基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條及制備方法和應用，所述試紙條組成包括底板、吸水紙、硝酸纖維膜、結合墊、樣品墊，所述底板上粘貼硝酸纖維膜，硝酸纖維膜的一端連接吸水紙、另一端粘貼結合墊，所述結合墊上搭接樣品墊，硝酸纖維膜上設有質控線C線和檢測線T線。與現(xiàn)有技術中的免疫層析試紙條不同，本發(fā)明采用表面帶羧基的超順磁性氧化鐵納米顆粒聚集體作為標記探針，創(chuàng)新性地用普魯士藍染液對Fe3O4進行染色，有效放大檢測信號。試紙條檢測操作簡單，無需特殊儀器、特殊實驗環(huán)境，無需專業(yè)人員即可進行樣品的檢測，且成本低，反應迅速，短時間內即可完成檢測。
【專利說明】
基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙條及其制備方法，特別涉及一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條及制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]免疫層析檢測是一種廉價、快速的床旁測試方法。廣泛應用于人體及動物醫(yī)學、食品工程、制藥、生物制劑、個人護理、環(huán)境監(jiān)測、水質監(jiān)測等。其在2010年市場規(guī)模達到了33.6億美元，其中美國市場貢獻了 16.8億美元，約占50 %，歐洲市場為40 %，13.44億美元，剩下不到10%為其他國家所有。在過去的30年里，側向免疫層析技術得到了飛躍式的發(fā)展，到2010年，有超過100家的企業(yè)在制備生產(chǎn)試紙條。然而，盡管市場巨大，而且仍然不斷增長，但是不到30家公司(主要為瑞士的羅氏、美國的艾美利爾、碧迪等)，持有94%的市場份額。其基本概念是將抗體抗原的免疫反應設置在多孔的硝酸纖維膜上。當加入待測樣本后，在硝酸纖維膜一端的探針被釋放，隨著待測樣本一同流向另一端。通過讀取檢測線上探針的信號，得到檢測結果?，F(xiàn)在市面上大多數(shù)的探針都是采用膠體金作為標記探針，通過肉眼或者光學儀器讀取顏色信號。膠體金作為免疫層析用的探針其技術成熟穩(wěn)定，但是對于某些靈敏度要求高的樣本，檢測線上標記物的顏色很淡，甚至有可能被背景噪聲覆蓋，導致低值樣本和零濃度樣本的值難以區(qū)分，因此檢測的靈敏度受到了限制。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條，所述試紙條采用超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體替換了免疫層析中的膠體金，將超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體與單克隆捕獲抗體成功結合，形成探針，將超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體的磁學性能和抗體、抗原特異免疫反應結合，建立了快速、特異、簡便、靈敏的免疫層析試紙條。
[0004]本發(fā)明的另一目的還在于提供上述超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0006]—種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條，所述試紙條包括底板、吸水紙、硝酸纖維膜、結合墊、樣品墊，所述底板上粘貼硝酸纖維膜，硝酸纖維膜的一端連接吸水紙、另一端粘貼結合墊，所述結合墊上搭接樣品墊，硝酸纖維膜上設有一條包被有羊抗鼠IgG抗體的質控線C線，其特征在于，所述硝酸纖維膜上還設有一條與所述質控線C線平行的包被有單克隆檢測抗體的檢測線T線，所述結合墊為固定有超順磁性氧化鐵納米顆粒聚集體偶聯(lián)單克隆捕獲抗體免疫探針的玻璃纖維膜。
[0007]所述試紙條還設有一個上蓋，所述上蓋上設置有加樣窗口和信號讀取窗口，其中加樣窗口與樣品墊對應，信號讀取窗口與質控線C線、檢測線T線對應。
[0008]所述試紙條還可以與普魯士藍染液聯(lián)合使用，樣品加入后，將普魯士藍染液加入到檢測窗口，檢測線、質控線上的氧化鐵顆粒形成強烈的深藍色普魯士藍，用儀器讀取結果O
[0009]所述的普魯士藍染液是含量為1-1Owt%的亞鐵氰化鉀水溶液和含量為5_20wt%的鹽酸的等體積混合物。染色過程中鹽酸透過小分子將表面一層顆粒溶解，形成的三價鐵離子和亞鐵氰化鉀反應形成深藍色普魯士藍；
[0010]所述超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體為表面帶羧基的氧化鐵納米顆粒聚集體，所述納米顆粒聚集體表面有檸檬酸三鈉。
