一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條及其制備方法，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC底板，特點是在PVC底板上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，該結(jié)合墊上包被有所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體一膠體金標記物，該硝酸纖維素膜上分別包被有弗氏檸檬酸桿菌超聲波破碎液構(gòu)成的檢測線和兔抗雞卵黃抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測快速、準確性高。
【專利說明】
一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫化學檢測技術(shù)，尤其是涉及一種基于卵黃抗體的膠體金免疫層析 技術(shù)用以快速檢測環(huán)境、食品、人和動物各種組織，血液及糞便樣品中弗氏檸檬酸桿菌的檢 測試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 弗氏朽1檬酸桿菌（Citrobacter freundii)是一種革蘭氏陰性短桿菌，為需氧或兼 性厭氧菌，是沙門氏菌族中朽1檬酸桿菌屬的代表菌。梓檬酸桿菌屬包括3個種及1個生物 群--弗氏檸檬酸桿菌，無丙二酸鹽檸檬酸桿菌，差異檸檬酸桿菌和無丙二酸鹽檸檬酸桿 菌生物群1，分為11個基因種。弗氏梓檬酸桿菌為該屬中的模式菌種，是一種條件致病菌， 廣泛分布于自然界中，為人和動物腸道的正常菌群，和大腸菌群一樣，可視作糞便污染的衛(wèi) 生學指標。在一定的條件下，弗氏檸檬酸桿菌是一種"人-獸_魚"共患病病原菌，當機體 抵抗力下降時，可引起腹瀉、尿路感染、創(chuàng)面感染、關(guān)節(jié)炎和敗血癥等。弗氏檸檬酸桿菌也可 存在于食物中導(dǎo)致食物中毒。目前，國內(nèi)也陸續(xù)報道了一些由弗氏檸檬酸桿菌引起的畜類 及養(yǎng)殖魚類的疾病，孫洋等報道了該菌可導(dǎo)致東北虎出血性腹瀉病；在水產(chǎn)動物方面，李華 等報道了該菌可導(dǎo)致河蟹的肝胰腺、鰓、肌肉輕度水腫，最終引起敗血癥而死亡；陳翠珍等 從中華絨螯蟹分離到該菌，證明了該菌對中華絨螯蟹的致病性；沈錦玉等從紅螯螯蝦中分 離到該菌，病蝦的尾部呈肉質(zhì)樣腫脹、爛尾等癥狀；胡廣洲等從患暴發(fā)性敗血癥中華鱉體內(nèi) 分離到該菌；梁利國等報道了該菌可導(dǎo)致三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉組織水腫，并有大量渾濁 的積液，嚴重者肌肉糜爛并伴有腐臭的氣味，最終死亡；陸愛君等從草魚腸道分離到該菌， 并證明其對小鼠和斑馬魚均具有致病性。高正勇等從大鯛中分離到弗氏檸檬酸桿菌，患病 大鯛頭部腫大，腹部腫大輕度腹水，皮下有出血點等癥狀，人工感染試驗證明其對大鯛和鯽 魚都有致病性。每年由于弗氏檸檬酸桿菌引起的水產(chǎn)類疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失，因 此，若能確定病因，及時對癥下藥，勢必能給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)減少損失。同時，弗氏檸檬酸桿菌的快 速檢測在醫(yī)學方面也具有重要意義，能為預(yù)防和臨床治療急性腹瀉提供參考依據(jù)。
[0003] 目前，病原體的檢測方法主要有分離培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR、ELISA、色譜分析等，這 些方法多耗時耗力，需要專用場地和儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作。對于弗氏檸檬酸桿菌 感染，根據(jù)微生物檢測標準需先對其進行增菌實驗，挑選特定菌株用全自動微生物分析儀 分析鑒定，整個過程操作繁瑣，而且需要專業(yè)人員在無菌條件下進行，結(jié)果也需數(shù)天才能獲 得，不利于對病源的確定及病情的及時控制。
[0004] 膠體金免疫層析試驗（gold-immunochromatography assay GICA)是 20 世紀 80 年代開始發(fā)展起來的新的免疫分析方式，是應(yīng)用膠體金標記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，基 于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標記技術(shù)，它具有簡便，快速，特異性強，靈敏度高，費用低 等優(yōu)點。依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，在國內(nèi)外無論人醫(yī)應(yīng)用方面，還是獸醫(yī)應(yīng)用方面，都已 經(jīng)研制出了多種膠體金免疫層析快速檢測各種病原和有毒有害物質(zhì)的試紙條。但是，目前 國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條及其制備方法的相關(guān)研究報道。
[0005] 雞卵黃抗體即卵黃中的免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk, IgY)，是針對特定 抗原的，具有持續(xù)效價的高親和力抗體。用雞做宿主來產(chǎn)生抗特定抗原的IgY，飼養(yǎng)簡單，無 需采血，只需使用少量抗原即可產(chǎn)生大量抗體，從卵黃中提取的IgY純度高、含量大。在疾 病的檢測、診斷方面，IgY因免疫學特性獨特，動物種系發(fā)生學距離遠，其特異性和針對性較 哺乳動物抗體更強，應(yīng)用于免疫診斷中，可減少假陽性的出現(xiàn)，從而提高檢測的特異性，是 近年來新興的研究領(lǐng)域。但是，目前國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌IgY的報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的特異性強、靈 敏度高、檢測速度快、成本低并且操作簡便的弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條及其制備方法，滿 足了現(xiàn)場快速檢測的需求。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙 條，所述的試紙條由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及 吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物，所述的硝酸 纖維素膜上分別設(shè)置有弗氏檸檬酸桿菌超聲波破碎液包被的檢測線和由兔抗雞卵黃抗體 (IgY)包被的質(zhì)控線。
