一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法
【專利摘要】一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，其屬于分析化學(xué)檢測的技術(shù)領(lǐng)域。含親水性氨基酸樣品按一定比例有機(jī)溶劑提取或溶解后，然后采用硅膠表面極性基團(tuán)鍵合相填料制備；通過優(yōu)化制備過程中溶劑用量及淋洗配比等參數(shù)，實現(xiàn)了對樣品中親水性氨基酸的富集制備。制備后的氨基酸樣品能夠在一定的色譜質(zhì)譜條件下，實現(xiàn)一次性同時檢測。該方法具有穩(wěn)定性好、回收率高、操作簡便可控等特點。
【專利說明】
一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，其屬于分析化學(xué)檢測的前處 理技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)百種天然氨基酸，按照側(cè)鏈基團(tuán)的不同可分為親水性氨基酸和疏水 性氨基酸，通常共同存在于各種樣品當(dāng)中。生物體中液體多以水為載體，雞蛋、蜂蜜、血漿、 馬鈴薯等樣品在提取后會含有大量的極性物質(zhì)，其中游離氨基酸含量也多以親水性氨基酸 為主。如20種蛋白質(zhì)氨基酸中，其中12種為親水性氨基酸，其余8種為疏水性氨基酸。人體中 的半必需氨基酸半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸均屬于親水性氨基酸，任何一種 的缺失都會造成人體代謝的紊亂。親水性氨基酸在生物體內(nèi)代謝可發(fā)揮一些特殊的作用， 如谷氨酰胺和天冬酰胺是兩個影響動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程效率的關(guān)鍵營養(yǎng)物，對細(xì)胞生 長、抗體表達(dá)和氨的生成有顯著影響。在常規(guī)以液相反相色譜分離為主檢測當(dāng)中，極性物質(zhì) 和親水性氨基酸往往同時在保留時間一起出峰，給后續(xù)親水性氨基酸的檢測造成很大的麻 煩。鑒于當(dāng)前有關(guān)親水性氨基酸的制備方法及標(biāo)準(zhǔn)較少，造成目前多見于各種樣品中氨基 酸的提取制備存在著親水性氨基酸回收率低，親水性氨基酸檢測數(shù)目較少等現(xiàn)象，迫切需 要一種制備方法用于親水性氨基酸的分離分析檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明涉及一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，原理是依靠硅膠表面極性基 團(tuán)鍵合相填料表面對樣品中親水性氨基酸的強(qiáng)烈吸附作用。樣品中的親水性氨基酸在填料 上先被保留下來，通過優(yōu)化富集制備過程中溶劑含量及淋洗配比等參數(shù)，除去一些生物基 質(zhì)，之后采用特定配比的洗脫液將親水性氨基酸選擇性的洗脫出來，實現(xiàn)樣品中親水性氨 基酸的富集制備。
[0004] -種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，包括以下步驟： (1) 樣品提取 將樣品置于離心管底部，加入提取液渦旋提取;渦旋混合30秒后，再超聲3min，15000g/ min離心5min后取全部上清液備用； 所述提取液為有機(jī)溶劑與l〇〇mM緩沖鹽溶液按體積比70-90:10-30混合的混合溶液； (2) 裝填固相萃取柱 裝填規(guī)格為30-100mg/lmL或者100-500mg/5mL的固相萃取柱;填料為硅膠表面極性基 團(tuán)鍵合相填料，所述極性基團(tuán)為羥基、羧基、氨基、酰氨基、氰基中的一種或多種;鍵合相填 料的粒徑為5-100 um，孔徑60-300 nm，比表面積50-800 m2/g; (3) 富集未水性氣基酸樣品 先采用體積比有機(jī)溶劑：l〇〇mM緩沖鹽溶液:水=10: 25:65的第一混合液對固相萃取柱 進(jìn)行活化;再加入體積比有機(jī)溶劑：l〇〇mM緩沖鹽溶液:水=90: 5: 5的第二混合液進(jìn)行平 衡;將全部上清液樣品上樣后，加入第二混合液進(jìn)行淋洗;最后用體積比有機(jī)溶劑：lOOmM緩 沖鹽溶液:水:酸=70: 5: 24:1的第三混合液進(jìn)行洗脫，并收集全部的洗脫餾分，并將餾分濃 縮至干后重溶于100uL 0.1moL/L的鹽酸中； 所述提取液、第一混合液、第二混合液、第三混合液中有機(jī)溶劑及緩沖鹽溶液是相對應(yīng) 的，所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一種或多種，所述緩沖鹽溶液為甲酸銨和/ 或乙酸銨的甲酸和/或乙酸溶液，緩沖鹽溶液的pH為1 -4。
[0005] 所述水性氨基酸為L-脯氨酸、4-羥基-L-脯氨酸、L-0-磷酸絲氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-瓜氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-蘇氨酸-3-磷酸、L-天 冬氨酸、L-天冬酰胺、L-組氨酸、S-磺基-L-半胱氨酸、半胱亞磺酸、肌肽、甘氨酸、谷胱甘肽、 ?；撬?、亞磺酸中一種或多種。
[0006] 所述上清液中樣品質(zhì)量占固相萃取柱中填料質(zhì)量的0.5%-10%。
[0007] 富集制備采用的過程方法，具體步驟如下： 1) 配置樣品提取試劑。提取液為有機(jī)溶劑:100mM緩沖鹽溶液，其中有機(jī)溶劑和鹽兩者 體積比介于70:30-90:10之間。有機(jī)溶劑為甲醇，乙醇，乙腈，丙酮中的任意一種或多種組 合;所采用的緩沖液為甲酸銨或乙酸銨中的一種或兩者組合，調(diào)劑緩沖鹽用的酸為甲酸或 乙酸中的一種或兩者組合;PH介于1-4之間； 2) 樣品提取。
[0008] A，液體樣品處理:移取100uL樣品到1.5mLEP管底部，加入900uL提取液渦旋提取。 禍旋混合30秒后，再超聲3min，15000g/min離心5min后取全部上清液備用； B，固體樣品處理:稱取lg樣品于1.5mLEP管底部，加入lmL提取液渦旋提取。渦旋混合30 秒后，再超聲3min，15000g/min離心5min后取全部上清液備用； 3) 裝填固相萃取柱。裝填規(guī)格為30-100mg/lmL或者100-500mg/5mL，優(yōu)選100mg/lmL;填 料為硅膠表面極性基團(tuán)鍵合相填料，基團(tuán)包括:羥基，羧基，氨基，酰氨基，氰基等中的一種 或多種;鍵合相填料粒徑為5~100 um，孔徑60~300 nm，比表面積50~800 m2/g; 4) 樣品處理。采用填料處理過程分為活化、平衡、上樣、淋洗和洗脫。先采用3mL有機(jī)溶 劑：100mM緩沖鹽溶液:水（10:25:65，v/v/v)進(jìn)行活化;再加入3mL有機(jī)溶劑：100mM緩沖鹽溶 液:水(90: 5: 5,v/v/v)平衡;將全部上清液樣品上樣后，加入lmL有機(jī)溶劑：100mM緩沖鹽 溶液:水(90: 5: 5，v/v/v)進(jìn)行淋洗;最后用lmL有機(jī)溶劑：100mM緩沖鹽溶液:水:酸(70:5: 24:1，v/v/v)進(jìn)行洗脫，并收集全部的洗脫餾分，并將餾分濃縮至干后重溶于100uL 0.1m 〇L/L的鹽酸中。整個過程中，平衡、活化、上樣、淋洗、洗脫所使用的有機(jī)溶劑、緩沖鹽溶 液和酸需一一對應(yīng)。
[0009] 本發(fā)明具有的有益效果是：高選擇性-針對當(dāng)前親水性氨基酸樣品在前處理過程 中的富集制備方法，本發(fā)明提出使用極性基團(tuán)鍵合相填料，選擇性的制備樣品中親水性氨 基酸，有效解決樣品中親水性氨基酸檢測前處理存在其它物質(zhì)干擾的問題。方法簡單，所采 用的固體吸附劑易于制成96孔SPE板，實現(xiàn)批量化。重復(fù)性好，操作簡單可控，易實現(xiàn)自動 化，過程穩(wěn)定。凈化后的氨基酸樣品衍生化后用串聯(lián)質(zhì)譜檢測，能同時檢測各種樣品中親水 性的氨基酸。
【附圖說明】
[0010] 圖1是實施例中方法的操作流程圖。
[0011] 圖2是實施例中隨機(jī)樣品中20種親水性氨基酸超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測總離子流 圖。
【具體實施方式】
[0012] 現(xiàn)結(jié)合實例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限 定。實例所用到血漿樣品均由遼寧錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，其它樣品購買于市場。 在實施方式中，以下實施例中所有凈化的樣品取10uL樣品用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰 亞氨基甲酸酯衍生后，用液質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測。其中液相色譜流動相條件包括A和B:A 為含20 mM甲酸銨、0.5%甲酸、1%乙腈的水溶液，流動相B為含1.6%甲酸的乙腈溶液。流速為 0.45mL/min，柱溫45°C，色譜柱:Xselect HSS T3 2.1X100 mm 2.5um粒徑色譜柱。梯度條 件如下：
質(zhì)譜條件為正離子模式下采用多反應(yīng)監(jiān)測檢測，參數(shù)為離子源溫度150°C，毛細(xì)管電壓 3. Okv，源溫度150°C，去溶劑溫度500°C，去溶劑氣流量800L/h，錐孔氣流量150L/h。
[0013] 建立親水性氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線： 選取常見的20種親水性氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品情況見下表：
氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、MRM條件及相關(guān)參數(shù)如下表：
根據(jù)液相色譜和質(zhì)譜條件對親水氨基酸進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。并根據(jù)保留時間以及質(zhì)譜 離子對區(qū)別鑒定所有的氨基酸。本實施例中配置20個氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度如下:0.0001ug/ mL, 0.0005ug/mL, 0.001ug/mL, 0.005ug/mL, O.Olug/mL, 0.05 ug/mL, O.lug/mL, 0.5ug/mL。以檢測限10倍含量配置標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)，進(jìn)行方法回收率考察，平行測定3次。標(biāo)準(zhǔn)品 氨基酸經(jīng)衍生后，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測數(shù)據(jù)處理，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰面積(y)與濃度(x)之間 的回歸方程及方法檢測限如下表：
根據(jù)色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)處理，根據(jù)外標(biāo)法計算實例中每種氨基酸的濃度， 實現(xiàn)樣品中親水氨基酸的檢測。
[0014] 實施例1 蜂蜜樣品檢測。稱取lg蜂蜜于1.5mL EP管中，再加入300yL NH4FA(100mM，PH=3.2)渦旋 混合，然后加入700此甲醇，禍旋混合30秒，超聲3min，15000g/min離心3min后取全部上清 液備用； 硅膠表面氨基基團(tuán)鍵合相填料500mg裝填與5mL固相小柱中，加入3mL Me0H:NH4FA:H20 (10:25:65，v/v/v)活化后，再加入3mL MeOH:NH4FA:H20(90:5:5，v/v/v)進(jìn)行平衡，然后將上 樣溶液全部上樣后，加入lmL MeOH: NH4FA: H20(90: 5: 5，v/v/v)淋洗。最后加入lmL MeOH: NH4FA: H20: FA( 70:5:24:1，v/v/v)洗脫，并收集所有的洗脫餾分。洗脫餾分濃縮至干后重溶 于100uL 0. lm〇L/L的鹽酸中，衍生經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測，可對蜂蜜中親水性氨基酸進(jìn)行檢測。
[0015] 實施例2 血漿樣品檢測。取500uL待測血漿，5000g離心后，取上層100uL血漿于1.5mL EP管中，再 加入100yL NH4FA(100mM，PH=3.2)渦旋混合，然后加入900yL ACN沉淀蛋白質(zhì)，渦旋混合30 秒，超聲3min，15000g/min離心3min后取全部上清液備用； 硅膠表面羥基基團(tuán)鍵合相填料l〇〇mg裝填與lmL固相小柱中，加入3mL ACN:NH4FA:H20 (10:25:65，v/v/v)活化后，再加入3mL ACN:NH4FA:H20(90:5:5，v/v/v)進(jìn)行平衡，然后將上 樣溶液全部上樣后，加入lmL ACN:NH4FA:H20(90:5:5，v/v/v)淋洗。最后加入lmL ACN:NH4FA :H20:FA(70: 5: 24:1，v/v/v)洗脫，并收集所有的洗脫餾分。洗脫餾分濃縮至干后重溶于 100uL 0.1 moL/L的鹽酸中，衍生經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測，可對血漿中親水性氨基酸進(jìn)行檢測。
[0016] 實施例3 細(xì)胞組織樣品檢測。稱取0.05g粉碎后的組織于1.5mL EP管中，再加入100此NH4FA (10011^，？11=3.2)渦旋混合，然后加入900此甲醇，渦旋混合30秒，超聲3111111，1500(^/111111離 心3min后取全部上清液備用； 硅膠表面酰氨基團(tuán)鍵合相填料l〇〇mg裝填與lmL固相小柱中，加入3mL Me0H:NH4FA:H20 (10:25:65，v/v/v)活化后，再加入3mL MeOH:NH4FA:H20(90:5:5，v/v/v)進(jìn)行平衡，然后將上 樣溶液全部上樣后，加入lmL MeOH: NH4FA: H20(90: 5: 5，v/v/v)淋洗。最后加入lmL MeOH: NH4FA: H20: FA( 70:5:24:1，v/v/v)洗脫，并收集所有的洗脫餾分。洗脫餾分濃縮至干后重溶 于100uL 0. lm〇L/L的鹽酸中，衍生經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測，可對細(xì)胞組織中親水性氨基酸進(jìn)行檢 測。
[0017] 實施例4 雞蛋樣品檢測。生雞蛋除去蛋殼，充分均勻后，稱取lg樣品于1.5mL EP管中，再加入200 yL NH4FA( 100mM，PH=3.2)渦旋混合，然后加入800yL乙醇，渦旋混合30秒，超聲3min， 15000g/min離心3min后取全部上清液備用； 硅膠表面羧基基團(tuán)鍵合相填料500mg裝填與5mL固相小柱中，加入5mL乙醇:NH4FA:H20 (10:25:65，v/v/v)活化后，再加入5mL乙醇:NH4FA:H20(90:5:5，v/v/v)進(jìn)行平衡，然后將上 樣溶液全部上樣后，加入31^乙醇：順4?六:11 20(90:5:5，￥八八）淋洗。最后加入211^乙醇： NH4FA: H20: FA( 70:5:24:1，v/v/v)洗脫，并收集所有的洗脫餾分。洗脫餾分濃縮至干后重溶 于100uL 0. lm〇L/L的鹽酸中，衍生經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測，可對雞蛋中親水性氨基酸進(jìn)行檢測。
[0018] 實施例5 血清樣品檢測。取500uL待測血漿，5000g離心后，取上層100uL血漿于1.5mL EP管中，再 加入100yL NH4FA( 100mM，PH=3.2)渦旋混合，然后加入900yL丙酮沉淀蛋白質(zhì)，渦旋混合30 秒，超聲3min，15000g/min離心3min后取全部上清液備用； 硅膠表面氰基基團(tuán)鍵合相填料l〇〇mg裝填與lmL固相小柱中，加入3mL丙酮:NH4FA:H20 (10:25:65，v/v/v)活化后，再加入3mL丙酮:NH4FA:H20(90:5:5，v/v/v)進(jìn)行平衡，然后將上 樣溶液全部上樣后，加入lmL丙酮:NH4FA:H 20(90:5:5，V/v/v)淋洗。最后加入lmL丙酮： NH4FA: H20: FA( 70:5:24:1，v/v/v)洗脫，并收集所有的洗脫餾分。洗脫餾分濃縮至干后重溶 于100uL 0. lm〇L/L的鹽酸中，衍生經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測，可對血清中親水性氨基酸進(jìn)行檢測。
[0019] 實施例6 果汁樣品檢測。取500uL果汁，5000g離心后，取上層100uL于1.5mL EP管中，再加入100y L乙酸銨（100mM，PH=3.2)渦旋混合，然后加入900yL ACN沉淀蛋白質(zhì)，渦旋混合30秒，超聲 3min，15000g/min離心3min后取全部上清液備用； 硅膠表面羥基基團(tuán)鍵合相填料l〇〇mg裝填與lmL固相小柱中，加入3mL ACN:乙酸銨:H20 (10:25:65，v/v/v)活化后，再加入3mL ACN:乙酸銨：H20(90:5:5，v/v/v)進(jìn)行平衡，然后將 上樣溶液全部上樣后，加入lmL ACN:乙酸銨:H20(90:5: 5，v/v/v)淋洗。最后加入lmL ACN: NH4FA: H20: FA( 70:5:24:1，v/v/v)洗脫，并收集所有的洗脫餾分。洗脫餾分濃縮至干后重溶 于100uL 0. lm〇L/L的鹽酸中，衍生經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測，可對果汁中親水性氨基酸進(jìn)行檢測。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品提取 將樣品置于離心管底部，加入提取液渦旋提取;渦旋混合30秒后，再超聲3min，15000g/ min離心5min后取全部上清液備用； 所述提取液為有機(jī)溶劑與IOOmM緩沖鹽溶液按體積比70-90:10-30混合的混合溶液； (2) 裝填固相萃取柱 裝填規(guī)格為30-100mg/lmL或者100-500mg/5mL的固相萃取柱;填料為硅膠表面極性基 團(tuán)鍵合相填料，所述極性基團(tuán)為羥基、羧基、氨基、酰氨基、氰基中的一種或多種;鍵合相填 料的粒徑為5-100 um，孔徑60-300 nm，比表面積50-800 m2/g; (3) 富集未水性氣基酸樣品 先采用體積比有機(jī)溶劑：IOOmM緩沖鹽溶液:水=10 : 25:65的第一混合液對固相萃取柱 進(jìn)行活化;再加入體積比有機(jī)溶劑：l〇〇mM緩沖鹽溶液:水=90: 5: 5的第二混合液進(jìn)行平 衡;將全部上清液樣品上樣后，加入第二混合液進(jìn)行淋洗;最后用體積比有機(jī)溶劑：IOOmM緩 沖鹽溶液:水:酸=70: 5: 24:1的第三混合液進(jìn)行洗脫，并收集全部的洗脫餾分，并將餾分濃 縮至干后重溶于IOOuL 0.1moL/L的鹽酸中； 所述提取液、第一混合液、第二混合液、第三混合液中有機(jī)溶劑及緩沖鹽溶液是相對應(yīng) 的，所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一種或多種，所述緩沖鹽溶液為甲酸銨和/ 或乙酸銨的甲酸和/或乙酸溶液，緩沖鹽溶液的pH為1 -4。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，其特征在于:所述親 水性氨基酸為L-脯氨酸、4-羥基-L-脯氨酸、L-O-磷酸絲氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-瓜氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-蘇氨酸-3-磷酸、L-天冬氨酸、L-天 冬酰胺、L-組氨酸、S-磺基-L-半胱氨酸、半胱亞磺酸、肌肽、甘氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、亞磺 酸中一種或多種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，其特征在于:所述固 相萃取柱的規(guī)格為100mg/lmL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，其特征在于:所述上 清液中樣品質(zhì)量占固相萃取柱中填料質(zhì)量的〇. 5%-10%。
【文檔編號】G01N30/08GK105891387SQ201610320756
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】董軍, 曹云峰, 郭志謀, 葛廣波, 高鵬, 梁鑫淼, 房中則, 孫曉宇, 洪沫, 范旭冉
【申請人】遼寧潤生康泰生物醫(yī)藥科技有限公司