[0011]所述單克隆捕獲抗體優(yōu)選為抗hCG單克隆捕獲抗體或心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體;所述單克隆檢測抗體優(yōu)選為抗hCG單克隆檢測抗體或心肌肌鈣蛋白I檢測抗體。
[0012]所述的底板為PVC硬塑底板，樣品墊為玻璃纖維膜，吸水紙為硬紙板。
[0013]本發(fā)明還涉及上述基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:
[0014](I)以氯化高鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉為原料，乙二醇為溶劑，通過溶劑熱法制備表面帶有羧基的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體；
[0015](2)將步驟(I)中制備的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體表面羧基用EDC/NHS活化，再加單克隆捕獲抗體進行偶聯(lián)，最后加入BSA封閉，磁分離后重懸備用，制得免疫探針；
[0016](3)用噴膜劃線設備將步驟(2)中制備的免疫探針固定在結合墊上，并預處理樣品墊；
[0017](4)采用噴膜劃線設備將單克隆檢測抗體、羊抗鼠IgG抗體包被在硝酸纖維膜上；
[0018](5)在試紙條底板上粘貼硝酸纖維膜，硝酸纖維膜的一端連接吸水紙、另一端連接結合墊，樣品墊搭在結合墊上，兩端交錯；
[0019]更具體和優(yōu)化地，所述的方法包括以下步驟:
[0020](I)稱取氯化高鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉溶于乙二醇中，其中氯化高鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉的質量比為0.6?3.0:1?4: 3?9，氯化高鐵與乙二醇的質量體積比為0.6g?3.0g: 50mL?100mL，將上述溶液倒入聚四氟乙烯內襯的反應釜中，100?250 °C條件下，反應8?24h，然后分別用乙醇、純水清洗，并保存在超純水中，按照鐵含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面帶有羧基的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體；
[0021](2)取步驟(I)制備的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體加入超純水中，其濃度按鐵含量記為0.1?10mg/mL；再加入EDC/NHS，其中Fe:EDC:NHS質量比為1:0.1?10:0.1?10，混合溶液充分混勻后放入空氣浴恒溫搖床中控制溫度為O?50 °C、轉速為50?220rpm，反應1min?lh，磁分離，得到活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體;按照單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體質量比0.01?0.500:1，將單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體混合加入偶聯(lián)緩沖液中，并將其置于空氣浴恒溫搖床中控制溫度為O?50°C、轉速為50?220rpm，反應30min?2h后，加入BSA，使混有單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體的偶聯(lián)緩沖液中BSA質量濃度為0.1?I %，繼續(xù)在空氣浴搖床中反應I?2h，然后磁分離，再用清洗緩沖液清洗三次，最后用重懸液重懸至Fe含量為I?4mg/mL，制得免疫探針；
[0022](3)將樣品墊、結合墊浸泡在處理液中，0.5?2min后取出，然后在15?70°C烘箱中干燥待用;將步驟⑵制得的免疫探針以2?lOyL/cm的量，噴灑在結合墊上、干燥，制得固定有探針的結合墊以及經(jīng)過處理的樣品墊。
[0023](4)將硝酸纖維膜放置在濕度為25?65%的密閉箱中平衡lh，將單克隆檢測抗體用pH為6.5?7.5的tris-鹽酸緩沖液稀釋至0.2?2mg/mL，羊抗鼠IgG抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.1?lmg/mL，將上述兩種抗體在硝酸纖維膜上劃線，劃線量為0.2?2yL/cm，劃線結束后，干燥備用；
[0024](5)在帶有粘性的PVC底板中部粘貼步驟(4)制備的硝酸纖維膜，所述硝酸纖維膜一端粘貼吸水紙，二者重疊寬度為0.5?2cm;所述硝酸纖維膜另一端接結合墊，二者相互交錯，重疊寬度為0.5?4cm;樣品墊覆蓋在結合墊上，將底板固定，最后裁切成免疫層析試紙條。