[0008] 所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：將抗弗氏 檸檬酸桿菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-40nm的膠體金溶液按5-7 i! g : lmL混合，在 PH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST緩 沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠體金顆粒及 其凝聚物，再高速離心12000_15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗 體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物。
[0009] 一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴樣品墊的制備
[0011] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 溫-20的0. 01M pH 7. 2的PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真 空封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0012] (2)特定包被的結(jié)合墊的制備
[0013] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 溫-20的0. 01M pH 7. 2的PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纖維紙上均勻噴涂10-20 ii L的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物，真空冷凍干 燥1-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0014] (3)特定包被的硝酸纖維素膜的制備
[0015] 將弗氏檸檬酸桿菌超聲波破碎液用點膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測線， 將兔抗雞卵黃抗體用點膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線，即得到特定包被的硝酸 纖維膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆?；其中檢測線與質(zhì)控線相互平行，所 述的檢測線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊端；
[0016] (4)試紙條的制備
[0017] 將步驟⑴得到的樣品墊、步驟⑵得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特 定包被的硝酸纖維膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6_寬的細條，即得弗氏 檸檬酸桿菌檢測試紙條，真空封裝，4°C保存。
[0018] 所述的弗氏檸檬酸桿菌抗原的制備方法如下：取實驗室-80°C保存的弗氏檸檬酸 桿菌菌種，在瓊脂培養(yǎng)基中劃線活化，30°C倒置培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于含5mL牛肉膏 蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，30°C，200rpm培養(yǎng)12-18h，將培養(yǎng)的菌液用牛肉膏蛋白胨液 體培養(yǎng)基按1 : 100稀釋到三角燒瓶中，30°C，200rpm擴大培養(yǎng)，每隔一段時間測其0D600 值，當其0D600值達到0. 4-0. 6時停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液在4°C進行5000rpm離心10min， 棄上清，下層沉淀用pH 7. 2的0. 01M PBS重懸洗滌，再次5000rpm離心10min，沉淀用PBS 重復(fù)上述洗滌2次，最終得到的沉淀即為弗氏檸檬酸桿菌抗原。
[0019] 所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：
[0020] (1)抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的制備
[0021] 將上述弗氏檸檬酸桿菌抗原與無菌生理鹽水混合得到弗氏檸檬酸桿菌懸液，加入 甲醛使甲醛體積終濃度達〇. 5%，然后37°C恒溫水浴滅活24h，即得到滅活的弗氏檸檬酸桿 菌抗原；取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對象，將滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗原用生理鹽水 稀釋后和弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉 注射進行基礎(chǔ)免疫，每只母雞免疫劑量為4X 109CFU，15-20天后，將滅活的弗氏檸檬酸桿菌 抗原和弗氏不完全佐劑進行等體積混合，充分乳化后對母雞肌肉注射進行加強免疫，每只 母雞免疫劑量為2X10 9CFU，加強免疫重復(fù)進行三次，每次間隔時間為7-10天，然后收集雞 蛋測定效價，當卵黃抗體效價> 1 : 20000時收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純 化卵黃抗體；
[0022] (2)膠體金標記抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體
[0023] 將抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20_40nm的膠體金溶液 5_7ii g :lmL混合，在pH 5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛 血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分 穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000_15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗弗氏 檸檬酸桿菌卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體 金標記物，用含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%疊氮化鈉的pH 7. 2的0. 01M PBS重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
[0024] 用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：稱取適量步驟（1)分離得到 的卵黃，按質(zhì)量比1 : 9加入口115.0的0.0511的乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后41：靜置 過夜，8000g離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，lOOOOg離 心20min，沉淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40 %，4°C 攪拌過夜，l〇〇〇〇g離心20min，沉淀用少量pH 7. 2的0. 01M的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩 沖液中透析即得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體。
[0025] 步驟（2)中膠體金制備方法如下：將100mL 0.0 lwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸后， 邊攪拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變紅色，至 顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補足失水至100mL，無菌密封，4°C避光保存。
[0026] 所述的檢測線距離所述的結(jié)合墊6-8mm ;所述的質(zhì)控線距離所述的吸水墊6-8mm， 所述的檢測線和所述的質(zhì)控線的寬度分別為0. 8-lmm，兩條線相距為5mm。
[0027] 所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏3_5g、蛋白胨15g、NaCl 5g， 補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0028] 所述的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏3_5g、蛋白胨15g、NaCl 5g、 瓊脂20g，補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0029] 所述的 PBST 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP04. 12H20 2.9g、 KH2P040 . 2g，500 i! L吐溫-20,補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0030] 所述的 PBS 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP04. 12H20 2.9g、 KH2P040 . 2g，補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 2,高壓滅菌；
[0031] 所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸1. 095g，補足雙蒸水 至1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0032] 所述的弗氏朽1檬酸桿菌超聲波破碎液的包被量為1-2 ii L/cm ;所述的兔抗雞卵黃 抗體的包被量為1-2 U L/cm，所述的弗氏朽1檬酸桿菌超聲波破碎液是將所述的弗氏朽1檬酸 桿菌抗原用PBS重懸，經(jīng)超聲波破碎后4000rpm離心5min所得的上清液。
[0033] 本發(fā)明選用弗氏檸檬酸桿菌超聲波菌液作為檢測線，抗弗氏檸檬酸桿菌特異性卵 黃抗體作為膠體金標記的抗體，利用競爭法來檢測待測樣品中是否含有弗氏檸檬酸桿菌。 通過待檢樣品中的弗氏檸檬酸桿菌與包被于硝酸纖維膜上的弗氏檸檬酸桿菌抗原共同競 爭結(jié)合抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體_膠體金標記物。若待檢樣品中弗氏檸檬酸桿菌的量高 于試紙條的檢測限，抗弗氏朽 1檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物與樣品中弗氏梓檬酸桿菌 全部結(jié)合，從而不與固定在硝酸纖維膜上的菌液結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶而顯陽性；若待檢 樣品中不含弗氏檸檬酸桿菌或其量低于試紙條的檢測限，抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠 體金標記物不能與樣品中弗氏檸檬酸桿菌全部結(jié)合，這樣金標抗體在層析過程中會被固定 在硝酸纖維素膜上的菌液結(jié)合而出現(xiàn)紅色條帶而顯陰性。因此，若待測樣品試紙條的檢測 線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陰性樣品；若待測樣品試紙條檢測線不出現(xiàn)紅色 條帶，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣品；若質(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該 試紙條無效。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于
[0035] 1、檢測快速：整個檢測過程只需5-10分鐘，能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要。
[0036] 2、檢測準確率高、特異性強：本反應(yīng)與其他細菌沒有交叉反應(yīng)，檢測準確性能達到 95%以上，與操作復(fù)雜的ELISA水平基本相同。
[0037] 3、攜帶方便，操作簡便：本發(fā)明改變了對弗氏檸檬酸桿菌的檢測必須由專業(yè)人員 才能進行檢測的局限性，使各個養(yǎng)殖場及醫(yī)院均可即時、即地進行檢測。
[0038] 4、本發(fā)明的檢測試紙條制備工藝簡單，成本低廉，不需要任何特殊儀器、設(shè)備。
[0039] 5、本發(fā)明的檢測試紙條儲存方便，對溫度要求不高，在4°C可有效保存半年以上。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為硝酸纖維素 膜，4為吸收墊，5為檢測線，6為質(zhì)控線，7為PVC底板；
[0041] 圖2為本發(fā)明試紙條的制備工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0042] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0043] 具體實施例1
[0044] 一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條，如圖1所示，該試紙條由PVC底板7和在PVC底 板7上依次搭接的樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3及吸水墊4 ;結(jié)合墊2上包被有抗弗 氏朽1檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物，硝酸纖維素膜3上分別設(shè)置有由弗氏梓檬酸桿菌 超聲波破碎液包被的檢測線5和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線6。
[0045] 上述抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：將抗弗氏檸 檬酸桿菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-40nm的膠體金溶液按5-7 ii g : lmL混合，在pH 5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST緩沖 液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠體金顆粒及其 凝聚物，再高速離心12000_15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體， 取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物。
[0046] 具體實施例2
[0047] 快速檢測弗氏檸檬酸桿菌膠體金試紙條的制備方法，如圖2所示，其具體操作步 驟如下：
[0048] (1)弗氏檸檬酸桿菌的制備
[0049] 所述的弗氏檸檬酸桿菌抗原的制備方法如下：取實驗室-80°C保存的弗氏檸檬酸 桿菌菌種，在瓊脂培養(yǎng)基中劃線活化，30°C倒置培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種子含5mL牛肉膏 蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，30°C，200rpm培養(yǎng)12-18h，將培養(yǎng)的菌液用牛肉膏蛋白胨液 體培養(yǎng)基按1 : 100稀釋到三角燒瓶中，30°C，200rpm擴大培養(yǎng)，每隔一段時間測其0D600 值，當其0D600值達到0. 4-0. 6時停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液在4°C進行5000rpm離心10min， 棄上清，下層沉淀用pH 7. 2的0. 01M PBS重懸洗滌，再次5000rpm離心10min，沉淀再次用 PBS重復(fù)上述洗滌2次，最終得到的沉淀即為弗氏檸檬酸桿菌抗原。
[0050] (2)抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的制備
[0051] 將上述弗氏檸檬酸桿菌抗原與無菌生理鹽水混合得到弗氏檸檬酸桿菌懸液，加入 甲醛使甲醛體積終濃度達〇. 5%，然后37°C恒溫水浴滅活24h，即得到滅活的弗氏檸檬酸桿 菌抗原；取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對象，將滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗原用生理鹽水 稀釋后和弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉 注射進行基礎(chǔ)免疫，每只母雞免疫劑量為4X 109CFU，15-20天后，將滅活的弗氏檸檬酸桿菌 抗原和弗氏不完全佐劑進行等體積混合，充分乳化后對母雞肌肉注射進行加強免疫，每只 母雞免疫劑量為2X 109CFU，加強免疫重復(fù)進行三次，每次間隔時間為7-10天，進行三次免 疫后收集雞蛋測定效價，當卵黃抗體效價> 1 : 20000時收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸 銨沉淀法純化卵黃抗體。卵黃抗體的純化的具體方法如下：稱取適量卵黃，按質(zhì)量比1 : 9 加入pH 5. 0的0? 05M乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過夜，8000g離心20min， 取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40 %，4°C攪拌6h，lOOOOg離心20min，沉淀用10-20 倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪拌過夜，10000g離心 20min，取沉淀用少量pH 7. 2的0. 01M PBS溶液重懸，在PBS溶液中透析即得到抗弗氏檸檬 酸桿菌卵黃抗體；
[0052] (3)膠體金標記抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的方法
[0053] 用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金。用新制的去離子水配制100mL 0.0 lwt% 的氯金酸溶液，加熱煮沸后，邊攪拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉溶液后迅速搖勻，繼 續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變紅色，至顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補足失水至 100mL，無菌密封，4°C避光保存；
[0054] 將抗弗氏朽1檬酸桿菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20_40nm的膠體金溶液按 5-7 ii g :lmL混合，在pH 5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的 牛血清蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充 分穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000_15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的卵 黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體_膠體金標記物，用 含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0? 02wt%疊氮化鈉的pH 7. 2的0? 01M PBS重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
[0055] (4)結(jié)合墊的包被
