一種定量檢測蛋白質相互作用強度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，引入相對報告因子表達量，結合流式細胞檢測技術與細菌雙雜交系統(tǒng)，實現了蛋白質相互作用強度的定量檢測。
【專利說明】
一種定量檢測蛋白質相互作用強度的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質檢測技術領域，具體涉及一種定量檢測蛋白質相互作用強度的 方法。
【背景技術】
[0002] 定性篩選與鑒定和定量分析是蛋白質相互作用研究的兩個主要目的，蛋白質相互 作用的體內定量檢測有助于增進我們對蛋白質相互作用網絡和相互作用結構基礎的理解。 對其他相關領域的研究，比如設計新的相互作用蛋白對，抗體親和力成熟研究等也有促進 作用。但目前很少有方法可以在高通量篩選的同時做到定量分析。以等溫滴定為代表的定 量分析方法多用于已知相互作用蛋白的分析，一般需要對蛋白質進行純化，導致實驗過程 相對復雜，無法滿足高通量檢測的要求，而且體外檢測無法反映蛋白質在細胞內的真實情 況。以酵母雙雜交技術為代表的體內檢測技術雖然具備高通量、操作簡單等優(yōu)點，但是由于 這類方法并不直接檢測相互作用蛋白，而是通過轉錄激活等原理間接獲得相互作用信息。 以酵母雙雜交技術為例，常用的檢測轉錄激活的報告因子包括半乳糖苷酶、熒光素酶、熒 光蛋白以及生長曲線。然而，由于轉錄激活的機制復雜，目前還無法通過對報告因子的檢測 對蛋白_蛋白相互作用進行定量分析。此外，在細胞中還有其他因素會影響蛋白相互作用以 及報告因子的讀出，比如蛋白質、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性以及質粒拷貝數等。因為無法建 立相互作用強度與報告因子讀出之間的數量關系，所以這類方法只能用于定性研究。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供了一種定量檢測蛋白質相互作 用強度的方法，引入相對報告因子表達量，結合流式細胞檢測技術與細菌雙雜交系統(tǒng)，實現 了蛋白質相互作用強度的定量檢測。
[0004] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0005] -種定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，基于細菌雙雜交系統(tǒng)與流式細胞檢測 技術，包括：
[0006] 1)選擇一對待確定相互作用強度的蛋白質A與蛋白質B;構建帶有編碼蛋白質A的 基因序列a與第一標簽的第一載體，構建帶有編碼蛋白質B的基因序列b與第二標簽的第二 載體;其中第一載體為低拷貝載體，第二載體為高拷貝載體；
[0007] 2)將所述第一載體與第二載體共轉化至報告細菌，得到同時包含基因序列a和基 因序列b的重組細胞；
[0008] 3)在適合表達蛋白質A與蛋白質B的條件下，培養(yǎng)步驟2)得到的重組細胞；重組細 胞表達蛋白質A與蛋白質B;蛋白質A與蛋白質B相互作用后可促進報告基因的轉錄與表達， 產生報告因子；
[0009] 4)在步驟3)得到的體系中對報告因子和第一標簽進行直接或間接的免疫熒光雙 染;通過流式細胞檢測技術分別檢測報告因子和第一標簽相對應的熒光強度，分別得到報 告因子和蛋白質A的表達量;例如，在步驟3)得到的體系中加入報告因子對應的熒光底物， 報告因子可水解該熒光底物，產生熒光物質;通過流式細胞儀檢測該熒光物質的熒光強度 可得到報告因子的表達量;第一標簽的免疫熒光染色和流式檢測采用本領域常規(guī)技術即可 完成;報告因子表達量與蛋白質A表達量的比值為相對報告因子表達量，該相對報告因子表 達量的值可定量蛋白質A與蛋白質B相互作用的強度:該相對報告因子表達量的值越大，表 明蛋白質A與蛋白質B的相互作用越強;該相對報告因子表達量的值越小，表明蛋白質A與蛋 白質B的相互作用越弱。
[0010]免疫熒光染色的過程中，對于非跨膜熒光底物，加入熒光底物染色前需對重組細 胞進行破膜處理，改變細胞的滲透性;對于可跨膜熒光底物，可直接進行熒光染色;所述熒 光底物的終濃度可為10nM~ImM，反應時間可為1~240min，反應溫度可為4~80°C。
[0011] -實施例中：所述第一標簽為His，Flag，TC，HA。
[0012] -實施例中：所述第二標簽為Flag，His，TC，HA。
[0013] 一實施例中：所述第一載體為 pKT25，pKT25N，pKT25-Hi s。
[0014] 一實施例中：所述第二載體為 pUT18C，pUT18，pUT18-Flag。
[0015] -實施例中：：所述報告細菌為E.coli BTH101，E.coli DHM1。
[0016] -實施例中：所述報告基因為lacZ，gfp，egfp;其對應的報告因子分別為半乳糖 苷酶，GFP，EGFP。
[0017] 本發(fā)明采用的儀器、設備、材料、試劑等，除有特別說明外，均可從市面上購買到。 本發(fā)明中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗 室手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0018] 本技術方案與【背景技術】相比，它具有如下優(yōu)點：
[0019] 本發(fā)明引入相對報告因子表達量，結合流式細胞檢測技術與細菌雙雜交系統(tǒng)，實 現了蛋白質相互作用強度的定量檢測，克服了現有技術中由細菌異質性、培養(yǎng)時間、誘導濃 度等各種因素導致的無法通過檢測報告因子或相互作用蛋白來定量蛋白相互作用強度的 缺陷，實現了在單細菌水平對體內蛋白質相互作用強度的靈敏、快速、高分辨定量檢測。