[0025]所述方法步驟(2)中，所述偶聯(lián)緩沖液為緩沖基液，所述緩沖基液為濃度為0.002?0.2M、pH=6.0?9.0的碳酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液中的一種;所述清洗緩沖液為緩沖基液中加入占緩沖基液總質量0.05?0.^^%的吐溫-20;所述重懸液為緩沖液基液中加入占緩沖基液總質量0.05?0.1wt %的吐溫-20、I?5wt %的蔗糖以及0.1?Iwt %的海藻糖。
[0026]所述方法步驟(3)中，所述樣品墊和結合墊為親水或者疏水的玻璃纖維或聚酯纖維。
[0027]所述方法步驟(3)中，所述處理液為緩沖液與效應物的混合溶液，所述緩沖液為pH=4?9、濃度為0.002?0.2M的碳酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液中的一種，所述效應物為占處理液總質量0.01?Iwt %的分子量為400?20000的PEG、0.01?lwt%的疊氮鈉、0.05?5wt%的酪蛋白、0.05?5wt%的胎牛血清蛋白、0.01?子量為1K?30K的聚乙烯P比略燒酮、0.01?Iwt%的吐溫-20或Triton X_100、0.01?1界1:%的鹿糖或海藻糖中的其中任意一種或者任意幾種。
[0028]所述方法步驟(4)中，所述硝酸纖維膜為跑水速度為75s、90s、135s或180s的硝酸纖維膜。
[0029]所述方法步驟(4)中，所述用于稀釋羊抗鼠IgG抗體的緩沖液為pH=4?9、濃度為
0.005?0.5M的磷酸鹽緩沖液，pH = 6?9、濃度為0.1?3M三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH=6?9、濃度為0.02?2M的硼酸鹽緩沖液中的任意一種。
[0030]所述方法中，將待測樣品加入樣品墊15?20min后，將普魯士藍染液加入到所述檢測窗口，檢測線、質控線上的氧化鐵顆粒形成強烈的深藍色普魯士藍，用儀器讀取結果。
[0031]所述單克隆捕獲抗體優(yōu)選為抗hCG單克隆捕獲抗體和心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體;所述單克隆檢測抗體優(yōu)選為抗hCG單克隆檢測抗體和心肌肌鈣蛋白I檢測抗體。
[0032]本發(fā)明中利用雙抗夾心法對待測樣本進行可視化判讀或灰度值定量檢測。以hCG為例，將含有一定量或不含hCG血清樣品滴加到樣品墊中，10?15min中后，用視力判讀定性結果，或者用灰度值讀取儀器進行定量測量。為了進一步提高試紙條的靈敏度，在樣品加入15?20min后，在檢測窗口加入配好的普魯士藍染液5?100yL，染色時間為I?5min，再用目測或者灰度值讀取儀器進行測量。
[0033]檢測原理為:將含有待測物的樣本滴加到樣品墊后，樣本被樣品墊上已干燥的緩沖液成分改性，進入到結合墊后，結合墊上的免疫探針被釋放，隨著樣本一同流向吸水紙一偵U。在流動過程中，待測物與免疫探針發(fā)生免疫反應，形成抗原探針復合物，該復合物在經(jīng)過檢測線時，被固定在檢測線上的單克隆檢測抗體截獲，形成檢測信號，部分沒有捕獲抗原的免疫探針繼續(xù)流動到質控線上，形成質控信號。當加入普魯士藍染液后，鹽酸將檢測線和質控線上的Fe3O4變?yōu)镕e3+鐵離子，亞鐵氰跟離子，與三價鐵形成復合物，顯示出強烈的藍色，從而進一步提高免疫層析試紙條的靈敏度。
[0034]有益效果:超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體表面帶羧基，可以直接與捕獲抗體上的氨基形成共價鍵，相對于膠體金、膠乳的靜電吸附，這種連接方式更加穩(wěn)定可靠;超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體作為一種超順磁性質材料，只有在磁場中才能顯示出磁性，因此磁性微球在溶液中不容易發(fā)生聚集沉淀，直接使用磁力架進行磁分離清洗，省去了繁瑣的離心過程;采用普魯士藍染色，能夠進一步提高靈敏度，實現(xiàn)定量檢測?；谝陨希景l(fā)明采用超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體成功替換了免疫層析中的膠體金，將超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體與單克隆捕獲抗體成功結合，形成免疫探針，將超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體的磁學性能和抗體、抗原特異免疫反應結合，建立了快速、特異、簡便、靈敏的免疫層析檢測方法。通過用普魯士藍染色，能夠進一步將檢測靈敏度提高，實現(xiàn)定量檢測。
[0035]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述。本發(fā)明的保護范圍并不以【具體實施方式】為限，而是由權利要求加以限定。
【附圖說明】
[0036]圖1(A)為一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的俯視圖；圖10)為一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的內部透視圖。其中I為加樣窗口，2為信號讀取窗口，3為樣品墊，4是結合墊，5是硝酸纖維膜，6是檢測線，7是質控線，8是吸水紙，9為底板，10為上蓋。
[0037]圖2為一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條在普魯士藍染液加入前后檢測T線上灰度值隨hCG濃度的變化曲線。
[0038]圖3(A)為本發(fā)明所述的免疫層析試紙條滴加待測樣品ISmin后用普魯士藍染液染色前的顏色；圖3(B)為本發(fā)明所述的免疫層析試紙條滴加待測樣品ISmin后用普魯士藍染液染色后的顏色。
[0039]圖4為超順磁性氧化鐵納米顆粒聚集體掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0040]下面通過具體實施例對本發(fā)明所述的技術方案給予進一步詳細的說明，但有必要指出，以下實施例只用于對
【發(fā)明內容】
的描述，并不構成對本發(fā)明保護范圍的限制。
[0041]實施例1-2中所述抗hCG單克隆捕獲抗體購買于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆號為28A4;抗hCG單克隆檢測抗體購買于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆號為27E8;心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體購買于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆號為19C7;和心肌肌鈣蛋白I檢測抗體購買于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆號為820。
[0042]實施例1
[0043](I)稱取氯化高鐵3.0g，檸檬酸三鈉4g，乙酸鈉9g，溶于乙二醇100mL。待溶質完全溶解后，將得到的黃褐色混合物倒入聚四氟乙烯內襯的反應釜中，100條件下，反應24h，然后分別用乙醇、純水清洗，并將得到的黑色產(chǎn)物保存在超純水中，按照鐵含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面帶有羧基的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體；
[0044](2)取步驟(I)制備的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體5mg加入ImL超純水中，放入空氣浴恒溫搖床中控制溫度為25°C、轉速為180rpm，反應40min，磁力架磁分離，得到活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體;按照抗hCG單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體質量比0.500: I，將2.5mg抗hCG單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體混合加入ImL偶聯(lián)緩沖液中，并將其置于空氣浴恒溫搖床中控制溫度為10°C、轉速為220rpm，反應2h后，加入BSA，使混有抗hCG單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體的偶聯(lián)緩沖液中BSA濃度為lwt%，繼續(xù)在空氣浴搖床中反應2h，然后磁分離，再用清洗緩沖液清洗三次，最后用重懸液重懸至Fe含量為4mg/mL，制得抗hCG免疫抗體探針;所述偶聯(lián)緩沖液為緩沖基液，所述緩沖基液為濃度為0.02M、pH=9.0的碳酸緩沖液;所述清洗緩沖液為緩沖基液中加入占緩沖基液總質量0.1wt%的吐溫-20;所述重懸液為緩沖液基液中加入占緩沖基液總質量0.1wt %的吐溫-20、5wt %的蔗糖以及Iwt %的海藻糖。
[0045](3)選用親水的玻璃纖維為樣品墊和結合墊，將樣品墊、結合墊浸泡在10mL緩沖液與效應物的混合溶液中，2min后取出，然后在70°C烘箱中干燥待用;將步驟(2)制得的抗hCG免疫抗體探針以I OyL/cm的量，噴灑在結合墊上、干燥，制得固定有探針的結合墊以及經(jīng)過處理的樣品墊。所述緩沖液為pH=9、0.002M的磷酸緩沖液，所述效應物為占處理液總質量lwt%的分子量為400?20000的PEG、lwt%的疊氮鈉、0.05wt%的酪蛋白、0.05wt%的胎牛血清蛋白、0.01wt%的海藻糖。
[0046](4)選用跑水速度為90s的硝酸纖維膜，將硝酸纖維膜放置在濕度為25?65%的密閉箱中平衡Ih，將120yg抗hCG單克隆檢測抗體用pH為6.5的tr i s-鹽酸緩沖液稀釋至2mg/mL，60yg羊抗鼠IgG抗體用緩沖液稀釋至lmg/mL，將上述兩種抗體在硝酸纖維膜上劃線，劃線量為yL/cm，劃線結束后，干燥備用;所述用于稀釋羊抗鼠IgG抗體的緩沖液為pH=7.4、濃度為0.005M的磷酸鹽緩沖液。
[0047](5)在帶有粘性的PVC底板中部粘貼步驟(4)制備的硝酸纖維膜，所述硝酸纖維膜一端粘貼吸水紙，二者重疊寬度為2cm;所述硝酸纖維膜另一端接結合墊，二者相互交錯，重疊寬度為4cm;樣品墊覆蓋在結合墊上，將底板固定，最后裁切成免疫層析試紙條。
[0048](6)利用雙抗夾心法對待測樣本進行可視化判讀或灰度值定量檢測。將含有一定量或不含hCG的血清樣品加入樣品墊20min后，用視力判讀定性結果，或者用灰度值讀取儀器進行定量測量。為了進一步提高試紙條的靈敏度，在樣品加入20min后加入配好的普魯士藍染液lOOyL，染色時間為3min，再用目測或者灰度值讀取儀器進行測量。將普魯士藍染液加入到所述檢測窗口，檢測線、質控線上的氧化鐵顆粒形成強烈的深藍色普魯士藍，用儀器讀取結果。
[0049]實施例2
[0050](I)稱取氯化高鐵0.6g，檸檬酸三鈉lg，乙酸鈉3g，溶于乙二醇50mL。待溶質完全溶解后，將得到的黃褐色混合物倒入聚四氟乙烯內襯的反應釜中，250°C條件下，反應8h，然后分別用乙醇、純水清洗，并將得到的黑色產(chǎn)物保存在超純水中，按照鐵含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面帶有羧基的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體；
[0051 ] (2)取步驟(I)制備的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體5mg加入ImL超純水中，放入空氣浴恒溫搖床中控制溫度為50°C、轉速為50rpm，反應60min，磁力架磁分離，得到活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體;按照心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體質量比0.0l:1，將0.05mg心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體混合加入ImL偶聯(lián)緩沖液中，并將其置于空氣浴恒溫搖床中控制溫度為50°C、轉速為50rpm，反應30min后，加入BSA，使混有心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體的偶聯(lián)緩沖液中BSA濃度為0.lwt%，繼續(xù)在空氣浴搖床中反應2h，然后磁分離，再用清洗緩沖液清洗三次，最后用重懸液重懸至Fe含量為4mg/mL，制得抗心肌肌鈣蛋白I免疫探針;所述偶聯(lián)緩沖液為緩沖基液，所述緩沖基液為濃度為0.002M、pH= 9.0的碳酸緩沖液;所述清洗緩沖液為緩沖基液中加入占緩沖基液總質量0.1wt %的吐溫-20;所述重懸液為緩沖液基液中加入占緩沖基液總質量0.1wt %的吐溫-20、5wt %的蔗糖以及1?〖％的海藻糖。
[0052](3)選用疏水的聚酯纖維為樣品墊和結合墊，將樣品墊、結合墊浸泡在10mL緩沖液與效應物的混合溶液中，0.5min后取出，然后在15°C烘箱中干燥待用;將步驟(2)制得的抗心肌肌鈣蛋白I免疫探針以2yL/cm的量，噴灑在結合墊上、干燥，制得固定有探針的結合墊以及經(jīng)過處理的樣品墊。所述緩沖液為pH = 9、濃度為0.002M的磷酸緩沖液，所述效應物為占處理液總質量Iwt %的分子量為20000的PEG、Iwt %的疊氮鈉、0.05wt%的酪蛋白、
0.05界1:%的胎牛血清蛋白、0.01界1:%的海藻糖。
[0053](4)選用跑水速度為180s的硝酸纖維膜，將硝酸纖維膜放置在濕度為65%的密閉箱中平衡Ih，將60yg心肌肌I丐蛋白I檢測抗體用pH為7.2的tris-鹽酸緩沖液稀釋至2mg/mL，30yg羊抗鼠IgG抗體用緩沖液稀釋至2mg/mL，將上述兩種抗體在硝酸纖維膜上劃線，劃線量為lyL/cm，劃線結束后，干燥備用;所述用于稀釋羊抗鼠IgG抗體的緩沖液為pH=9、濃度為0.005M的磷酸鹽緩沖液。
[0054](5)在帶有粘性的PVC底板中部粘貼步驟(4)制備的硝酸纖維膜，所述硝酸纖維膜一端粘貼吸水紙，二者重疊寬度為2cm;所述硝酸纖維膜另一端接結合墊，二者相互交錯，重疊寬度為4cm;樣品墊覆蓋在結合墊上，將底板固定，最后裁切成免疫層析試紙條。
