基于gc-ms的植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于GC?MS的植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法，其包括步驟：1)將植物樣本、內(nèi)標(biāo)物和預(yù)冷至?20～4℃的親水性有機(jī)溶劑混勻并降溫至?80～?10℃，然后研磨粉碎，并冰水浴超聲提?。?)再分別加入親脂性有機(jī)溶劑和水，混勻，并冰水浴超聲提取；于0～16℃高速離心，取水相并揮干；3)加入肟化試劑，于30～45℃進(jìn)行肟化反應(yīng)；4)最后加入衍生化試劑和正己烷，于60～80℃進(jìn)行衍生化反應(yīng)。本發(fā)明的預(yù)處理方法不僅可充分提取植物樣本的初級(jí)代謝物，獲得豐富的代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，而且可盡量避免提取過程中代謝物的變化，以及脂溶性物質(zhì)對(duì)氣相色譜柱的污染，從而獲得較好的樣品重現(xiàn)性。
【專利說明】
基于GC-MS的植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物樣本預(yù)處理方法領(lǐng)域，具體涉及一種基于GC-MS的植物非靶向代 謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，植物代謝組學(xué)已由一個(gè)充滿假想的概念演變成發(fā)展迅速、研究?jī)r(jià)值巨大的 學(xué)術(shù)領(lǐng)域。與細(xì)菌和酵母僅包含數(shù)百種代謝物不同，已知的植物次生代謝物已達(dá)約10萬種。 但是，植物代謝組學(xué)研究目前仍處于起步階段，在物種鑒定、轉(zhuǎn)基因植物鑒別、代謝途徑和 基因功能研究等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 通過對(duì)代謝組研究，不僅可了解植物在不同環(huán)境條件下的變化，還可研究同一植 物不同部位或時(shí)期的代謝物成分及含量。代謝譜可作為物種鑒定尤其是轉(zhuǎn)基因個(gè)體鑒別的 重要依據(jù)，是基因型與表型研究的重要手段。
[0004]植物代謝組學(xué)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭瑫r(shí)對(duì)植物樣本內(nèi)盡可能多的代謝物進(jìn)行定性、定量 分析，但是由于植物樣本中代謝物種類很多，含量差別很大，代謝物濃度的動(dòng)態(tài)范圍較寬， 復(fù)雜程度較高，而且代謝物受熱容易反應(yīng)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。另外，植物組織中含有很多脂 溶性的次級(jí)代謝物，這些物質(zhì)種類繁多，沸點(diǎn)高，而且難以通過衍生化的方法降低沸點(diǎn)，不 適合使用GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)檢測(cè)。這些物質(zhì)GC-MS數(shù)據(jù)庫(kù)(Fiehn數(shù)據(jù)庫(kù)、NIST數(shù)據(jù) 庫(kù)等）中的質(zhì)譜信息少，難以定性，不是普篩的主要目的，容易對(duì)初級(jí)代謝物的分析產(chǎn)生干 擾。另外，次級(jí)代謝物的通路分析復(fù)雜，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的次級(jí)代謝通路很少，缺少次級(jí)代 謝通路的比對(duì)依據(jù)，故在前處理中盡可能多的提取植物樣本中的初級(jí)代謝物，并排除脂溶 性次級(jí)代謝物的干擾。但是現(xiàn)有的基于GC-MS的植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法重現(xiàn) 性不好，通用性不強(qiáng)，提取過程中沒有盡可能的做到低溫提取，沒有嚴(yán)格控制操作過程中的 溫度，操作過程中的高溫易導(dǎo)致代謝物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而且代謝物的提取不夠充分，很難 實(shí)現(xiàn)高通量全范圍檢測(cè)，對(duì)于性質(zhì)或含量相差大的物質(zhì)難以同時(shí)檢測(cè)到，另外提取選擇性 不高，脂溶性的次級(jí)代謝物未能剔除，不能避免干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的基于GC-MS的植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法存在 的諸多問題，提出了一種通用性強(qiáng)、提取充分、提取選擇性高的重現(xiàn)性好的基于GC-MS植物 非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法。
