
[0083] SPE 沖洗:水：甲醇=80:20，1 · 2ml/min
[0084] 回收率:95~100%，RAD<5%
[0085] 檢出限:滿足且低于方法檢出限0. lyg/kg。
【主權(quán)項】
1. 一種在線SPE瘦肉精的方法，其特征在于，依次包括下述步驟： 1) 樣品提取 稱取粉碎樣品2 .OOg加提取液至20ml，震蕩5min，4000r/min離心5min，0.22μηι濾膜過 濾，注入全自動在線固相萃取，所述的SPE柱為TurboFlow XL色譜柱C18; 2) 回收樣的制備 稱取粉碎樣品2.00g，加入lμg/ml標準對照液1.0〇1111，加提取液至2〇1111，震蕩51^11， 4000r/min離心5min，0.22μηι濾膜過濾，注入全自動在線固相萃取，所述的SPE柱為 TurboFlow XL色譜柱C18; 其中：步驟1)和步驟2)所述的提取液是1%乙酸水和甲醇按照體積比20:80混合而得。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在線固相萃取檢測瘦肉精的方法，其特征在于，所述的閥 切換時間為lmin。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在線固相萃取檢測瘦肉精的方法，其特征在于，所述的 SPE沖洗時采用沖洗液為水與甲醇按照體積80:20混合。4. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種在線固相萃取檢測瘦肉精的方法，其特征在于，所述的所 述的SPE沖洗時沖洗速率為1.2ml/min。
【文檔編號】G01N30/02GK105866277SQ201610235119
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】陳學(xué)松, 羅達龍, 文俊萍
【申請人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗所