免疫測(cè)定待測(cè)組分的方法
【專利摘要】本申請(qǐng)描述了免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法，其包括在與該樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物存在下使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分與能結(jié)合該組分的抗體反應(yīng)。本發(fā)明提供的方法使得可以準(zhǔn)確測(cè)量含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分。
【專利說明】
免疫測(cè)定待測(cè)組分的方法
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年11月1日、申請(qǐng)?zhí)枮?00780048145.7、發(fā)明名稱為"免疫 測(cè)定待測(cè)組分的方法"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及免疫測(cè)定含有血紅蛋白，免疫測(cè)定試劑的樣品中的待測(cè)組分的方法， 以及抑制血紅蛋白在免疫測(cè)定方法中的干擾的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在免疫測(cè)定血液中的存在于血細(xì)胞，如紅細(xì)胞和白細(xì)胞外的待測(cè)組分的方法中， 將通過從全血中除去血細(xì)胞而制得的血清或血漿用作樣品。然而，由于血細(xì)胞的去除需要 特殊設(shè)備，如離心機(jī)，并且比較麻煩，因此已經(jīng)有建議用全血作為樣品的測(cè)定方法(見專利 文獻(xiàn)1)。當(dāng)用全血作為樣品時(shí)，存在著測(cè)量受到樣品中因溶血而污染的血細(xì)胞組分，如血紅 蛋白或血細(xì)胞膜組分干擾的問題。這些組分影響光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，抑制免疫反應(yīng)，并且還吸附 待測(cè)物質(zhì)。現(xiàn)在已有一些關(guān)于用全血作為樣品進(jìn)行免疫測(cè)定的方法的報(bào)道，這些方法未伴 有溶血避免了這些問題(見專利文獻(xiàn)2，3，4和5)。
[0004] 當(dāng)測(cè)量血細(xì)胞中的組成，如細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)時(shí)，必須將血細(xì)胞溶解，因此不能使用 沒有伴有溶血的上述方法。在這種情況下，使用的方法包括用流式細(xì)胞術(shù)分離感興趣的血 細(xì)胞，然后將分離出的細(xì)胞溶解，并測(cè)量血細(xì)胞中的預(yù)期組分，但這些方法需要特殊設(shè)備進(jìn) 行流式細(xì)胞術(shù)，并且比較麻煩。
[0005] 另一方面，作為測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的便利方法的例子，將用表面活性劑制備的全 血中的血細(xì)胞溶解物作為測(cè)量樣品免疫測(cè)定MxA蛋白的方法已有報(bào)道(非專利文獻(xiàn)1和2)。
[0006] [專利文獻(xiàn)1]日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平No.(jp-A)H1〇-48214(未審查，公開的日本專利 申請(qǐng)）
[0007] [專利文獻(xiàn) 2]JP-A(特開平)H06-265554
[0008] [專利文獻(xiàn)3]W0 96/04558
[0009] [專利文獻(xiàn)4]W0 〇2/732〇3
[0010] [專利文獻(xiàn) 5] JP-A(特開平）2004-45395
[0011] [非專利文獻(xiàn) 1 ] Journal of Interferon Research，（USA)，1992，Vol · 12，No · 2， p.67-74
[0012] [非專利文獻(xiàn)2]Pediatric Research，（USA)，1997，Vol · 41，No · 5，p · 647-650

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013][本發(fā)明要解決的問題]
[0014]本發(fā)明的目的是提供免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分，以抑制血紅蛋白干 擾的方法和試劑，以及在免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法中抑制血紅蛋白干 擾的方法。
[0015][解決問題的手段]
[0016] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在免疫測(cè)定樣品中的待測(cè)組分的方法中，所述組分可以通 過在膽汁酸衍生物存在下與能與所述組分結(jié)合的抗體反應(yīng)而精確測(cè)量，所述膽汁酸衍生物 不同于所述樣品中所固有的膽汁酸衍生物，因此完成了本發(fā)明。更具體地，本發(fā)明涉及以下
[0017] [1]免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法，其包括在與所述樣品中所固 有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物存在下使待測(cè)組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0018] [2]根據(jù)[1]的方法，其包括使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分進(jìn)一步在聚氧乙烯非 離子型表面活性劑存在下與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0019 ] [ 3 ]根據(jù)[1 ]或[2 ]的方法，其中免疫測(cè)定的方法是夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法。
[0020] [4]根據(jù)[1]或[2]的方法，其中使組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)是：
[0021] (1)使所述組分與能結(jié)合所述組分的第一抗體和能結(jié)合所述組分的標(biāo)記第二抗體 反應(yīng)，
[0022] (2)使所述組分與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì) 的抗體反應(yīng)，或
[0023] (3)使所述組分與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的標(biāo) 記抗體反應(yīng)。
[0024] [5]根據(jù)[1]_[4]任一項(xiàng)的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁 酸衍生物是具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0025] [6][1]_[4]任一項(xiàng)的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍 生物是具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0026] [7][5]的方法，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是3_[(3_膽酰胺丙 基)二甲銨]丙磺酸鹽（以下簡(jiǎn)稱為CHAPS)或3_[ (3-膽酰胺丙基)二甲銨]-2-羥基丙磺酸鹽 (以下簡(jiǎn)稱為CHAPS0)。
[0027] [8]根據(jù)[6]的方法，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是N，N_雙 (3-D-葡糖酰胺丙基)膽酰胺（以下簡(jiǎn)稱為BIGCHAP)或N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰 胺（以下簡(jiǎn)稱為脫氧-BIGCHAP)。
[0028] [9]根據(jù)[2]_[8]任一項(xiàng)的方法，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是聚氧乙烯烷 基苯基醚。
[0029] [10]根據(jù)[1]-[9]任一項(xiàng)的方法，其中樣品是全血。
[0030] [11]根據(jù)[1]-[10]任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)組分是MxA蛋白。
[0031] [12]含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的免疫測(cè)定試劑，其包括膽汁酸衍生物和選自 以下（1)-(3)的組分：
[0032] (1)能結(jié)合所述組分的第一抗體和能結(jié)合所述組分的標(biāo)記第二抗體；
[0033] (2)標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的抗體;以及
[0034] (3)競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的標(biāo)記抗體。
[0035] [13]根據(jù)[12]的試劑，還包括聚氧乙烯非離子型表面活性劑。
[0036] [14]根據(jù)[12]或[13]的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有兩性表面活性劑功能的膽 汁酸衍生物。
[0037] [15]根據(jù)[12]或[13]的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑功能 的膽汁酸衍生物。
[0038] [16]根據(jù)[14]的試劑，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是CHAPS或 CHAPS0〇
[0039] [17]根據(jù)[15]的試劑，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是 BIGCHAP 或脫氧-BIGCHAP。
[0040] [18]根據(jù)[13]-[17]任一項(xiàng)的試劑，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是聚氧乙 稀烷基苯基釀。
[0041] [19]在免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分中抑制血紅蛋白干擾的方法，其包 括在不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物存在下使含血紅蛋白樣品中的 待測(cè)組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0042] [20]根據(jù)[19]的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物 是具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0043] [21]根據(jù)[19]的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物 是具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0044] [22]根據(jù)[20]的方法，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是CHAPS或 CHAPS0〇
[0045] [23]根據(jù)[21]的方法，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是 BIGCHAP 或脫氧-BIGCHAP。
[0046] [24]根據(jù)[19]-[23]任一項(xiàng)的方法，其包括使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分進(jìn)一 步在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)。
[0047][本發(fā)明的效果]
[0048]本發(fā)明提供了使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分能得以準(zhǔn)確測(cè)量的免疫測(cè)定方法 及用于該方法的試劑，還提供了在免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法中抑制血 紅蛋白干擾的方法。
[0049]本發(fā)明的最佳實(shí)施方式
[0050] (1)含血紅蛋白的樣品
[0051] 本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中使用的含血紅蛋白樣品的例子包括含有血紅蛋白的樣 品和懷疑含有血紅蛋白的樣品。含有血紅蛋白的樣品和懷疑含有血紅蛋白的樣品的例子包 括全血，由全血制備的含紅細(xì)胞的血細(xì)胞級(jí)分，懷疑溶血的血漿或血清，紅細(xì)胞和添加了血 紅蛋白的任意樣品。關(guān)于全血，可以使用采集自受試者的血液本身和已處理的血液，優(yōu)選已 處理的血液。這樣處理的例子包括抗凝處理和溶血處理，這些處理可以組合使用。
[0052] 在待測(cè)組分為血細(xì)胞的胞內(nèi)組分的情況下，全血優(yōu)選為經(jīng)溶血處理的血液，尤其 優(yōu)選為經(jīng)抗凝和溶血兩種處理的血液。抗凝處理的例子包括向采集的血液中加入EDTA，肝 素等的處理。溶血處理的例子包括加入表面活性劑或皂苷溶液，與低滲溶液混合，凍融和超 聲。
[0053] (2)待測(cè)組分
[0054]本發(fā)明中的待測(cè)組分不受特別限制，只要其是可能含有血紅蛋白的樣品中的組分 即可，組分的例子包括核酸，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，維生素和多糖。核酸的例子包括DNA，RNA，ATP， ADP，AMP和cAMP。蛋白質(zhì)的例子包括酶，激素和各種類型的肽。
[0055]本發(fā)明中的優(yōu)選組分包括細(xì)胞內(nèi)含有的物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)由各種細(xì)胞因子，如干擾素 誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
[0056]組分的具體例子是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)由I-型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的MxA蛋白（Mol.Cell.Biol.， 9,5062-5072,1989；J.Virol.64,1171-1181,1990)〇
[0057] (3)膽汁酸衍生物
[0058] 本發(fā)明中的膽汁酸衍生物是與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生 物。與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物不受特別限制，只要其是能促成 本發(fā)明的免疫測(cè)定方法和抑制血紅蛋白干擾的方法的膽汁酸衍生物即可，優(yōu)選為具有兩性 表面活性劑功能或非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。
[0059] 具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的例子包括3_[(3_膽酰胺丙基）二甲 銨]丙磺酸鹽（以下簡(jiǎn)稱為CHAPS)和3_[(3_膽酰胺丙基)二甲銨]-2-羥基丙磺酸鹽（以下簡(jiǎn) 稱為 CHAPS0)。
[0060] 具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的例子包括N，N_雙(3-D-葡糖酰胺 丙基)膽酰胺（以下簡(jiǎn)稱為BIGCHAP)和N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺（以下簡(jiǎn)稱為 脫氧-BIGCHAP)。
[0061] 膽汁酸衍生物顯示出抑制血紅蛋白在待測(cè)組分與能結(jié)合該組分的抗體的反應(yīng)中 的干擾的效果，尤其是，優(yōu)選使用CHAPS，CHAPSO，BIGCHAP和脫氧-BIGCHAP。
[0062] 膽汁酸衍生物以臨界膠束濃度（cmc)的1至50倍的濃度范圍使用，尤其優(yōu)選cmc濃 度的1至10倍。在本發(fā)明中，膽汁酸衍生物可以單獨(dú)使用（一種類型），或者可以兩種或兩種 以上類型的膽汁酸衍生物組合的形式使用。
[0063] (4)聚氧乙烯非離子型表面活性劑
[0064] 聚氧乙烯非離子型表面活性劑在本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中起增強(qiáng)測(cè)量靈敏度的 作用，其優(yōu)選在免疫反應(yīng)期間存在。
[0065]本發(fā)明中的聚氧乙烯非離子型表面活性劑的例子包括聚氧乙烯烷基苯基醚，聚氧 乙稀烷基釀和聚氧乙稀脫水山梨糖醇脂肪酸醋，優(yōu)選聚氧乙稀烷基苯基釀。聚氧乙稀烷基 苯基醚中的烷基的例子包括辛基和壬基。聚氧乙烯烷基苯基醚的具體例子(市場(chǎng)上可以買 到的產(chǎn)品）是Nonidet P-40(聚氧乙稀壬基苯基醚）。
[0066]在本發(fā)明中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑可以單獨(dú)使用（一種類型），或者可以 兩種或兩種以上類型的聚氧乙烯非離子型表面活性劑組合的形式使用。在本發(fā)明的免疫測(cè) 定方法中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑的濃度優(yōu)選為0.01 %_2.0%，更優(yōu)選0.05%-1.8%，尤其優(yōu)選0.1%-1.4%。
[0067] (5)抗體和標(biāo)記抗體
[0068] 本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中所使用的抗體不受特殊限制，只要其為特異性結(jié)合待測(cè) 組分的抗體即可;并且，可以使用多克隆抗體或單克隆抗體，但優(yōu)選單克隆抗體。此外，本發(fā) 明中使用的抗體包括抗體片段。具體例子包括除去了 Fc部分的抗體片段，如通過將抗體用 木瓜蛋白酶處理后得到的Fab，通過胃蛋白酶處理得到的F(ab '）2和通過胃蛋白酶處理及還 原處理得到的Fab '。尤其是，優(yōu)選抗體片段為F(ab '）2。
[0069] 本發(fā)明中所使用的抗體可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法用待測(cè)組分或其部分作為抗原獲得，也 可以使用市場(chǎng)上可以買到的產(chǎn)品。
[0070] 在待測(cè)組分是MxA蛋白的情況下，特異性結(jié)合MxA蛋白的抗體的例子包括分別由雜 交瘤細(xì)胞系KM1122，KM1123，KM1124(FERMBP-4729)，KM1125，KM1126，KM1127，KM1128， KM1129，KM1130，KM1131，KM1132(FERMBP-4730)，KM1133，KM113^PKM1135(FERMBP-4731) 產(chǎn)生的抗人 MxA 蛋白單克隆抗體 KM1122，KM1123，KM1124，KM1125，KM1126，KM1127，KM1128， KM1129，KM1130，KM1131，KM1132，KM1133，KM1134和KM1135,其在國際公開No.W0 96/05230 中有描述。
[0071] 本發(fā)明中的標(biāo)記抗體是可以用于本發(fā)明的免疫測(cè)定待測(cè)組分的方法的抗體，其通 過稍后描述的方法用本發(fā)明中所使用的抗體和下文所述標(biāo)記物來產(chǎn)生。
[0072] (6)競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)
[0073] 在本發(fā)明中，術(shù)語"競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)"是指能與本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中所使用的"能 結(jié)合待測(cè)組分的抗體"結(jié)合，與所述組分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的物質(zhì);也包括所述組分本身。"競(jìng)爭(zhēng)性物 質(zhì)"在用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)量樣品中的待測(cè)組分時(shí)使用。因此，競(jìng)爭(zhēng)法中所使用的能結(jié)合待測(cè)組分的 抗體是能結(jié)合待測(cè)組分，競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的抗體。當(dāng)抗體與組分結(jié)合形成免 疫復(fù)合物時(shí)，其也與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
[0074] 競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)優(yōu)選為結(jié)構(gòu)上與能結(jié)合待測(cè)組分的抗體識(shí)別的表位相同的物質(zhì)。另 外，關(guān)于與能結(jié)合待測(cè)組分的抗體結(jié)合的能力，競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)優(yōu)選具有與所述組分相當(dāng)?shù)乃?平。作為競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)，待測(cè)組分本身是優(yōu)選的。