[0056] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 溫-20的pH 7. 2的0. 01M PBS緩沖液中30min后，37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻璃 纖維紙上均勻噴涂10-20 ii L抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物，真空冷凍干燥 1-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0057] (5)樣品墊的處理
[0058] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 溫-20的pH 7. 2的0. 01M PBS緩沖液中30min后取出，37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真空 封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0059] (6)硝酸纖維膜的包被
[0060] 將弗氏檸檬酸桿菌抗原用點膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測線，包被量為 1-2 y L/cm ;將兔抗雞卵黃抗體用點膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線，包被量為 1-2 y L/cm，即得到特定包被的硝酸纖維素膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)?用；其中檢測線與質(zhì)控線相互平行，所述的檢測線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊 端；所述的弗氏檸檬酸桿菌超聲波破碎液是將所述的弗氏檸檬酸桿菌抗原用PBS重懸，經(jīng) 超聲波破碎后4000rpm離心5min所得的上清液。
[0061] (7)試紙條組裝
[0062] 將樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、硝酸纖維膜（3)、吸水墊⑷按圖2所示的順序依次粘 附在PVC底板（7)上，PVC底板作為支撐載體，由下及上是由玻璃纖維紙組成的樣品吸收 區(qū)，然后是吸附了膠體金所標記的卵黃抗體的玻璃纖維層，其次是硝酸纖維素膜，最上一層 是吸水層，由濾紙組成，外面用膠帶封住，成為手持部分。各層之間均有1. 5_左右的重疊 交叉。將試紙條切成4-6_寬的小條，真空封裝，4°C保存。
[0063] 其中步驟（1)中采用的所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏 3-58、蛋白胨15 8、似(：158，補足雙蒸水至11，調(diào)節(jié)口11至7.4，高壓滅菌；所述的牛肉膏蛋白 胨固體培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏3-5g、蛋白胨15g、NaCl 5g、瓊脂20g，補足雙蒸水至1L， 調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0064] 步驟（2)中的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸1. 095g，補足 雙蒸水至1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0065] 步驟（3)中采用的PBST緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KC1 0. 2g、 Na2HP04 ? 12H202. 9g、KH2P040 . 2g，500 ii L 吐溫-20,補足雙蒸水至 1L，調(diào)節(jié) pH 至 7. 4,高壓滅 菌。
[0066] 步驟（1) (2) (3) (4)、（5)中采用 PBS 緩沖液配制方法是：NaCl 8g、KC1 0. 2g、 Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P040 . 2g補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 2,高壓滅菌。
[0067] 具體實施例3
[0068] 膠體金試紙條對臨床樣品的檢測，具體步驟如下：
[0069] 從當?shù)爻匈徺I中華絨螯蟹、梭子蟹、蝦、草魚、鯽魚等各種魚類樣品以及本地各 池塘水樣，解剖取其腸，鰓和肝等樣品共41份，將PBS緩沖液滴加于組織樣品上，破碎組織， 2000-3000rpm離心5min后取上清液，將檢測試紙條插入待檢樣品中，10分鐘后觀察結(jié)果： 若只在檢測試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅線者為陽性結(jié)果，即樣品中帶有弗氏檸檬酸桿菌； 若試紙條的檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅線者為陰性結(jié)果，即樣品中不含有弗氏檸檬酸桿 菌。每個樣品做5次重復(fù)，所有臨床樣品檢測結(jié)果用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)進行比較。
[0070] 檢測結(jié)果見表1，我們可以看到在收集的41份樣品中，只有1份草魚樣品和1份 鯽魚樣品在試紙條檢測結(jié)果中呈陽性，對于其余各種魚類樣品均為陰性結(jié)果。所有樣品 ELISA檢測結(jié)果均為陰性，檢測樣品只有2份樣品檢測結(jié)果與ELISA結(jié)果發(fā)生沖突，其余 均與ELISA結(jié)果相同，說明兩者具有高度一致性，試紙條比ELISA靈敏度更好，能檢測出 ELISA不能檢測到的陽性樣品。由此可見，這種研發(fā)的弗氏檸檬酸桿菌膠體金試紙條是可行 的，我們可以通過膠體金試紙條對各養(yǎng)殖場中的發(fā)病魚類進行檢測確定病因，從而對癥下 藥，及時防治，防止病情擴大，減少養(yǎng)殖戶損失，也可以作為在苗種引進時的一種初步篩選 工具，這種膠體金試紙條方便實用，非常適合現(xiàn)場檢測。同時，由于弗氏檸檬酸桿菌是一種 "人-畜-魚"共患病病原菌，因此，這種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條也可以廣泛應(yīng)用于各大 醫(yī)院進行急診。
[0071] 表1弗氏檸檬酸桿菌試紙條檢測臨床樣品結(jié)果
[0073] + :試紙條只出現(xiàn)質(zhì)控線一條紅線，為陽性結(jié)果；
[0074] -:試紙條出現(xiàn)兩條紅線，為陰性結(jié)果。
[0075] 具體實施例4
[0076] 膠體金試紙條的靈敏度檢測，具體步驟如下：