[0006] 本發(fā)明的基于GC-MS植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法，其包括步驟：
[0007] 1)將植物樣本、內(nèi)標(biāo)物和預(yù)冷至-20~4°C的親水性有機(jī)溶劑混勻并降溫至-80~-l〇°C，然后研磨粉碎，并冰水浴超聲提取；
[0008] 2)再分別加入親脂性有機(jī)溶劑和水，混勻，并冰水浴超聲提取;于0~16°C高速離 心，取水相并揮干；
[0009] 3)加入肟化試劑，于30~45 °C進(jìn)行肟化反應(yīng)；
[0010] 4)最后加入衍生化試劑和正己烷，于60~80°C進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到基于GC-MS的 植物非靶向代謝組學(xué)樣品。
[0011]所述親水性有機(jī)溶劑、所述親脂性有機(jī)溶劑和水為提取液，所述親水性有機(jī)溶劑 和水用于提取植物樣本中的極性物質(zhì)（需要提取的初級(jí)代謝物），所述親脂性有機(jī)溶劑用于 將非極性或弱極性物質(zhì)(次級(jí)代謝物)分離出去。所述親水性有機(jī)溶劑可選用與水混溶的甲 醇、丙酮和/或乙醇。所述親水性有機(jī)溶劑體積:所述植物樣本重量為〇. 5~lmL: 100mg優(yōu)選 0.6~0.75mL:100mg。所述親脂性有機(jī)溶劑可選用氯仿、乙醚和/或乙酸乙酯。所述親水性有 機(jī)溶劑:所述親脂性有機(jī)溶劑:水的體積比為1: 〇. 4~0.6:0.8~1.2，優(yōu)選1:0.5:1。
[0012] 所述內(nèi)標(biāo)物應(yīng)滿足以下條件:不是植物樣本中的成分且不與植物樣本中的代謝物 反應(yīng)，能溶解于所述親水性有機(jī)溶劑，帶有活潑氫能被衍生化。所述內(nèi)標(biāo)物可選用氯苯丙氨 酸，氯苯丙氨酸為L(zhǎng)-2-氯-苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、L-4-氯苯丙氨酸、D-4-氯苯丙氨酸 或D-2-氯苯丙氨酸，當(dāng)然不排除其他類型的可被衍生化的化合物。所述內(nèi)標(biāo)物重量:所述植 物樣本重量為10~30yg: 100mg優(yōu)選20yg: 100mg。因所述內(nèi)標(biāo)物用量很少，很難直接稱取，因 此在某些實(shí)施例中，所述內(nèi)標(biāo)物預(yù)先用所述親水性有機(jī)溶劑稀釋為溶度為0.2~0.4mg/mL 的內(nèi)標(biāo)物溶液，然后再準(zhǔn)確量取并與所述植物樣本、所述親水性有機(jī)溶劑混合，量取混合用 的所述親水性有機(jī)溶劑時(shí)扣除所述內(nèi)標(biāo)物溶液體積，以此維持所述親水性有機(jī)溶劑總的體 積。
[0013] 所述肟化試劑為甲氧胺鹽酸鹽，所述甲氧胺鹽酸鹽重量:所述植物樣本重量為15 ~30:100優(yōu)選20:100。實(shí)際處理過程中可通過添加10~20mg/mL優(yōu)選15mg/mL的甲氧胺鹽酸 鹽的吡啶溶液來加入所述肟化試劑。
[0014] 所述衍生化試劑為N，0-二(三甲基硅烷）乙酰胺、二甲基二氧硅烷、二甲基二氧硅 烷、六甲基二硅胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺、含1 %三甲基氯硅烷的雙(三甲基 硅烷基）三氟乙酰胺或含1 %三甲基氯硅烷的N-甲基雙（三氟乙酰胺）。所述衍生化試劑體 積:所述植物樣本重量為1~2 uL: lmg，優(yōu)選1.3uL: lmg。
[0015] 步驟4)中的正己烷的功能是增加烷基化物質(zhì)的溶劑性，正己烷的用量與衍生化試 劑的用量有關(guān)，所述衍生化試劑體積:正己烷體積為2~8:1優(yōu)選4:1。
[0016] 本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中，步驟1)具體操作為，將所述內(nèi)標(biāo)物溶液、所述植物樣本 和預(yù)冷至-20~4°C優(yōu)選-10~0°C的親水性有機(jī)溶劑混合并降溫至-80~-10°C優(yōu)選-60~-40°C，放入研磨機(jī)中以40~80Hz優(yōu)選60Hz頻率研磨粉碎1~4min優(yōu)選2min，并用冰水浴超聲 提取20~40min優(yōu)選30min。