[0075] 本發(fā)明中的標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)是可以用于本發(fā)明的免疫測(cè)定待測(cè)組分的方法的物 質(zhì)，其通過稍后所述方法用上述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和稍后所述標(biāo)記物產(chǎn)生。
[0076] (7)免疫測(cè)定方法
[0077] 本發(fā)明的免疫測(cè)定方法是測(cè)量含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的免疫測(cè)定方法，其 包括在與該樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物的存在下，使含血紅蛋白樣 品中的組分與能結(jié)合該組分的抗體反應(yīng)。
[0078] 含血紅蛋白樣品和與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物的比例 優(yōu)選為1:1-1:1000,在含血紅蛋白樣品為全血的情況下，優(yōu)選1:2-1:49的比例，尤其優(yōu)選1: 4-1:9的比例。向含血紅蛋白樣品中加入與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍 生物時(shí)，加入期間的溫度優(yōu)選為約2°C-40°C，測(cè)量優(yōu)選在加入后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。
[0079] 免疫測(cè)定方法不受特別限制，只要其是基于抗原-抗體反應(yīng)的方法即可，并且對(duì)操 作方法，有或無標(biāo)記物，標(biāo)記物的類型，載體及有或無B/F分離沒有限定。
[0080] 抗原-抗體反應(yīng)可以是競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)法或非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)法。
[0081] 檢測(cè)方法可以是其中抗原-抗體反應(yīng)的結(jié)果通過凝集等直接檢測(cè)的非標(biāo)記法，或 其中抗原-抗體反應(yīng)的結(jié)果用標(biāo)記物檢測(cè)的標(biāo)記法，從測(cè)量靈敏度的角度出發(fā)，尤其優(yōu)選標(biāo) 記法。
[0082] 在本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中，可以使用需要B/F分離的異相法，或不需要B/F分離 的均相法。
[0083] 關(guān)于反應(yīng)相，可以采用所有反應(yīng)都在液相中完成的液相法，或反應(yīng)在免疫反應(yīng)的 一部分反應(yīng)物固定在固相的態(tài)中完成的固相法。
[0084] 測(cè)量方法的具體例子包括"Bio Kensayaku Kaihatsu Manual(Biological Diagnostic Agent Development Manual)"，CMC;由 Ishikawa，E 等人共同編輯的 "Koso Meneki Sokuteiho(Enzyme Immunoassay)''第三版，Igaku-Shoin;和文南犬Nippon Rinsho (Japanese Journal of Clinical Medicine)，Vol.53,No.9中所述方法。
[0085] 作為本發(fā)明的免疫測(cè)定方法的具體例子，下文顯示了測(cè)量方法1-4的方法，但本發(fā) 明不受其限制。測(cè)量方法1是為非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)法的夾心法，測(cè)量方法2和3是其中樣品中的待 測(cè)組分與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)法，測(cè)量方法4是不進(jìn)行免疫復(fù)合物和未包含在免疫復(fù)合 物中的標(biāo)記抗體或標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的分離(B/F分離)的均相法。
[0086] 測(cè)量方法1
[0087]依次進(jìn)行以下步驟(a)-(e)的方法：
[0088] (a)使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽 汁酸衍生物存在下，或在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物及聚氧乙烯 非離子型表面活性劑存在下與特異性結(jié)合該組分的第一抗體反應(yīng)，形成第一抗體與該組分 的免疫復(fù)合物；
[0089] (b)使步驟(a)中產(chǎn)生的免疫復(fù)合物在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽 汁酸衍生物存在下，或在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物及聚氧乙烯 非離子型表面活性劑存在下與能結(jié)合該組分的標(biāo)記第二抗體反應(yīng)，形成第一抗體，該組分 和標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物；
[0090] (c)將步驟(b)中形成的免疫復(fù)合物與未包含在免疫復(fù)合物中的標(biāo)記抗體分離開 來；
[0091] (d)測(cè)量步驟(b)中產(chǎn)生的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記量;和
[0092] (e)根據(jù)步驟(d)中測(cè)得的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記量確定樣品中組分的濃度。
[0093] 第一抗體優(yōu)選固定在不溶性載體上。步驟(a)和步驟(b)可以依次或同時(shí)進(jìn)行。只 要第二抗體可以與已結(jié)合第一抗體的組分結(jié)合，第一抗體所識(shí)別的組分的位點(diǎn)可以與第二 抗體所識(shí)別的組分的位點(diǎn)相同或不同，優(yōu)選這些位點(diǎn)不同。此外，如下文所述，在步驟（e) 中，樣品中組分的濃度可以用顯示該組分濃度與測(cè)得值（由標(biāo)記產(chǎn)生的信息的量)之間關(guān)系 的校正曲線來確定，該校正曲線預(yù)先用已知濃度的組分制備。
[0094] 測(cè)量方法2
[0095] 依次進(jìn)行下述步驟(a)-(d)的測(cè)量方法：
[0096] (a)使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分和標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)在與樣品中所固有的膽汁 酸衍生物不同的膽汁酸衍生物存在下，或在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸 衍生物及聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與既能結(jié)合該組分又能結(jié)合該標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性 物質(zhì)的抗體反應(yīng)，形成抗體與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的免疫復(fù)合物和抗體與組分的免疫復(fù)合物；
[0097] (b)將抗體與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)分離開 來；
[0098] (c)測(cè)量步驟(a)中形成的抗體與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記量;和
[0099] (d)根據(jù)步驟(c)中測(cè)得的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記量確定樣品中組分的濃度。
[0100] 抗體優(yōu)選固定在不溶性載體上。此外，如下文所述，在步驟(d)中，樣品中組分的濃 度可以用顯示該組分濃度與測(cè)得值（由標(biāo)記產(chǎn)生的信息的量)之間關(guān)系的校正曲線來確定， 該校正曲線預(yù)先用已知濃度的組分制備。
[0101] 測(cè)量方法3
[0102] 依次進(jìn)行下述步驟(a)-(d)的測(cè)量方法：
[0103] (a)使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分和競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)在與樣品中所固有的膽汁酸衍 生物不同的膽汁酸衍生物存在下，或在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生 物及聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與通過將標(biāo)記與既能結(jié)合該組分又能結(jié)合該競(jìng) 爭(zhēng)性物質(zhì)的抗體結(jié)合產(chǎn)生的標(biāo)記抗體反應(yīng)，形成標(biāo)記抗體與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的免疫復(fù)合物和標(biāo) 記抗體與該組分的免疫復(fù)合物；
[0104] (b)將標(biāo)記抗體與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的標(biāo)記抗體和標(biāo)記抗體與組 分的免疫復(fù)合物分離開來；
[0105] (c)測(cè)量標(biāo)記抗體與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記量;和
[0106] (d)根據(jù)步驟(c)中測(cè)得的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記量確定樣品中組分的濃度。
[0107] 競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)優(yōu)選固定在不溶性載體上。在競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)具有與組分相同的結(jié)構(gòu)的情 況下，在步驟(a)中使用固定在不溶性載體上的競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)。此外，如下文所述，在步驟(d) 中，樣品中組分的濃度可以用顯示該組分濃度與測(cè)得值（由標(biāo)記產(chǎn)生的信息的量)之間關(guān)系 的校正曲線來確定，該校正曲線預(yù)先用已知濃度的組分制備。
[0108] 測(cè)量方法4
[0109] 包括下述步驟(a)-(c)的測(cè)量方法：
[0110] (a)使含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽 汁酸衍生物存在下，或在與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物及聚氧乙烯 非離子型表面活性劑存在下與其中能結(jié)合該組分的第一抗體被標(biāo)記物1標(biāo)記的標(biāo)記抗體1 和其中能結(jié)合該組分的第二抗體被不同于標(biāo)記物1的標(biāo)記物2標(biāo)記的標(biāo)記抗體2反應(yīng)，形成 標(biāo)記抗體1，組分和標(biāo)記抗體2的免疫復(fù)合物；
[0111] (b)測(cè)量步驟(a)中形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物1和標(biāo)記物2間相互作用的變化的 量;和
[0112] (c)根據(jù)步驟(b)中測(cè)得的相互作用的變化的量確定樣品中組分的量。
[0113]只要第二抗體可以與已結(jié)合第一抗體的組分結(jié)合，第一抗體所識(shí)別的組分的位點(diǎn) 可以與第二抗體所識(shí)別的組分的位點(diǎn)相同或不同，優(yōu)選這些位點(diǎn)不同。此外，如下文所述， 在步驟(c)中，樣品中組分的濃度可以用顯示該組分濃度與測(cè)得值（由標(biāo)記產(chǎn)生的信息的 量)之間關(guān)系的校正曲線來確定，該校正曲線預(yù)先用已知濃度的組分制備。
[0114] 如上文所述，測(cè)量方法1-3是包括B/F分離的異相法。測(cè)量方法1的步驟(c)和測(cè)量 方法2及3的步驟(b)是B/F分離的步驟。在抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)被固定在不溶性載體的情況 下，B/F分離可以很容易地通過先除去反應(yīng)溶液，然后洗滌不溶性載體來進(jìn)行。更具體地說， 通過在抗原-抗體反應(yīng)后除去反應(yīng)溶液，然后用洗滌液洗滌不溶性載體，可以將不溶性載體 上形成的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的被標(biāo)記物(標(biāo)記抗體和標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì))分離開來。
[0115] 洗滌液的例子包括磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.2,含0.15mol/L氯化鈉的10mmol/L磷酸 鹽緩沖液；以下稱作PBS)，含表面活性劑的PBS和下文所述水性介質(zhì)。所述表面活性劑的例 子包括非離子型表面活性劑，如吐溫20。
[0116] 此外，在測(cè)量方法1中，當(dāng)?shù)谝豢贵w被固定在不溶性載體上時(shí)，可以在步驟(a)和步 驟(b)之間插入洗滌不溶性載體的步驟，以除去未反應(yīng)的反應(yīng)物。在這種情況下，步驟(b)變 成了使步驟(a)中形成的免疫復(fù)合物與能結(jié)合組分的標(biāo)記第二抗體反應(yīng)，形成第一抗體，組 分和標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物的步驟。
[0117] 在測(cè)量方法2中，在能結(jié)合組分的抗體未固定在不溶性載體上的情況下，在步驟 (c)中，使固定有不能結(jié)合標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)但能結(jié)合抗體的結(jié)合物質(zhì)的不溶性載體與免疫 復(fù)合物反應(yīng)，產(chǎn)生與該不溶性載體結(jié)合的免疫復(fù)合物。除去反應(yīng)溶液后，洗滌不溶性載體， 以將免疫復(fù)合物與未包含在免疫復(fù)合物內(nèi)的標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)分離開來。此外，在固定有不 能結(jié)合標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)但能結(jié)合抗體的結(jié)合物質(zhì)的不溶性載體存在下，步驟(a)的形成免 疫復(fù)合物的反應(yīng)的進(jìn)行同時(shí)帶來了免疫復(fù)合物的形成和免疫復(fù)合物在不溶性載體上的固 定化，先除去反應(yīng)溶液然后洗滌不溶性載體導(dǎo)致了免疫復(fù)合物與未包含在免疫復(fù)合物內(nèi)的 標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的分離。不能結(jié)合標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)但能結(jié)合抗體的結(jié)合物質(zhì)的例子包括能 結(jié)合抗體恒定區(qū)的抗體。在組分不是蛋白的情況下，可以在步驟(c)中加入蛋白沉淀劑，如 硫酸銨或聚乙二醇，使僅免疫復(fù)合物沉淀下來。反應(yīng)混合物離心后，免疫復(fù)合物可以與未包 含在免疫復(fù)合物內(nèi)的標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)分離。
[0118] 在測(cè)量方法1中，在第一抗體未固定在不溶性載體上的情況下，包含在免疫復(fù)合物 內(nèi)的標(biāo)記抗體與未包含在免疫復(fù)合物內(nèi)的標(biāo)記抗體的分離可以通過在B/F分離步驟中加入 固定有不能結(jié)合標(biāo)記抗體但能結(jié)合第一抗體的結(jié)合物質(zhì)的不溶性載體，然后除去反應(yīng)溶 液，并洗滌不溶性載體來進(jìn)行。此外，包含在免疫復(fù)合物內(nèi)的標(biāo)記抗體與未包含在免疫復(fù)合 物內(nèi)的標(biāo)記抗體的分離可以通過在免疫復(fù)合物形成的步驟中，在固定有不能結(jié)合標(biāo)記抗體 但能結(jié)合第一抗體的結(jié)合物質(zhì)的不溶性載體存在下形成免疫復(fù)合物，然后除去反應(yīng)溶液， 并洗滌不溶性載體來進(jìn)行。不能結(jié)合標(biāo)記抗體但能結(jié)合第一抗體的結(jié)合物質(zhì)的例子包括， 在用來產(chǎn)生第一抗體的動(dòng)物品種與用來產(chǎn)生用于標(biāo)記抗體的抗體(第二抗體）的動(dòng)物品種 不同的情況下，針對(duì)用來產(chǎn)生第一抗體的動(dòng)物品種的免疫球蛋白的抗體;和在第一抗體是 具有恒定區(qū)的抗體，標(biāo)記抗體是不具有恒定區(qū)的抗體片段，如Fab或F(ab '）2，或Fab'的情況 下，能與第一抗體的恒定區(qū)特異性結(jié)合的抗體。
[0119] (8)不溶性載體
[0120] 固定抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的不溶性載體不受限制，只要其可以穩(wěn)定地容納抗體或競(jìng) 爭(zhēng)性物質(zhì)即可。不溶性載體的優(yōu)選材料的例子包括聚合物材料，如聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚 乙烯甲苯，聚丙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，尼龍，聚甲基丙烯酸酯，明膠，瓊脂糖，纖維素，硝化纖 維素，醋酸纖維素，醋酸纖維素和聚對(duì)苯二甲酸乙二酯，玻璃，陶瓷，磁性顆粒及金屬。不溶 性載體的優(yōu)選形式的例子包括管，珠，板，微粒，如膠乳，及棒。例如，每板具有96孔的聚苯乙 烯微量滴定板是優(yōu)選的。
[0121] (9)抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)在不溶性載體上的固定化
[0122] 將抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)固定在不溶性載體上的方法的例子包括已知方法，如使用物 理鍵的方法，使用化學(xué)鍵的方法，或其組合。物理鍵的例子包括靜電鍵，氫鍵和疏水鍵?；瘜W(xué) 鍵的例子包括共價(jià)鍵和配位鍵。在用聚苯乙烯微量滴定板作為免疫測(cè)定方法的不溶性載體 的情況下，固定化的方法的例子有向板的孔中加入抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的溶液，然后在4°C-30°C孵育1小時(shí)至1天，進(jìn)行物理吸附。
[0123] 抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)可以直接或間接固定在不溶性載體上。間接固定的例子包括一 種方法，該方法包括向固定有親和素的不溶性載體加入生物素化抗體或生物素化競(jìng)爭(zhēng)性物 質(zhì)，和通過生物素與親和素之間的特異性結(jié)合將抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)固定至不溶性載體。此 外，可以將能與所述抗體特異性結(jié)合的抗體或能與所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體固定 在不溶性載體上，所述抗體或所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)可以通過這樣的抗體固定在不溶性載體上。 或者，抗體或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)可以通過共價(jià)鍵經(jīng)連接體固定在不溶性載體上。
[0124]連接體不受限制，只要其可以在抗體或組分的官能團(tuán)與不溶性載體側(cè)鏈的官能團(tuán) 之間形成共價(jià)鍵即可。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體是同時(shí)具有可以與抗體或組分的官 能團(tuán)反應(yīng)的第一反應(yīng)基團(tuán)和可以與不溶性載體側(cè)鏈的官能團(tuán)反應(yīng)的第二反應(yīng)基團(tuán)的分子。 優(yōu)選第一反應(yīng)基團(tuán)與第二反應(yīng)基團(tuán)不同?？贵w或競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的官能團(tuán)和不溶性載體表面上 具有的官能團(tuán)的例子包括羧基，氨基，縮水甘油基，巰基，羥基，酰胺基，亞氨基，N-羥基琥珀 酰基和馬來酰亞胺基。連接體上的反應(yīng)基團(tuán)的例子包括如芳基疊氮，碳二亞胺，酰肼，醛，羥 甲基膦，酰亞胺酯，異氰酸酯，馬來酰亞胺，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯，五氟苯基(PFP)酯， 補(bǔ)骨脂素，啦陡基^硫化物和乙烯基諷的基團(tuán)。
[0125] (10)抗體或待測(cè)組分的標(biāo)記
[0126] 標(biāo)記抗體或待測(cè)組分的標(biāo)記物的例子包括酶，熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，放射性同位 素，生物素，異羥基洋地黃毒苷(digoxigenin)，含有標(biāo)簽序列的多肽，金屬膠體顆粒和有色 乳膠顆粒。
[0127] 酶的例子包括堿性磷酸酶，過氧化物酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶 (glucuronidase)和螢光素酶。
[0128] 熒光物質(zhì)的例子包括熒光素異硫氰酸酯(FITC)和羅丹明B異硫氰酸酯(RITC)。其 它熒光物質(zhì)的例子包括量子點(diǎn)（Science，281，2016-2018，1998)，藻膽蛋白，如藻紅蛋白，以 及熒光發(fā)射蛋白，如綠色熒光蛋白（GFP)，紅色熒光蛋白（RFP)，黃色熒光蛋白（YFP)和藍(lán)色 熒光蛋白（BFP)。
[0129] 發(fā)光物質(zhì)的例子包括吖啶鑰（a c r i d i n i u m)及其衍生物，釕絡(luò)合物和洛粉堿 (lophine)。對(duì)于舒絡(luò)合物，優(yōu)選帶有電子供體的電化學(xué)發(fā)光化合物(在Cl in. Chem. 37，9， 1534-1539,1991 中描述）。
[0130] 放射性同位素的例子包括3H，14C，35S，32P， 125MP131I。
[0131] 含有標(biāo)簽序列的多肽的例子包括FLAG肽(FLAG標(biāo)簽，Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys)，多組氨酸(His標(biāo)簽，His His His His His His)，myc表位肽(myc標(biāo)簽，Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu)和血凝素表位肽（HA標(biāo)簽，Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala)〇
[0132] 抗體或待測(cè)組分的標(biāo)記可以通過在抗體或組分的官能團(tuán)與標(biāo)記物的官能團(tuán)之間 形成有或無連接體的共價(jià)鍵的反應(yīng)來完成。官能團(tuán)的例子包括羧基，氨基，縮水甘油基，巰 基，羥基，酰胺基，亞氨基，羥基琥珀酰酯基，馬來酰亞胺基和異硫氰酸酯基。可以進(jìn)行這些 官能團(tuán)之間的縮合反應(yīng)。
[0133] 形成不帶連接體的鍵的方法的例子包括使用碳二亞胺化合物，如EDC的方法。在這 種情況下，可以使用活性酯，如NHS或其衍生物。異硫氰酸酯基與氨基之間的縮合反應(yīng)由于 其不需要其它試劑，只要在中性至弱堿性條件下混合即可進(jìn)行反應(yīng)，因而是優(yōu)選的。
[0134] 連接體不受限制，只要其可以在標(biāo)記物與抗體之間經(jīng)其各自的官能團(tuán)成鍵即可。 例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體是在同一分子內(nèi)具有可以與抗體的氨基酸殘基反應(yīng)的第 一官能團(tuán)和可以與標(biāo)記物側(cè)鏈的官能團(tuán)反應(yīng)的第二官能團(tuán)的分子。優(yōu)選第一官能團(tuán)與第二 官能團(tuán)不同。連接體的官能團(tuán)的例子包括上文所述官能團(tuán)。
[0135] 以化學(xué)方法制備放射性同位素鍵的方法的例子包括在A n t i b 〇 d y Immunoconj .Radiopharm. ,3,60,1990中描述的方法。
[0136] 在標(biāo)記物是酶，親和素，熒光發(fā)射蛋白，藻膽蛋白或多肽，如包括標(biāo)簽序列的多肽 的情況下，可以按下法產(chǎn)生標(biāo)記抗體:產(chǎn)生含有編碼標(biāo)記物和抗體的融合蛋白的DNA的表達(dá) 載體，將表達(dá)載體引入適宜的宿主，并培養(yǎng)宿主（分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，第三片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001)。編碼融合蛋白的DNA可以通過使用各自編碼抗體和標(biāo)記物的DNA的PCR等的克隆，和 通過連接酶反應(yīng)連接各個(gè)DNA來獲得。
[0137] 在上述(6)的測(cè)量方法4中描述的均相法中使用的標(biāo)記物1和2的例子包括通過與 待測(cè)組分結(jié)合，并藉此靠近來引發(fā)相互作用的標(biāo)記物。這種標(biāo)記物的例子包括表現(xiàn)出熒光 共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的熒光物質(zhì)。FRET是第一熒光物質(zhì)受激發(fā)光激發(fā)時(shí)產(chǎn)生的熒光能量被 用作靠近第一熒光物質(zhì)的第二熒光物質(zhì)的熒光能量的現(xiàn)象，其發(fā)生在兩種熒光物質(zhì)彼此間 距離為l-l〇nm時(shí)。表現(xiàn)出FRET的熒光物質(zhì)組合的例子包括其中一種物質(zhì)的熒光波長譜與另 一種物質(zhì)的激發(fā)波長譜有一定重疊的組合。熒光物質(zhì)的例子包括熒光蛋白，低分子量有機(jī) 熒光染料和無機(jī)化合物。表現(xiàn)出FRET的熒光蛋白組合的例子包括YFP[綠色熒光蛋白（GFP) 的黃色突變體]和CFP[綠色熒光蛋白（GFP)的青色突變體]的組合。低分子量有機(jī)熒光染料 組合的例子包括Cy3和Cy5的組合。無機(jī)化合物的例子包括量子點(diǎn)（Science ,281,2016-2018,1998)。
[0138] 此外，均相法中標(biāo)記物組合的例子還包括表現(xiàn)出生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)的 產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的酶和熒光物質(zhì)的組合。表現(xiàn)出BRET的酶和熒光物質(zhì)的組合的例子包括酶降 解其底物時(shí)形成的發(fā)光波長譜與熒光物質(zhì)的激發(fā)波長譜之間有重疊的組合。組合的例子包 括作為酶的Renilla螢光素酶(Rluc)，作為底物的Deep Blue C(由Packard BioScience公 司生產(chǎn)）等，及作為熒光物質(zhì)的GFP的組合。在這種情況下，Rluc降解底物，產(chǎn)生了波長為 395nm的光;GFP靠近Rluc時(shí)，GFP接收了該光的能量，并發(fā)射出可以檢測(cè)的波長為510nm的熒 光。
[0139] 均相法中標(biāo)記物組合的例子包括其中酶在標(biāo)記物1和標(biāo)記物2互相靠近，并在某一 定向上結(jié)合時(shí)顯現(xiàn)出活性的物質(zhì)的組合。標(biāo)記物的組合的例子包括作為標(biāo)記物1的β-半乳 糖苷酶的A α亞基和作為標(biāo)記物2的β_半乳糖苷酶的Δ ω亞基的組合，及作為標(biāo)記物1的 Rluc的Ν末端結(jié)構(gòu)域和作為標(biāo)記物2的Rluc的C末端結(jié)構(gòu)域的組合。
[0140] (11)抗原-抗體反應(yīng)
[0141]抗原-抗體反應(yīng)優(yōu)選在水性介質(zhì)中進(jìn)行。反應(yīng)溫度為，例如，0°C-50°C，優(yōu)選為4°C-40°C。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為5分鐘至20小時(shí)。
[0142] (12)標(biāo)記量的測(cè)量
[0143] 測(cè)量免疫復(fù)合物中的標(biāo)記量的適宜方法可以根據(jù)標(biāo)記物進(jìn)行選擇。更具體地說， 在標(biāo)記物是色素，即吸收某一波長的光的物質(zhì)，或者測(cè)量由凝集等導(dǎo)致的濁度(吸光度)變 化的量的情況下，可以使用分光光度計(jì)，多孔板讀數(shù)器等。在標(biāo)記物為熒光物質(zhì)的情況下， 可以使用熒光分光光度計(jì)，熒光多孔板讀數(shù)器等。當(dāng)標(biāo)記物為發(fā)光物質(zhì)時(shí)，可以使用發(fā)光光 度計(jì)，發(fā)光多孔板讀數(shù)器等。在標(biāo)記物為放射性同位素的情況下，放射性同位素的量可以通 過用閃爍計(jì)數(shù)器，γ-孔計(jì)數(shù)器等測(cè)量放射性來測(cè)定。
[0144] 在標(biāo)記為酶的情況下，標(biāo)記的量可以通過測(cè)量酶活性來測(cè)定。例如，標(biāo)記的量可以 通過使酶的底物與酶反應(yīng)，然后測(cè)量形成的物質(zhì)來測(cè)定。
[0145] 在酶是過氧化物酶的情況下，過氧化物酶的活性可以通過，例如分光光度計(jì)，熒光 分光光度計(jì)等測(cè)量。通過分光光度法測(cè)量過氧化物酶活性的方法的例子包括一種方法，該 方法包括使過氧化物酶與過氧化氫和氧化色原的組合物，即過氧化物酶的底物反應(yīng)，及用 分光光度計(jì)或多孔板讀數(shù)器測(cè)量反應(yīng)溶液的吸光度。氧化著色色原的例子包括無色型色原 (leuco-type chromogen)和氧化偶合色原（oxidative coupling-coloring chromogen)。
[0146] 無色型色原是在過氧化氫和過氧化物質(zhì)，如過氧化物酶存在下自己轉(zhuǎn)化為染料的 物質(zhì)。具體例子包括四甲基聯(lián)苯胺，鄰苯二胺，10-N-羧甲基氨甲?；?3,7_雙(二甲氨基)_ 10H-吩噻嗪(CCAP)，10-N-甲基氨甲酰基-3，7-雙(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)，N-(羧甲 氨基羰基)_4,4'_雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽(DA-64)，4,4'_雙(二甲氨基)二苯胺和雙[3-雙 (4-氯苯基）甲基_4_二甲氨基苯基]胺(BCMA)。
[0147] 氧化偶合著色色原是在過氧化氫和過氧化物質(zhì)，如過氧化物酶存在下通過兩種化 合物的氧化偶合形成染料的物質(zhì)。兩種化合物的組合的例子包括偶合劑和苯胺類化合物 (TrindeH式劑)的組合，及偶合劑和酚類化合物的組合。偶合劑的例子包括4-氨基安替吡啉 (4-AA)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。苯胺類化合物的例子包括N-(3-磺丙基)苯胺，N-乙 基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(T00S)，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基 苯胺(MAOS)，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)，N-乙基-N-(3-磺丙 基)-3-甲基苯胺(TOPS)，N-(2-羥基-3-磺丙基）-3，5-二甲氧基苯胺(HDA0S)，N，N-二甲基-3-甲基苯胺，N，N-雙（3-磺丙基）-3,5_二甲氧基苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯 胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5_二甲氧基苯胺，N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，N-乙基-N-( 3-磺丙基）-3，5-二甲基苯胺，N-乙基-N-( 2-羥基-3-磺丙 基)-3_甲氧基苯胺，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺，N-乙基-N-(3-甲基苯基)-Ν'-琥珀 酰乙二胺(EMSE)，N-乙基-Ν-(3-甲基苯基)-Ν'-乙?；叶泛挺?乙基-Ν-(2-羥基-3-磺丙 基)-4_氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DA0S)。酚類化合物的例子包括苯酚，4-氯苯酚，3-甲基苯 酚和3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(ΗΤΙΒ)。