[0055](6)利用雙抗夾心法對待測樣本進行可視化判讀或灰度值定量檢測。將含有一定量或不含心肌肌鈣蛋白I的血清樣品加入樣品墊20min后，用視力判讀定性結果，或者用灰度值讀取儀器進行定量測量。為了進一步提高試紙條的靈敏度，在樣品加入20min后加入配好的普魯士藍染液lOOyL，染色時間為3min，再用目測或者灰度值讀取儀器進行測量。將普魯士藍染液加入到所述檢測窗口，檢測線、質控線上的氧化鐵顆粒形成強烈的深藍色普魯士藍，用儀器讀取結果。
【主權項】
1.一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條，所述試紙條組成包括底板、吸水紙、硝酸纖維膜、結合墊、樣品墊，所述底板上粘貼硝酸纖維膜，硝酸纖維膜的一端連接吸水紙、另一端粘貼結合墊，所述結合墊上搭接樣品墊，硝酸纖維膜上設有一條包被有羊抗鼠IgG抗體的質控線C線，其特征在于，所述硝酸纖維膜上還設有一條與所述質控線C線平行的包被有單克隆檢測抗體的檢測線T線，所述結合墊為固定有超順磁性氧化鐵納米顆粒聚集體偶聯(lián)單克隆捕獲抗體免疫探針的玻璃纖維膜。2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條，其特征在于，所述試紙條還可以與普魯士藍染液聯(lián)合使用，樣品加入后，將普魯士藍染液加入到質控線C線、檢測線T線上；所述的普魯士藍染液是質量濃度為1-10%的亞鐵氰化鉀水溶液和5-20 %的鹽酸的等體積混合物。3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條，其特征在于，所述超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體為表面帶羧基的氧化鐵納米顆粒聚集體，所述納米顆粒聚集體表面有檸檬酸三鈉。4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條，其特征在于，所述單克隆捕獲抗體為抗hCG單克隆捕獲抗體或心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體;所述單克隆檢測抗體為抗hCG單克隆檢測抗體或心肌肌鈣蛋白I檢測抗體。5.—種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)以氯化高鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉為原料，乙二醇為溶劑，通過溶劑熱法制備表面帶有羧基的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體； (2)將步驟(I)中制備的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體表面羧基用碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺活化，再與單克隆捕獲抗體進行偶聯(lián)，最后加入BSA封閉，磁分離后重懸備用，制得免疫探針； (3)用噴膜劃線設備將步驟(2)中制備的免疫探針固定在結合墊上，并預處理樣品墊； (4)采用噴膜劃線設備將單克隆檢測抗體、羊抗鼠IgG抗體包被在硝酸纖維膜上； (5)在試紙條底板上粘貼硝酸纖維膜，硝酸纖維膜的一端連接吸水紙、另一端連接結合墊，樣品墊搭在結合墊上，兩端交錯。6.根據(jù)權利要求6所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)稱取氯化高鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉溶于乙二醇中，其中氯化高鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉的質量比為0.6?3.0:1?4: 3?9，氯化高鐵與乙二醇的質量體積比為0.6g?3.0g:50mL?lOOmL，將上述溶液倒入聚四氟乙烯內襯的反應釜中，100?250°C條件下，反應8?24h，然后分別用乙醇、純水清洗，并保存在超純水中，按照鐵含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面帶有羧基的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體； (2)取步驟(I)制備的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體加入超純水中，其濃度按鐵含量記為0.I?I Omg/mL ；再加入EDC/NHS，其中Fe: EDC: NHS質量比為1: 0.I?10:0.I?1，混合溶液放入空氣浴恒溫搖床中控制溫度為O?50 °C、轉速為50?220rpm，反應1min?Ih，磁分離，得到活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體;按照單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體質量比0.01?0.500:1，將單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體混合加入偶聯(lián)緩沖液中，并將其置于空氣浴恒溫搖床中控制溫度為O?50°C、轉速為50?220rpm，反應30min?2h后，加入BSA，使混有單克隆捕獲抗體與活化后的超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體的偶聯(lián)緩沖液中BSA質量濃度為0.1?1%，繼續(xù)在空氣浴搖床中反應I?2h，然后磁分離，再用清洗緩沖液清洗三次，重懸液重懸至Fe含量為I?4mg/mL，制得免疫探針； (3)將樣品墊、結合墊浸泡在處理液中，0.5?2min后取出，然后在15?70°C烘箱中干燥待用;將步驟(2)制得的免疫探針以2?lOyL/cm的量，噴灑在結合墊上、干燥，制得固定有探針的結合墊以及經(jīng)過處理的樣品墊； (4)將硝酸纖維膜放置在濕度為25?65%的密閉箱中平衡lh，將單克隆檢測抗體用pH為6.5?7.5的Tris-鹽酸緩沖液稀釋至0.2?2mg/mL，羊抗鼠IgG抗體用緩沖液稀釋至0.1?lmg/mL，將上述兩種抗體在硝酸纖維膜上劃線，劃線量為0.2?2yL/cm，劃線結束后，干燥備用； (5)在帶有粘性的PVC底板中部粘貼步驟(4)制備的硝酸纖維膜，所述硝酸纖維膜一端粘貼吸水紙，二者重疊寬度為0.5?2cm;所述硝酸纖維膜另一端接結合墊，二者相互交錯，重疊寬度為0.5?4cm;樣品墊覆蓋在結合墊上，將底板固定，最后裁切成免疫層析試紙條； 所述方法步驟(2)中，所述偶聯(lián)緩沖液為緩沖基液，所述緩沖基液為濃度為0.002?0.2M、pH=6.0?9.0的碳酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液中的一種;所述清洗緩沖液為緩沖基液中加入占緩沖基液總質量0.05?0.lwt%的吐溫-20;所述重懸液為緩沖液基液中加入占緩沖基液總質量0.05?0.1wt %的吐溫-20、I?5wt%的鹿糖以及0.1?Iwt %的海藻糖。7.根據(jù)權利要求6所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述方法步驟(3)中，所述樣品墊和結合墊為親水或者疏水的玻璃纖維或聚酯纖維;所述處理液為緩沖液與效應物的混合溶液，所述緩沖液為pH=4?9、濃度為0.002?0.2M的碳酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液中的一種，所述效應物為占處理液總質量0.01?Iwt %的分子量為400?20000的PEG、0.01?Iwt %的疊氮鈉、0.05?5wt%的酪蛋白、0.05?5wt%的胎牛血清蛋白、0.01?lwt%*子量為1K?30K的聚乙稀卩比略燒酮、0.01?Iwt%的吐溫-20或Triton X_100、0.01?]^1:%的鹿糖或海藻糖中的其中任意一種或者任意幾種。8.根據(jù)權利要求6所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述方法步驟(4)中，所述硝酸纖維膜為跑水速度為75s、90s、135s或180s的硝酸纖維膜;所述用于稀釋羊抗鼠IgG抗體的緩沖液為pH=4?9、濃度為0.005?0.5M的磷酸鹽緩沖液，pH=6?9、濃度為0.I?3M三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH=6?9、濃度為0.02?2M的硼酸鹽緩沖液中的任意一種。9.根據(jù)權利要求6所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述方法中，將待測樣品加入樣品墊15?20min后，將普魯士藍染液加入到所述質控線C線、檢測線T線上，用儀器讀取結果。10.根據(jù)權利要求6所述的一種基于超順磁氧化鐵納米顆粒聚集體聯(lián)合普魯士藍染色的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述單克隆捕獲抗體為抗hCG單克隆捕獲抗體和心肌肌鈣蛋白I捕獲抗體;所述單克隆檢測抗體為抗hCG單克隆檢測抗體和心肌肌鈣蛋白I檢測抗體。
【文檔編號】G01N33/577GK105866417SQ201610355291
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】張宇, 陳艷華, 婁豆豆, 蔡奕康, 韓國志, 王建國
【申請人】南京東納生物科技有限公司