[0017] 進(jìn)一步的，步驟2)具體操作為，加入所述親脂性有機(jī)溶劑后于研磨機(jī)中以15~ 30Hz優(yōu)選20Hz頻率禍旋1~4min優(yōu)選2min進(jìn)行混勾，再加入水于研磨機(jī)中以15~30Hz優(yōu)選 20Hz頻率禍旋1~4min優(yōu)選2min進(jìn)行混勾，然后用冰水浴超聲提取20~40min優(yōu)選30min;然 后于0~4°C條件下，12000~15000rpm優(yōu)選14000rpm轉(zhuǎn)速下離心5~15min優(yōu)選10min。
[0018] 再進(jìn)一步的，步驟3)具體操作為，在濕度控制在25~35%優(yōu)選30%下，加入10~ 2 0mg/mL優(yōu)選15mg/mL的甲氧胺鹽酸鹽的R比啶溶液，然后于震蕩速度為100~3 0 Or pm優(yōu)選 200rpm的35~40°C優(yōu)選37°C震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行肟化反應(yīng)60~120min優(yōu)選90min。
[0019] 步驟4)具體操作為，在濕度控制在25~35%優(yōu)選30%下，加入所述衍生化試劑和 正己烷并渦旋震蕩混勻，然后于68~72°C優(yōu)選70°C衍生化反應(yīng)45~75min優(yōu)選60min，冷卻 至室溫，得到基于GC-MS的植物非靶向代謝組學(xué)樣品。
[0020] 方法步驟可用于大多數(shù)植物葉片、莖部和或根部等的新鮮組織的預(yù)處理。對(duì)于除 含糖量極高如香蕉果肉、甘蔗等以外的含糖量<15%植物新鮮組織，尤其是含糖量<5%植 物新鮮組織，可充分提取植物組織中的初級(jí)代謝物，GC-MS分析可達(dá)到較高的重現(xiàn)性。
[0021] 本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)包括以下三點(diǎn)：
[0022] 1、提取液的選擇及其用量配比的選擇。為減少對(duì)后續(xù)分析的干擾，需要將數(shù)據(jù)庫(kù) 中基本上沒有的脂溶性的次級(jí)代謝物去除，比如黃酮類等親脂性物質(zhì)。所述親水性有機(jī)溶 劑和水可混溶，而所述親脂性有機(jī)溶劑與一定比例混溶的所述親水性有機(jī)溶劑-水的混合 相不互溶，所述親水性有機(jī)溶劑-水和所述親脂性有機(jī)溶劑混合后可分為親水的水相和親 脂的有機(jī)相兩層，水相為溶解有極性物質(zhì)（需要提取的代謝物)的所述親水性有機(jī)溶劑-水， 有機(jī)相為溶解有親脂性物質(zhì)的所述親脂性有機(jī)溶劑。提取液以甲醇、水、氯仿組合為例，體 積比為1:1的甲醇-水極性較大，能夠更多地提取極性物質(zhì)，而氯仿能夠溶解非極性或弱極 性的親脂性物質(zhì)；甲醇、水、氯仿的體積比為2: 2:1時(shí)，甲醇-水與氯仿不互溶，溶液分層，上 層水相為溶解有極性物質(zhì)的甲醇-水，下層有機(jī)相為溶解有非極性或弱極性物質(zhì)的氯仿，取 上層清液即可用于后續(xù)處理再進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。具體操作時(shí)先加甲醇，能提取到絕 大部分的代謝物，再加不能或不容易提出親水性物質(zhì)而易提取親脂性的物質(zhì)的氯仿，最后 加水使水相和有機(jī)相分層，可達(dá)到較佳的提取分離的效果。
[0023] 2、操作過程中保證低溫。研磨機(jī)研磨過程中會(huì)產(chǎn)生大量熱量，故研磨前可將植物 樣本放置低溫(-20~_80°C)環(huán)境中2min左右。水浴超聲過程中，溫度會(huì)升高，可將超聲清洗 儀溫度設(shè)至最低(〇°C)，并且加入冰袋，保證整個(gè)超聲過程溫度在冰水浴的溫度。高速離心 可保證植物的組織殘?jiān)恋硗耆瑫r(shí)高速離心也會(huì)產(chǎn)生大量熱量，離心溫度可設(shè)為0~4 °C。上述各控制溫度的操作可有效避免植物樣本溫度過高而導(dǎo)致代謝物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 [0024] 3、衍生化過程中的濕度要求嚴(yán)格。衍生化試劑遇水立即分解，故加入肟化試劑、衍 生化試劑、正己烷的過程中，實(shí)驗(yàn)室濕度控制在30%左右，且不能超過35%，否則將導(dǎo)致衍 生化不充分，最終導(dǎo)致檢測(cè)到的代謝物數(shù)量較少。
[0025]另外，采用加有小鋼珠的離心管作為植物樣本處理容器，放到研磨機(jī)里研磨，可使 植物組織破壞充分，再經(jīng)超聲提取，能夠充分提取代謝物。