[0148] 通過熒光分光光度法測(cè)量過氧化物酶活性的方法的例子包括一種方法，該方法包 括使過氧化物酶與過氧化氫和熒光物質(zhì)的組合物，即過氧化物酶的底物反應(yīng)，及用熒光分 光光度計(jì)，熒光多孔板讀數(shù)器等測(cè)量產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。熒光物質(zhì)的例子包括4-羥基苯乙 酸，3-( 4-羥基苯基)丙酸和香豆素。
[0149] 通過發(fā)光測(cè)量法測(cè)量過氧化物酶活性的方法的例子包括一種方法，該方法包括使 過氧化物酶與過氧化氫和發(fā)光物質(zhì)的組合物，即過氧化物酶的底物反應(yīng)，及用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)， 發(fā)光多孔板讀數(shù)器等測(cè)量產(chǎn)生的冷光的強(qiáng)度。發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾化合物和光澤精 化合物。
[0150] 在酶是堿性磷酸酶的情況下，堿性磷酸酶活性可以通過，例如，發(fā)光測(cè)量法測(cè)量。 通過發(fā)光測(cè)量法測(cè)量堿性磷酸酶活性的方法的例子包括一種方法，該方法包括使堿性磷酸 酶與其底物反應(yīng)，及用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)，發(fā)光多孔板讀數(shù)器等測(cè)量產(chǎn)生的冷光的發(fā)光強(qiáng)度。堿性 磷酸酶的底物的例子包括3-(2'_螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3'_磷酰氧基)苯基-1，2-二氧環(huán) 丁燒-納鹽（AMPPD)，2 -氣-甲氧基螺[1，2 - -氧環(huán)丁燒_3,2'-(5' -氣）二環(huán) [3.3.1.13,7]癸燒]-4-基}苯基憐酸二納鹽(00?_3〖&1?)，3-{4-甲氧基螺[1，2-二氧環(huán)丁 烷-3,2'-(5'_氯)三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基}苯基磷酸二鈉鹽(CSPD?)和[10-甲基-9 (10H)-吖啶叉基]苯氧甲基磷酸二鈉鹽(Lumigen? APS-5)。
[0151] 在酶是β-D-半乳糖苷酶的情況下，β-D-半乳糖苷酶活性可以通過，例如，分光光度 法（比色法），發(fā)光測(cè)量法或熒光分光光度法測(cè)量。通過分光光度法（比色法)測(cè)量β-D-半乳 糖苷酶活性的方法的例子包括使用鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的方法。通過發(fā)光測(cè)量 法測(cè)量β-D-半乳糖苷酶活性的方法的例子包括一種方法，該方法包括使β-D-半乳糖苷酶與 其底物反應(yīng)，及通過發(fā)光強(qiáng)度計(jì)，發(fā)光多孔板讀數(shù)器等測(cè)量反應(yīng)溶液的發(fā)光。β-D-半乳糖苷 酶的底物的例子包括Galacton-Plus(由Applied Biosystems生產(chǎn))及其類似物。通過焚光 分光光度法測(cè)量β-D-半乳糖苷酶活性的方法的例子包括一種方法，該方法包括使β-D-半乳 糖苷酶與其底物反應(yīng)，及通過熒光分光光度計(jì)，熒光多孔板讀數(shù)器等測(cè)量反應(yīng)溶液的熒光。 β-D-半乳糖苷酶的底物的例子包括4-甲基傘形酮-β基-D-吡喃半乳糖苷。
[0152] 在酶是螢光素酶的情況下，螢光素酶活性可以通過，例如，發(fā)光測(cè)量法來測(cè)量。通 過發(fā)光測(cè)量法測(cè)量螢光素酶活性的方法的例子包括一種方法，該方法包括使螢光素酶與其 底物反應(yīng)，及通過發(fā)光強(qiáng)度計(jì)，發(fā)光多孔板讀數(shù)器等測(cè)量反應(yīng)溶液的發(fā)光。螢光素酶的底物 的例子包括螢光素和腔腸素。
[0153] 在標(biāo)記物是除熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，放射性同位素或酶之外的其它標(biāo)記物的情況 下，可以根據(jù)一種方法進(jìn)行檢測(cè)，該方法包括:使其中能與標(biāo)記物特異性結(jié)合的物質(zhì)被熒光 物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，放射性同位素，酶等標(biāo)記的被標(biāo)記物與構(gòu)成免疫復(fù)合物的標(biāo)記抗體或標(biāo)記 競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的標(biāo)記物結(jié)合;通過使用上文所述標(biāo)記能與標(biāo)記物結(jié)合的物質(zhì)的熒光物質(zhì)，發(fā) 光物質(zhì)，放射性同位素或酶進(jìn)行測(cè)量。能與標(biāo)記物特異性結(jié)合的物質(zhì)的例子包括能與標(biāo)記 物特異性結(jié)合的抗體，能與生物素(標(biāo)記物)特異性結(jié)合的物質(zhì)即親和素或鏈親和素。此外， 還可以根據(jù)包括以下步驟的方法進(jìn)行檢測(cè):使能與標(biāo)記物特異性結(jié)合的物質(zhì)，如能與標(biāo)記 物特異性結(jié)合的抗體和親和素或鏈親和素與免疫復(fù)合物的標(biāo)記物結(jié)合;然后使標(biāo)記抗體與 標(biāo)記物結(jié)合，其中標(biāo)記抗體通過用熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，放射性同位素，酶等標(biāo)記能與物質(zhì) 結(jié)合的抗體來形成，所述物質(zhì)能與標(biāo)記物(抗體的例子包括能與抗體的恒定區(qū)特異性結(jié)合 的抗體，和能與親和素或鏈親和素特異性結(jié)合的抗體)特異性結(jié)合;和通過使用上文所述熒 光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，放射性同位素或酶進(jìn)行測(cè)量。
[0154] 這種檢測(cè)中所用抗體，能與親和素或鏈親和素或標(biāo)記物特異性結(jié)合的抗體，能與 抗體的恒定區(qū)特異性結(jié)合的抗體，能與親和素或鏈親和素特異性結(jié)合的抗體可以是多克隆 或單克隆抗體，或其中Fc部分已被去除的抗體片段，如Fab，通過胃蛋白酶處理得到的F (ab '）2和通過胃蛋白酶處理及還原處理得到的Fab '。
[0155] (13)待測(cè)組分的測(cè)定
[0156] 對(duì)于待測(cè)組分的測(cè)定，必需用標(biāo)準(zhǔn)品，即，已知濃度組分的溶液制備顯示組分濃度 與測(cè)得值（由標(biāo)記產(chǎn)生的信息的量)之間關(guān)系的校正曲線。組分的濃度可以如下法測(cè)定：制 備校正曲線；用樣品進(jìn)行測(cè)量;和將所得測(cè)定值與預(yù)先產(chǎn)生的校正曲線關(guān)聯(lián)起來。
[0157] (14)水性介質(zhì)及其它共存物質(zhì)
[0158] 用于本發(fā)明的免疫測(cè)定方法的水性介質(zhì)的例子包括去離子水，蒸餾水和緩沖液， 優(yōu)選緩沖液。用于制備緩沖液的緩沖劑不受特別限制，只要其具有緩沖能力即可。緩沖液的 例子包括pH為1-11的緩沖液，如乳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，醋酸鹽緩沖液，琥珀酸鹽 緩沖液，鄰苯二甲酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，三乙醇胺緩沖液，二乙醇胺緩沖液，賴氨酸緩 沖液，巴比妥酸鹽緩沖液，咪唑緩沖液，蘋果酸鹽緩沖液，草酸鹽緩沖液，甘氨酸緩沖液，硼 酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液，甘氨酸緩沖液或Good ' s緩沖液。
[0159] Good's緩沖液的例子包括2-嗎啉基乙磺酸(MES)緩沖液，雙(2-羥乙基）亞氨基三 (羥甲基）甲烷(Bis-Tris)緩沖液，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)緩沖液，N-(2-乙酰胺基）亞 氨基二乙酸(ADA)緩沖液，哌嗪-N，N ' -雙(2-乙磺酸）（PIPES)緩沖液，2- [ N- (2-乙酰胺基)氨 基]乙磺酸(ACES)緩沖液，3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸(M0PS0)緩沖液，2-[N，N-雙(2-羥乙基） 氨基]乙磺酸(BES)緩沖液，3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖液，2-{N-[三(羥甲基）甲基]氨基} 乙磺酸(TES)緩沖液，N- (2-羥乙基)-N ' - (2-磺乙基)哌嗪(HEPES)緩沖液，3- [N，N-雙(2-羥 乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)緩沖液，2-羥基-3-{[N-三(羥甲基）甲基]氨基}丙磺酸 (TAPS0)緩沖液，哌嗪-N，N' -雙（2-羥基丙烷-3-磺酸）（P0PS0)緩沖液，N-( 2-羥乙基)-N' -(2-羥基-3-磺丙基）哌嗪(HEPPS0)緩沖液，N- (2-羥乙基)-N ' - (3-磺丙基）哌嗪(EPPS)緩沖 液，tricine [N-三(羥甲基）甲基甘氨酸]緩沖液，vicine [N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸]緩沖 液，3-[N-三(羥甲基）甲基]氨基丙磺酸(TAPS)緩沖液，2-(N-環(huán)己基氨基）乙磺酸(CHES)緩 沖液，3-(N-環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸(CAPS0)緩沖液和3-(N-環(huán)己基氨基)丙磺酸(CAPS) 緩沖液。
[0160] 緩沖液的濃度不受特別限制，只要其是適于測(cè)量的濃度即可，優(yōu)選為0.001-2 · 0mol/L，更優(yōu)選0 · 005-1 · 0mol/L，尤其優(yōu)選0 · 01-0 · lmol/L〇
[0161] 在本發(fā)明的免疫測(cè)定方法中，金屬離子，鹽，糖，表面活性劑，防腐劑，蛋白，蛋白穩(wěn) 定劑等可以一起出現(xiàn)。
[0162] 金屬離子的例子包括鎂離子，錳離子和鋅離子。