[0077] 按具體實施例2中步驟（1)的方法，將活化培養(yǎng)的菌液用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng) 基以10的倍數(shù)進行梯度稀釋，將10 6, 10 7, 10 8, 10 9稀釋的菌液在LB固體培養(yǎng)基平板上進 行涂布，每個稀釋度涂三個平板，30°C倒置培養(yǎng)48h后進行菌落計數(shù)，確定弗氏檸檬酸桿菌 菌液濃度。用PBS緩沖液將培養(yǎng)的弗氏檸檬酸桿菌稀釋成10 3CFU/mL，104CFU/mL，105CFU/ mL，10 6CFU/mL，107CFU/mL，10sCFU/mL。吸取弗氏檸檬酸桿菌菌液（100 ii L)滴加于檢測試紙 條的樣品墊上，靜置10分鐘后觀察結(jié)果。以檢測線消失的最低檢測濃度為其最低檢測極 限。每種濃度做5次重復(fù)。
[0078] 檢測結(jié)果見表2,我們可以看出在弗氏檸檬酸桿菌濃度為103CFU/mL，10 4CFU/mL時 試紙條上均出現(xiàn)兩條線，檢測結(jié)果為陰性，而當弗氏檸檬酸桿菌濃度為105CFU/mL，10 6CFU/ mL，107CFU/mL，10sCFU/mL時，檢測線消失，只有質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測結(jié)果為陽性。 因此，弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的檢測極限為10 5CFU/mL。
[0079] 表2弗氏檸檬酸桿菌試紙條靈敏度檢測結(jié)果
[0082] + :試紙條只出現(xiàn)質(zhì)控線一條紅線，為陽性結(jié)果；
[0083] _ :試紙條出現(xiàn)兩條紅線，為陰性結(jié)果。
[0084] 具體實施例5
[0085] 弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的特異性檢測，其具體步驟如下：
[0086] 將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌和弗氏檸檬酸桿 菌分別稀釋至l〇 7CFU/mL，用制備的試紙條分別檢測這6種細菌，每種細菌做5個重復(fù)，10分 鐘后觀察結(jié)果。若試紙條只在質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶，則檢測結(jié)果為陽性，若試紙條的檢 測區(qū)和質(zhì)控區(qū)都分別出現(xiàn)一條紅色條帶，則檢測結(jié)果為陰性。
[0087] 檢測結(jié)果見表3,我們可以看出用試紙條檢測銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、哈維 氏弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌時，在試紙條的檢測線和質(zhì)控線分別都出現(xiàn)了一條紅色條帶，即 檢測結(jié)果為陰性；而用試紙條檢測弗氏檸檬酸桿菌時只在試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)了一條紅色 條帶，檢測結(jié)果為陽性。由此可見，這種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條具有良好的特異性，它 不與銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0088] 表3弗氏檸檬酸桿菌試紙條特異性檢測結(jié)果
[0089]
[0090] 當然，上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的 保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條，其特征在于：所述的試紙條由PVC底板和在PVC 底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有抗弗氏 梓檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物，所述的硝酸纖維素膜上分別設(shè)置有由弗氏朽 1檬酸桿 菌超聲波破碎液包被的檢測線和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條，其特征在于所述的抗弗氏 梓檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：將抗弗氏梓檬酸桿菌卵黃抗體與膠 體金顆粒直徑為20-40nm的膠體金溶液按5-7 μ g :lmL混合后，在pH 5. 4的條件下通過攪 拌振蕩30-60min，加含IOwt %的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心 2000-3500rpm，10_20min，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h，取離心管底部暗紅色沉淀 即得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物。3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于包 括以下步驟： (1) 樣品墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %蔗糖、Iwt %海藻糖、Iwt %吐 溫-20的pH 7. 2的0.0 lM PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真 空封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫? (2) 特定包被的結(jié)合墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %蔗糖、Iwt %海藻糖，Iwt %吐 溫-20的pH7. 2的0.0 lM PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纖維紙上均勻噴涂10-20 μ L的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物，真空冷凍干 燥1-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫? (3) 特定包被的硝酸纖維素膜的制備 將弗氏檸檬酸桿菌超聲波破碎液用點膜儀將其包被子硝酸纖維素膜上形成檢測線；將 兔抗雞卵黃抗體用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，即得到特定包被的硝酸 纖維素膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆?；其中檢測線與質(zhì)控線相互平行， 所述的檢測線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊端； (4) 試紙條的制備 將步驟（1)得到的樣品墊、步驟（2)得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特定包 被的硝酸纖維素膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6_寬的細條，即得弗氏檸 檬酸桿菌檢測試紙條，真空封裝，4°C保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于所 述的弗氏檸檬酸桿菌抗原的制備方法如下：取實驗室_80°C保存的弗氏檸檬酸桿菌菌種， 在牛肉膏固體培養(yǎng)基中劃線活化，30°C倒置培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于含5mL牛肉膏蛋 白胨液體培養(yǎng)基的試管中，30°C，200rpm培養(yǎng)12-18h，將培養(yǎng)的菌液用牛肉膏液體培養(yǎng)基 按1 : 100稀釋到三角燒瓶中，30°C，200rpm擴大培養(yǎng)，每隔一段時間測其0D600值，當其 0D600值達到0. 4-0. 6時停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液在4°C進行5000rpm離心10min，棄上清， 下層沉淀用pH 7. 2的0.0 lM PBS重懸洗滌，再次5000rpm離心10min，沉淀再次用PBS重復(fù) 上述洗滌2次，最終得到的沉淀即為弗氏檸檬酸桿菌抗原。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于所 述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下： (1) 抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的制備 將上述弗氏檸檬酸桿菌抗原與無菌生理鹽水混合得到弗氏檸檬酸桿菌懸液，加入甲醛 使甲醛體積終濃度達0. 5%，然后37°C恒溫水浴滅活24h，即得到滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗 原；取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對象，將滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗原用生理鹽水稀釋 后和弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射 進行基礎(chǔ)免疫，每只母雞免疫劑量為4X IO9CFU, 15-20天后，將滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗原 和弗氏不完全佐劑進行等體積混合，充分乳化后對母雞肌肉注射進行加強免疫，每只母雞 免疫劑量為2 X IO9CFU,加強免疫重復(fù)進行三次，每次間隔時間為7-10天，然后收集雞蛋測 定效價，當卵黃抗體效價> 1 : 20000時收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵 黃抗體； (2) 膠體金標記抗弗氏朽1檬酸桿菌卵黃抗體 將抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-40nm的膠體金溶液按5-7 μ g : ImL混合，在pH 5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min，加含IOwt %的牛血清白蛋白的PBST 緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min，再高速離心12000-15000rpm， 1-1. 5h，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體-膠體金標記物，用 含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0· 02wt%疊氮化鈉的pH 7. 2的0· OlM PBS緩沖液重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于用 飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：稱取適量步驟（1)分離得到的卵黃，按 體積比1 : 9加入pH 5.0的0.05M的乙酸-7酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過夜，8000g 離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，1000 Og離心20min，沉 淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪拌過夜， 1000 Og離心20min，沉淀用少量pH7. 2的0.0 lM的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩沖液中透析 即得到抗弗氏朽1檬酸桿菌卵黃抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于步 驟（2)中膠體金制備方法如下：將IOOmL O.Olwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸后，邊攪拌邊加 入l-2mL lwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變紅色，至顏色穩(wěn)定后 繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補足失水至IOOmL，無菌密封，4°C避光保存。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于： 所述的檢測線距離所述的結(jié)合墊6-8mm ;所述的質(zhì)控線距離所述的吸水墊6-8mm，所述的檢 測線和所述的質(zhì)控線的寬度分別為〇. 8-1_，兩條線相距為5_。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種弗氏檸檬酸桿菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于： 所述的弗氏朽1檬酸桿菌超聲波破碎液的包被量為1-2 μ L/cm ;所述的兔抗雞卵黃抗體的包 被量為1-2 μ L/cm，所述的弗氏朽1檬酸桿菌超聲波破碎液是將所述的弗氏朽1檬酸桿菌抗原 用PBS重懸，經(jīng)超聲波破碎后4000rpm離心5min所得的上清液。
【文檔編號】G01N33/02GK105891412SQ201410657286
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月14日
【發(fā)明人】劉聯(lián)國, 章禮平, 李登峰, 吳寒華, 徐然, 顧葉華
【申請人】寧波大學