[0026]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:所述基于GC-MS的植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理 方法是在低溫條件下對(duì)植物樣本的代謝物進(jìn)行充分提取，可降低高溫對(duì)代謝物的結(jié)構(gòu)影 響；并且有效去除的脂溶性的次級(jí)代謝物，可避免脂溶性的次級(jí)代謝物對(duì)氣相色譜柱的污 染而干擾后續(xù)分析；另外嚴(yán)格控制衍生化過程實(shí)驗(yàn)室濕度以保證充分衍生化。采用本發(fā)明 的預(yù)處理方法處理的樣品進(jìn)行GC-MS植物代謝組學(xué)分析可獲得較大的代謝物峰數(shù)據(jù)，而且 樣品重現(xiàn)性較好，可普遍適用于各種植物組織樣品的提取，提高代謝組學(xué)中大樣品量的研 究效率。另外本發(fā)明的預(yù)處理方法操作簡(jiǎn)單快捷，所用試劑毒性較小。上述積極進(jìn)步效果對(duì) 促進(jìn)植物代謝組學(xué)研究、建立統(tǒng)一的提取方法標(biāo)準(zhǔn)、加強(qiáng)相關(guān)研究者之間進(jìn)行數(shù)據(jù)交流具 有重要意義。
【附圖說明】
[0027]圖1A~1F為實(shí)例1的茶樹葉片的總粒子流色譜圖。
[0028]圖2A~2F為實(shí)例2的西瓜莖的總粒子流色譜圖。
[0029]圖3A~3F為實(shí)例3的花椒根的總粒子流色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的基于GC-MS植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法 作進(jìn)一步的說明。
[0031]實(shí)施例1茶樹葉片的預(yù)處理(含糖量1~5%)
[0032] 采用以下步驟對(duì)新鮮茶樹葉片進(jìn)行預(yù)處理并作GC-MS檢測(cè)，重復(fù)6次（1A~1F)平行 實(shí)驗(yàn)。
[0033]預(yù)處理具體步驟為：
[0034] 1)精確稱取茶樹葉片60mg，放入1.5mL的離心管中；依次加入兩顆小鋼珠、360yL 4 °C的甲醇和40yL內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液(L-2-氯-苯丙氨酸，0.3mg/mL)，在-80 °C冰箱中放置2min; 放入研磨機(jī)中研磨(60Hz，2min)，從研磨機(jī)中取出，超聲提取30min;
[0035] 2)加入200yL氯仿，放入研磨機(jī)中渦旋（20Hz，2min)，加入400yL水，放入研磨機(jī)中 渦旋（20Hz，2min)，超聲提取30min;
[0036] 3)低溫離心1011^11(14000印111，4°(：)，取200~70(^1^上清液，裝入玻璃衍生瓶中，用 快速離心濃縮儀揮干；
[0037] 4)在濕度控制在30%下，向玻璃衍生瓶中加入80yL甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15mg/ mL)，渦旋震蕩2min后，于震蕩培養(yǎng)箱中37°C肟化反應(yīng)90min;
[0038] 5)在濕度控制在30%下，取出后再加入80yL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(含1% 三甲基氯硅烷)和20yL正己烷，渦旋震蕩2min后，于70°C衍生化反應(yīng)60min后取出，室溫放置 30min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。
[0039]檢測(cè)結(jié)果分析：
[0040] 本實(shí)施例的預(yù)處理步驟中，提取液甲醇、水、氯仿體積比為2:2:1，通過甲醇和水有 效地提取極性的初級(jí)代謝物，并通過氯仿將脂溶性的次級(jí)代謝物去除，從而避免對(duì)氣相色 譜柱的污染和對(duì)后續(xù)分析的干擾。操作過程中保證低溫，有效避免高溫導(dǎo)致代謝物的結(jié)構(gòu) 發(fā)生變化。而且衍生化過程中的濕度嚴(yán)格控制在30 %左右，保證充分衍生化。