[0163] 鹽的例子包括氯化鈉和氯化鉀。
[0164] 糖的例子包括甘露醇和山梨醇。
[0165] 防腐劑的例子包括疊氮鈉，抗生素（鏈霉素，青霉素，慶大霉素等），BioAce， Proclin 300和Proxel GXL〇
[0166] 蛋白的例子包括牛血清白蛋白（BSA)，胎牛血清（FBS)，酪蛋白和BlockAce(由 Dainippon Pharmaceutical Co·,Ltd.生產(chǎn)）。
[0167] 蛋白穩(wěn)定劑的例子包括過氧化物酶穩(wěn)定緩沖液（由DakoCytomation生產(chǎn)）。
[0168] (15)免疫測(cè)定試劑
[0169] 本發(fā)明的免疫測(cè)定試劑可以用于本發(fā)明的免疫測(cè)定方法，其包括上文提及的（3) 的膽汁酸衍生物，必要時(shí)還包括聚氧乙烯非離子型表面活性劑。本發(fā)明的免疫測(cè)定試劑的 例子包括一種試劑，該試劑包括選自以下（i)-(iii)的組分，（3)的膽汁酸衍生物，必要時(shí)還 包括聚氧乙烯非離子型表面活性劑：
[0170] (i)能結(jié)合組分的第一抗體和能結(jié)合組分的標(biāo)記第二抗體；
[0171] (ii)標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合組分又能結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的抗體;以及
[0172] (iii)競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合組分又能結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的標(biāo)記抗體。
[0173] 本發(fā)明的免疫測(cè)定試劑的形式不受特別限制，只要其為促成本發(fā)明的免疫測(cè)定方 法的形式即可。試劑的形式的例子包括液體形式，凍干形式等。在使用凍干形式的試劑的情 況下，先將試劑溶解于前述水性介質(zhì)等之中后，再將試劑用于測(cè)量。
[0174] 關(guān)于本發(fā)明的免疫測(cè)定試劑中所使用的膽汁酸衍生物，能結(jié)合組分的抗體，競(jìng)爭(zhēng) 性物質(zhì)，能結(jié)合組分的標(biāo)記抗體和標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)，前述膽汁酸衍生物，前述能結(jié)合組分的 抗體，前述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)，前述能結(jié)合組分的標(biāo)記抗體和前述標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)可以分別使用。 此外，本發(fā)明的免疫測(cè)定試劑必要時(shí)可以包括前述水性介質(zhì)，前述金屬離子，前述鹽，前述 糖，前述表面活性劑，前述防腐劑，前述蛋白，前述蛋白穩(wěn)定劑等。
[0175] 此外，本發(fā)明的免疫測(cè)定試劑可以試劑盒的形式儲(chǔ)存和分發(fā)。試劑盒的例子包括 由兩種試劑組成的試劑盒和由三種試劑組成的試劑盒，構(gòu)成試劑盒的試劑中的組成可以由 本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇。例如，通過將膽汁酸衍生物溶解在水性介質(zhì)中制得的溶液可以 作為樣品的稀釋用溶液組成試劑盒，其可以是構(gòu)成試劑盒的試劑之一。
[0176] (16)抑制樣品中的血紅蛋白干擾的方法
[0177] 本發(fā)明提供了在免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法中抑制血紅蛋白 干擾的方法。在免疫測(cè)定待測(cè)組分的方法中，血紅蛋白的干擾可以通過與樣品中所固有的 膽汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物的共存來抑制。與樣品中所固有的膽汁酸衍生物不同的 膽汁酸衍生物的共存抑制了樣品中血紅蛋白的干擾，從而產(chǎn)生了準(zhǔn)確的測(cè)量。
[0178] 在下文中，將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，其不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的 范圍。
[0179] [實(shí)施例1]
[0180] [1]抗MxA蛋白單克隆抗體的制備
[0181] 產(chǎn)生單克隆抗體KM1124的雜交瘤細(xì)胞系KM1124(FERM BP-4729)和產(chǎn)生單克隆抗 體KM1135的雜交瘤細(xì)胞系KM1135(FERM BP-4731)各自以5-20X 106細(xì)胞/動(dòng)物的量向經(jīng)降 植燒化1^8七3116)處理的8周齡雌性裸鼠〇^113/(3)腹膜內(nèi)注射。10-21天后，雜交瘤細(xì)胞在小 鼠腹水中癌化，收集小鼠腹水。將收集到的腹水以3000rpm離心5分鐘，以除去固體內(nèi)容物， 收集上清液。通過辛酸沉淀法(抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies-A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Laboratory,1988)從上清液中純化單克隆抗體，分別得到單克隆抗 體KM1124和KM1135。
[0182] KM1124是能與從人MxA蛋白的氨基末端開始計(jì)數(shù)的第220-297個(gè)殘基中的表位結(jié) 合的小鼠單克隆抗體，KM1135是能與從人MxA蛋白的氨基末端開始計(jì)數(shù)的第10-220個(gè)殘基 中的表位結(jié)合的小鼠單克隆抗體。
[0183] [2]重組MxA蛋白的制備
[0184] 用通過在pET-14b載體（由Novagen，EMDBiosciences生產(chǎn)）的NdeI和BamHI之間插 入含有編碼人MxA蛋白的cDNA的Ndel-BamHI片段而產(chǎn)生的人MxA蛋白表達(dá)載體pET14b-MxA (Nucleic Acids Res.，32,643-652,2004)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株。該轉(zhuǎn)化體表 達(dá)已加入N末端His標(biāo)簽的MxA蛋白。
[0185] 將所得轉(zhuǎn)化體接種入5mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，在37°C振蕩培養(yǎng)細(xì)胞，直至 600nm處的光密度(0D600)達(dá)到0.5。將該培養(yǎng)液接種入250mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，在 37 °C振蕩培養(yǎng)細(xì)胞，直至600nm處的光密度達(dá)到0.3-0.5。向該培養(yǎng)物中加入異丙基硫代半 乳糖苷（IPTG)，使最終濃度為0.4mmol/L，隨后再在37°C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，之后結(jié)束培養(yǎng)。將 培養(yǎng)液在4°C以3000rpm離心10分鐘，以收集細(xì)菌細(xì)胞。在-80°C儲(chǔ)存細(xì)菌細(xì)胞，直至制備MxA 蛋白。
[0186] 由于MxA蛋白以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞中，因此將細(xì)菌細(xì)胞在冰上融化，加 入20mL冰冷的結(jié)合緩沖液(5mmol/L咪唑，0.5mol/L氯化鈉，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)， 得到懸浮液。將細(xì)菌細(xì)胞懸浮液超聲處理5次，每次30秒，以使細(xì)胞破裂，然后在4°C以 4000rpm離心10分鐘。除去上清液，沉淀懸浮在加入的20mL冰冷的結(jié)合緩沖液中。同樣再次 進(jìn)行超聲處理和離心。除去上清液，向沉淀中加入20mL含有6mol/L尿素的結(jié)合緩沖液，得到 懸浮液。進(jìn)行類似的超聲處理后，混合物在冰上放置30分鐘，使包涵體溶解，然后在4°C以 10，OOOrpm離心30分鐘。收集上清液，然后經(jīng)0.45nm微孔濾膜過濾。
[0187] 向所得溶液中加入0 · 5mL Ni-NTA His · Bind樹脂（由Novagen，EMD Biosciences 生產(chǎn)），然后在4°C全部旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)，使MxA蛋白經(jīng)His標(biāo)簽與樹脂結(jié)合。該混合物在4°C以 3000rpm離心2分鐘，以回收樹脂。向樹脂中加入10mL含有6mol/L尿素的冰冷結(jié)合緩沖液后， 全部混合物在4°C以3000rpm離心2分鐘，以回收樹脂。重復(fù)該洗滌操作后，之后向樹脂中另 加入10mL冰冷的洗滌緩沖液（6mol/L尿素，60mmol/L咪唑，0 · 5mol/L氯化鈉，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)，全部混合物在4°C以3000rpm離心2分鐘，以回收樹脂。
[0188] 將10mL冰冷的洗脫緩沖液(6mol/L尿素，lmol/L咪唑，0.5mol/L氯化鈉，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)加入到樹脂中，在4°C全部旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)，以從樹脂上洗脫MxA蛋白。混 合物隨后在4°C以3000rpm離心2分鐘，收集上清液作為MxA蛋白溶液。
[0189 ] [ 3 ]抗MxA蛋白抗體固定化板的制備
[0190] 將[1 ]中制得的抗MxA蛋白單克隆抗體KM1135用roS稀釋至濃度為5yg/mL，混合物 以lOOyL/孔的量分配在96孔微量滴定板（由Nalge Nunc International生產(chǎn)）中。將滴定板 放置 3 天后，吸除上清液，加入 25%BlockAce(由 Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.生 產(chǎn)）和300yL PBS，滴定板在室溫下放置過夜，以進(jìn)行阻斷。除去阻斷溶液后，用PBS洗滌。滴 定板用真空干燥器干燥3天后用作抗MxA蛋白單克隆抗體固定化板。
[0191] [4]過氧化物酶標(biāo)記的抗MxA蛋白抗體的制備
[0192]通過下文所述馬來酰亞胺法使[1]中制備的抗MxA蛋白單克隆抗體KM1124與過氧 化物酶（以下簡(jiǎn)稱P0D)結(jié)合，得到P0D標(biāo)記抗MxA蛋白抗體。