[0041] 6次平行預(yù)處理后測(cè)得的茶樹葉片代謝物的總粒子流色譜圖（Total Particles Chromatogram, TIC)如圖1A~IF所示;茶樹葉片代謝物種類數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。檢 測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)標(biāo)峰以及已知的假陽性峰(包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰)均從數(shù)據(jù)矩 陣中去除，并進(jìn)行去冗余和峰合并后，6次平行實(shí)驗(yàn)均能定性出270種左右的代謝物，其中有 206種代謝物在6次平行實(shí)驗(yàn)中均有檢測(cè)到，具有較高重現(xiàn)性。
[0042]表1茶樹葉片的代謝物種類數(shù)量檢測(cè)結(jié)果
[0043]
[0044] 所以使得檢測(cè)結(jié)果中代謝物數(shù)量較多且穩(wěn)定，樣品重現(xiàn)性好。
[0045] 實(shí)施例二西瓜莖的預(yù)處理(含糖量2%左右）
[0046] 采用以下步驟對(duì)新鮮西瓜莖進(jìn)行預(yù)處理并作GC-MS檢測(cè)，重復(fù)6次(2A~2F)平行實(shí) 驗(yàn)。
[0047]預(yù)處理具體步驟為：
[0048] 1)精確稱取西瓜莖60mg，放入1.5mL的離心管中；依次加入兩顆小鋼珠、360yL-20 °C的乙醇和40yL內(nèi)標(biāo)物乙醇溶液(L-4-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL)，在-20 °C冰箱中放置2min; 放入研磨機(jī)中研磨(60Hz，2min)，從研磨機(jī)中取出，超聲提取30min;
[0049] 2)加入200yL乙醚，放入研磨機(jī)中渦旋（20Hz，2min)，加入400yL水，放入研磨機(jī)中 渦旋（20Hz，2min)，超聲提取30min;
[0050] 3)低溫離心10min(14000rpm，16°C)，取200~700yL下層清液，裝入玻璃衍生瓶中， 用快速離心濃縮儀揮干；
[0051 ] 4)在濕度控制在30%下，向玻璃衍生瓶中加入80yL甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15mg/ mL)，渦旋震蕩2min后，于震蕩培養(yǎng)箱中37°C肟化反應(yīng)90min;
[0052] 5)在濕度控制在30%下，取出后再加入80yL N-甲基雙（三氟乙酰胺）（含1 %三甲 基氯硅烷）和20yL正己燒，禍旋震蕩2min后，于70°C衍生化反應(yīng)60min后取出，室溫放置 30min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。
[0053]檢測(cè)結(jié)果分析：
[0054] 本實(shí)施例的預(yù)處理步驟中，提取液乙醇、水、乙醚體積比為2:2:1，通過乙醇和水充 分地提取極性的初級(jí)代謝物，并通過乙醚將脂溶性的次級(jí)代謝物去除，從而避免對(duì)氣相色 譜柱的污染和對(duì)后續(xù)分析的干擾。操作過程中保證低溫，有效避免高溫導(dǎo)致代謝物的結(jié)構(gòu) 發(fā)生變化。而且衍生化過程中的濕度嚴(yán)格控制在30 %左右，保證充分衍生化。
[0055] 6次平行預(yù)處理后測(cè)得的西瓜莖代謝物的總粒子流色譜圖（Total Particles Chromatogram，TIC)如圖2A~2F所示；西瓜莖代謝物種類數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。檢測(cè) 結(jié)果顯示內(nèi)標(biāo)峰以及已知的假陽性峰(包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰)均從數(shù)據(jù)矩陣 中去除，并進(jìn)行去冗余和峰合并后，6次平行實(shí)驗(yàn)均能定性出200種左右的代謝物，其中有 160種代謝物在6次平行實(shí)驗(yàn)中均有檢測(cè)到，具有較高重現(xiàn)性。
[0056] 表2西瓜莖代謝物種類數(shù)量檢測(cè)結(jié)果
[0057]
[0058]實(shí)施例三花椒根的預(yù)處理(含糖量1 %左右）
[0059] 采用以下步驟對(duì)新鮮花椒根進(jìn)行預(yù)處理并作GC-MS檢測(cè)，重復(fù)6次平行實(shí)驗(yàn)(3A~ 3F)〇
[0060] 預(yù)處理具體步驟為：
[0061 ] 1)精確稱取花椒根60mg，放入1.5mL的離心管中；依次加入兩顆小鋼珠、360yL-10 °(：的丙酮和4(^1^內(nèi)標(biāo)物丙酮溶液（3,4-二氯苯丙氨酸，0.311^/11^)，在-10°(：冰箱中放置 2min;放入研磨機(jī)中研磨(60Hz，2min)，從研磨機(jī)中取出，超聲提取30min;
[0062] 2)加入200yL乙酸乙酯，放入研磨機(jī)中渦旋（20Hz，2min)，加入400yL水，放入研磨 機(jī)中渦旋(20Hz，2min)，超聲提取30min;
[0063] 3)低溫離心10min(14000rpm，10°C)，取200~700μ下層清液，裝入玻璃衍生瓶中， 用快速離心濃縮儀揮干；
[0064] 4)在濕度控制在30%下，向玻璃衍生瓶中加入80yL甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15mg/ mL)，渦旋震蕩2min后，于震蕩培養(yǎng)箱中37°C肟化反應(yīng)90min;
[0065] 5)在濕度控制在30%下，取出后再加入80yL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺 和20yL正己烷，渦旋震蕩2min后，于70°C衍生化反應(yīng)60min后取出，室溫放置30min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。
[0066]檢測(cè)結(jié)果分析：
[0067] 本實(shí)施例的預(yù)處理步驟中，提取液丙酮、水、乙酸乙酯體積比為2:2:1，通過丙酮和 水充分地提取極性的初級(jí)代謝物，并通過乙酸乙酯將脂溶性的次級(jí)代謝物去除，從而避免 對(duì)氣相色譜柱的污染和對(duì)后續(xù)分析的干擾。操作過程中保證低溫，有效避免高溫導(dǎo)致代謝 物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。而且衍生化過程中的濕度嚴(yán)格控制在30%左右，保證充分衍生化。 [0068] 6次平行預(yù)處理后測(cè)得的花椒根代謝物的總粒子流色譜圖（Total Particles Chromatogram, TIC)如圖3A~3F所示;花椒根代謝物種類數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。檢測(cè) 結(jié)果顯示內(nèi)標(biāo)峰以及已知的假陽性峰(包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰)均從數(shù)據(jù)矩陣 中去除，并進(jìn)行去冗余和峰合并后，6次平行實(shí)驗(yàn)均能定性出270種左右的代謝物，其中有 211種代謝物在6次平行實(shí)驗(yàn)中均有檢測(cè)到，具有較高重現(xiàn)性。
[0069] 表3花椒根代謝物種類數(shù)量檢測(cè)結(jié)果
[0070]
[0071] 由上述三個(gè)實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明的預(yù)處理方法可充分提取新鮮植物組 織(包括葉片、莖部和根部）中的代謝物，可檢測(cè)到較多種類的代謝物，代謝物種類和相對(duì)含 量均具有較高的重現(xiàn)性，可適用于除含糖量極高的果肉（如梨果肉、西瓜果肉、甜瓜果肉等） 以外的植物鮮樣的GC-MS植物非靶向代謝組學(xué)樣品的處理。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于GC-MS的植物非靶向代謝組學(xué)樣品預(yù)處理方法，其特征在于包括如下步驟： 1) 將植物樣本、內(nèi)標(biāo)物和預(yù)冷至-20~4°C的親水性有機(jī)溶劑混勻并降溫至-80~-10 °C，然后研磨粉碎，并冰水浴超聲提取； 2) 再分別加入親脂性有機(jī)溶劑和水，混勻，并冰水浴超聲提取;于0~16°C高速離心，取 水相并揮干； 3) 加入肟化試劑，于30~45 °C進(jìn)行肟化反應(yīng)； 4) 最后加入衍生化試劑和正己烷，于60~80°C進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到基于GC-MS的植物 非靶向代謝組學(xué)樣品。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述親水性有機(jī)溶劑為甲醇、丙酮 或乙醇，所述親水性有機(jī)溶劑體積：所述植物樣本重量為0.5~lmL : 100mg優(yōu)選0.6~ 0.75mL: lOOmg;所述內(nèi)標(biāo)物為氯苯丙氨酸，所述內(nèi)標(biāo)物重量:所述植物樣本重量為10~30μ g: 1 OOmg 優(yōu)選 20yg: 1 OOmg。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述氯苯丙氨酸為L(zhǎng)-2-氯-苯丙氨酸、3，4-二 氯苯丙氨酸、L-4-氯苯丙氨酸、D-4-氯苯丙氨酸或D-2-氯苯丙氨酸。