[0193] 首先，用0. lmo 1 /L硼酸鹽緩沖液(pH 8.0)取代含有2mg抗MxA蛋白抗體KM1124的溶 液的溶劑，加入〇. 〇86mg 2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽（由PIERCE生產(chǎn)）。攪拌混合物，攪拌后 繼續(xù)在30°C反應(yīng)30分鐘。用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0)平衡的Sephadex G25(由 Amersham Bioscience生產(chǎn))柱（1 ·5cm直徑X30cm)除去反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的2-亞氨基硫雜 環(huán)戊烷，并收集巰基化KM1124。
[0194] 同時(shí)，將摩爾比相當(dāng)于抗MxA蛋白抗體KM1124的5倍量的2.5mg P0D(由Τ0Υ0Β0生 產(chǎn)，過氧化物酶?-c)溶解在250yL 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中。溶液在30°C加溫5分 鐘，加入0·72mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺（由Nacalai Tesque生產(chǎn)）中的N-(6_馬來酰亞胺 己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS，由D0JIND0 Laboratories生產(chǎn)），攪拌混合物，反應(yīng)繼續(xù)在30 °C進(jìn)行30分鐘。用0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)平衡的Sephadex G25柱（1.5cm直徑X 30cm)將反應(yīng)溶液進(jìn)行凝膠過濾，以除去未反應(yīng)的EMCS，并收集馬來酰亞胺化P0D。
[0195] 將以上獲得的巰基化抗MxA蛋白抗體KM1124的溶液與馬來酰亞胺化POD的溶液混 合，在3 0 °C反應(yīng)1小時(shí)。所得標(biāo)記抗體用P 0 D標(biāo)記稀釋劑（液體組合物）緩沖液[5 0 m m ο 1 / L Bis-Tris(由D0JIND0 Laboratories生產(chǎn)），0.1%BSA(由InterGen生產(chǎn)）]稀釋800倍。
[0196] [5]樣品稀釋劑的制備
[0197] 各自制備以下組合物的樣品稀釋劑：
[0199] [6]使用夾心酶聯(lián)免疫吸附法的MxA蛋白測(cè)定系統(tǒng)的構(gòu)建
[0200] 上述[2]中制備的MxA蛋白溶液用上述[5]中制備的樣品稀釋劑稀釋成濃度為0(只 有緩沖液），3.2，6.3，12.5，25，50，100和200ng/mL的MxA蛋白溶液，將這些溶液用作測(cè)量用 樣品。
[0201] 向上述[3]中產(chǎn)生的抗MxA蛋白抗體固定化板中加入100yL測(cè)量用樣品，然后混合 物在室溫孵育1小時(shí)，使測(cè)量用樣品中的MxA蛋白與抗體結(jié)合。除去測(cè)量用樣品后，加入400μ L洗滌液(含0.05 %吐溫20(由ΚΑΝΤΟ CHEMICAL生產(chǎn)）的roS)，再除去洗滌液，如此重復(fù)該洗 滌操作5次。接著加入100yL[4]中制備的P0D標(biāo)記的抗MxA蛋白抗體溶液，繼續(xù)在室溫下反應(yīng) 30分鐘。除去標(biāo)記抗體，重復(fù)進(jìn)行加入400yL洗滌液，然后除去洗滌液的洗滌操作5次。在暗 處加入l〇〇yL含0.05%四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的P0D的發(fā)色底物TMBlue(由Serological 生產(chǎn)），繼續(xù)在室溫反應(yīng)10分鐘。加入l〇〇yL 0.5mol/L硫酸，并在室溫孵育10分鐘，使反應(yīng)終 止。用板讀數(shù)器測(cè)量450nm波長處的吸光度。結(jié)果顯示，吸光度隨著測(cè)量用樣品中MxA蛋白濃 度的增加而增大，這證明了 MxA蛋白可以被測(cè)量。
[0202] 實(shí)際上，在測(cè)量血液中的MxA蛋白濃度的情況下，以這種方式獲得的校正曲線被用 來測(cè)定血液中的MxA蛋白。
[0203] [ 7 ]使用血液的MxA蛋白的加樣回收試驗(yàn)
[0204]使用用EDTA · 2Na采血管從兩名病毒感染的MxA蛋白陽性患者和三名健康個(gè)人采 集的血液。
[0205]將該血液用[5]的樣品稀釋劑稀釋10倍，所得樣品根據(jù)方法[6]測(cè)量各樣品中的 MxA蛋白濃度，將測(cè)得的濃度定義為未添加MxA蛋白樣品（以下簡(jiǎn)稱A)的MxA蛋白濃度。
[0206] 接著，向9份這些樣品溶液中加入1份上述[2]中制備的500ng/mL MxA蛋白溶液，制 得的樣品根據(jù)方法[6]測(cè)量各樣品中的MxA蛋白濃度，將測(cè)得的濃度定義為添加MxA蛋白樣 品（以下簡(jiǎn)稱B)的MxA蛋白濃度。按下式計(jì)算MxA蛋白回收率（％ ):
[0207] ]\^^蛋白回收率（％) = (8_厶)/50*100 (式1)
[0208] 理論上，當(dāng)血紅蛋白的干擾被完全抑制時(shí)，MxA蛋白回收率（％ )應(yīng)變成100%，當(dāng)血 紅蛋白干擾出現(xiàn)時(shí)，其值將減小。
[0209] 對(duì)比實(shí)施例1
[0210]除了將實(shí)施例1中[5]的組合物去除表面活劑后的樣品稀釋劑用作樣品稀釋劑外， 通過與實(shí)施例1類似的方法進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。
[0211] 對(duì)比實(shí)施例2
[0212] 通過與實(shí)施例1類似的方法進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，其中用0.2%Nonidet P40作為實(shí) 施例1中[5 ]的組合物中的表面活性劑。
[0213] 表1
[0214]
[0215] 表1顯示，測(cè)量中膽汁酸衍生物的加入增加了MxA蛋白回收率的水平，這表明血紅 蛋白的干擾被抑制了。
[0216][實(shí)施例2]
[0217] 對(duì)歸因于向以上[5 ]中所述含4.9 % CHAPS的樣品稀釋劑組合物中加入了 Nonidet P-40的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)。以0 %，0.2 %，1 %和1.4 %的量向上述[5 ]的樣品稀釋劑中加入 Nonidet P-40，制備濃度為0(僅含緩沖液），3.2，6.3，12.5，25，50，100和200ng/mL的在上述
[2]中制得的MxA蛋白的溶液，通過實(shí)施例1的[6]中所述方法測(cè)量吸光度(Abs)。結(jié)果見表2。 [0218]表2
[0220] 表2顯示，根據(jù)Nonidet P-40量的不同，吸光度的增加引起了靈敏度的增加。
[0221] [實(shí)施例3]
[0222] 將用EDTA · 2Na采血管從兩名病毒感染的MxA蛋白陽性患者和三名健康個(gè)人采集 的血液用作樣品。
[0223] 按照與實(shí)施例1類似的方法測(cè)定MxA蛋白回收率，除了用含有4.9%CHAPS的樣品稀 釋劑，含有4.9 % CHAPS和1.4 % Nonidet P-40的樣品稀釋劑作為樣品稀釋劑。結(jié)果見表3。
[0224] 表 3
[0225]
[0226] 表3顯示，加入Nonidet P-40時(shí)，回收率仍未減少。
[0227] 工業(yè)實(shí)用性
[0228] 本發(fā)明提供了免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法，其實(shí)現(xiàn)了對(duì)血紅蛋 白干擾的抑制，并適用于臨床診斷。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 免疫測(cè)定含血紅蛋白樣品中的待測(cè)組分的方法，其包括在與所述樣品中所固有的膽 汁酸衍生物不同的膽汁酸衍生物存在下使待測(cè)組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)，其中所 述待測(cè)組分是MxA蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)進(jìn)一步在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在 下進(jìn)行。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中免疫測(cè)定的方法是夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中使組分與能結(jié)合所述組分的抗體反應(yīng)為： (1) 使所述組分與能結(jié)合所述組分的第一抗體和能結(jié)合所述組分的標(biāo)記第二抗體反 應(yīng)， (2) 使所述組分與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的抗 體反應(yīng)，或 (3) 使所述組分與競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)和既能結(jié)合所述組分又能結(jié)合所述競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的標(biāo)記抗 體反應(yīng)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生 物是具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。6. 權(quán)利要求1或2的方法，其中不同于樣品中所固有的膽汁酸衍生物的膽汁酸衍生物是 具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物。7. 權(quán)利要求5的方法，其中具有兩性表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是3-[(3_膽酰胺 丙基)二甲銨]丙磺酸鹽（以下簡(jiǎn)稱為CHAPS)或3-[ (3-膽酰胺丙基)二甲銨]-2-羥基丙磺酸 鹽（以下簡(jiǎn)稱為CHAPSO)。8. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物是N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)膽酰胺（以下簡(jiǎn)稱為BIGCHAP)或N，N-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽 酰胺（以下簡(jiǎn)稱為脫氧 -BIGCHAP)。9. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是聚氧乙烯烷基苯基醚。 1 〇.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中樣品是全血。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK105866401SQ201610190769
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2007年11月1日
【發(fā)明人】川村瑞穗, 富田聰仁
【申請(qǐng)人】協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社