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述內(nèi)標(biāo)物預(yù)先用所述親水性有 機(jī)溶劑稀釋為溶度為〇. 2~0.4mg/mL優(yōu)選0.3mg/mL的內(nèi)標(biāo)物溶液，然后再準(zhǔn)確量取并與所 述植物樣本、所述親水性有機(jī)溶劑混合，量取混合用的所述親水性有機(jī)溶劑時(shí)扣除所述內(nèi) 標(biāo)物溶液體積，以此維持所述親水性有機(jī)溶劑總的體積;步驟1)具體操作為，將所述內(nèi)標(biāo)物 溶液、所述植物樣本和預(yù)冷至-20~4°C優(yōu)選-10~0°C的親水性有機(jī)溶劑混合并降溫至-80 ~-l〇°C優(yōu)選-60~-40°C，放入研磨機(jī)中以40~80Hz優(yōu)選60Hz頻率研磨粉碎1~4min優(yōu)選 2min，并用冰水浴超聲提取20~40min優(yōu)選30min。5. 如權(quán)利要求2~4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述親脂性有機(jī)溶劑為 氯仿、乙醚和/或乙酸乙酯，所述親水性有機(jī)溶劑:所述親脂性有機(jī)溶劑：水的體積比為1: 0.4~0.6:0.8~1.2,優(yōu)選1:0.5:1。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)具體操作為，加入所述親脂性有機(jī)溶 劑后于研磨機(jī)中以15~30Hz優(yōu)選20Hz頻率禍旋1~4min優(yōu)選2min進(jìn)行混勾，再加入水于研 磨機(jī)中以15~30Hz優(yōu)選20Hz頻率渦旋1~4min優(yōu)選2min進(jìn)行混勻，然后用冰水浴超聲提取 20~40min優(yōu)選30min;然后于0~4°C條件下，12000~15000rpm優(yōu)選14000rpm轉(zhuǎn)速下離心5 ~15min 優(yōu)選 10min〇7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述肟化試劑為甲氧胺鹽酸鹽，所 述甲氧胺鹽酸鹽重量:所述植物樣本重量為1.5~3:100優(yōu)選2:100;步驟3)具體操作為，在 濕度控制在25~35%優(yōu)選30%下，加入10~20mg/mL優(yōu)選15mg/mL的甲氧胺鹽酸鹽的吡啶溶 液，然后于震蕩速度為100~300rpm優(yōu)選200rpm的35~40°C優(yōu)選37°C震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行肟 化反應(yīng)60~120min優(yōu)選90min。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟4)中，所述衍生化試劑為N，0-二(三甲基 硅烷）乙酰胺、二甲基二氧硅烷、二甲基二氧硅烷、六甲基二硅胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷） 三氟乙酰胺、含1 %三甲基氯硅烷的雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺或含1%三甲基氯硅烷的 N-甲基雙（三氟乙酰胺）；所述衍生化試劑體積：所述植物樣本重量為1~2uL: lmg，優(yōu)選 1.3uL: lmg;所述衍生化試劑體積:正己烷體積為2~8:1優(yōu)選4:1;步驟4)具體操作為，在濕 度控制在25~35%優(yōu)選30%下，加入所述衍生化試劑和正己烷并渦旋震蕩混勻，然后于68 ~72°C優(yōu)選70°C衍生化反應(yīng)45~75min優(yōu)選60min，冷卻至室溫，得到基于GC-MS的植物非靶 向代謝組學(xué)樣品。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物樣本為植物葉片、莖部或根部的新 鮮組織。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述新鮮組織的含糖量< 15 %，優(yōu)選< 5 %。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105866299SQ201610196406
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月31日
【發(fā)明人】白嫻, 舒烈波, 彭章曉, 楊卓, 郭峻杰
【申請(qǐng)人】上海青鹿投資有限公司