【附圖說明】
[0020] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0021] 圖1為實施例2中e-gal酶活性檢測結果。
[0022] 圖2為實施例2中TolB蛋白和Pal蛋白的Western blot檢測結果。
[0023]圖3為實施例2中在不同培養(yǎng)時間下重組細胞表達P-gal和TolB蛋白的雙參數檢測 流式直方圖。
[0024] 圖4為實施例2中MFIe-gai值和MFlHis-t〇ib值的線性曲線。
[0025]圖5為實施例4中雙參數流式檢測所得的不同單菌落中P-gal表達與His-TolB表達 的相關曲線。
[0026]圖6為實施例4中P-gal酶活與相對報告因子表達量RRPE的相關性。
[0027]圖 7 為實施例 5 中質粒 pKT25-His-tolBA22-25 和 pKT25-His-tolBA22-33 的構建過程的 瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0028]圖8為實施例5中三種不同相互作用強度蛋白對雙雜交細菌某一單菌落樣品的雙 熒光散點圖以及它們對應熒光通道的信號分布直方圖。
[0029] 圖9為實施例5中Pal與TolB、TolBA22-25和TolB A22-33各自構成的雙雜交細菌的相對 報告因子表達量。
【具體實施方式】
[0030] 下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內容：
[0031] 實施例1:利用本發(fā)明的定量檢測方法檢測蛋白對的相互作用強度
[0032] 1)選擇一對待確定相互作用強度的蛋白質A與蛋白質B，本實施例之中以TolB蛋白 和Pal蛋白為例，它們是革蘭氏陰性細菌內膜蛋白質系統(tǒng)中Tol-Pal系統(tǒng)的兩個功能蛋白， TolB蛋白和Pal蛋白相互作用組成了細菌外膜復合體。
[0033]以大腸桿菌K12基因組為模板，設計tolB和pal基因的引物并于生工合成，通過PCR 分別獲取tolB和pal基因，將它們分別插入細菌雙雜交載體pKT25(帶有His標簽，且為低拷 貝質粒）、pUT18C(帶有Flag標簽，且為高拷貝質粒）的EcoR I和Xho I酶切位點，構建得到 pKT25-His-tolB與pUT18C-Flag-pal。
[0034] 2)將上述pKT25-His-tolB與pUT18C-Flag-pal共轉化至報告細菌E.coli BTH101 感受態(tài)中，培養(yǎng)得到同時包含tolB基因序列和pal基因序列的重組細胞E. col i BTH101pKT25-His-tolB/pUT18C-Flag-pal，完成細菌雙雜交系統(tǒng)的構建。采用常規(guī)的藍白 斑篩選及比色定量法確定上述細菌雙雜交系統(tǒng)的成功建立，同時采用Western Blot、免疫 共沉淀、熒光顯微鏡等傳統(tǒng)生物學實驗手段進行驗證。
[0035] 3)用接種環(huán)刮取少量上述重組細胞E.coli BTH101pKT25-His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線，并于30°C培養(yǎng)48h;用滅菌牙簽隨機挑取一個單菌落，接種 于含有l(wèi)〇〇yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，IPTG誘導下，30°C，250rpm 搖床培養(yǎng)，誘導重組細胞表達To 1B蛋白和Pal蛋白，To 1B蛋白和Pal蛋白相互作用后促進報 告基因lacZ的轉錄與表達，產生報告因子半乳糖苷酶⑴-gal)。
[0036] 4)檢測上述體系中相對報告因子表達量（Relative reporter protein expression，RRPE)的值，可得到TolB蛋白和Pal蛋白的相對相互作用強度:該相對報告因子 表達量的值越大，表明TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用越強;該相對報告因子表達量的值越 小，表明To 1B蛋白和Pa 1蛋白的相互作用越弱。具體地：
[0037] 將相對報告因子表達量（Relative reporter protein expression，RRPE)定義 為：
[0038] 相對報告因子表達量RRPE =報告因子f3_ga 1表達量/To 1B蛋白表達量
[0039] 本實施例之中，采用免疫熒光雙染的方法進行，在步驟3)得到的體系中加入對應 報告因子P-gal的熒光底物C12FDG; P-gal可水解C12FDG，產生綠色熒光;通過流式細胞儀檢 測綠色焚光強度(用綠色焚光的焚光中位值(Median fluorescence intensity，MFI)表征， 記為MFIe-gal)可得到報告因子P-gal的表達量；同時，通過流式細胞儀檢測His標簽(采用本 領域常規(guī)技術進行熒光染色）的紅色熒光強度（用紅色熒光中位值表征，記為MFI Hls-TcilB)可 得到TolB蛋白的表達量；因而，通過流式細胞儀檢測兩種熒光強度即可得到相對報告因子 表達量RRPE的值，即為：
[0040] 相對報告因子表達量 RRPE=MFIe-gai/MFlHis-T〇iB
[0041]這樣，通過流式細胞儀檢測即可得到相對報告因子表達量的值，從而直觀地判斷 TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強度。
[0042]利用上述方法，可以定量檢測任意一對蛋白質的相互作用強度。
[0043]實施例2:本發(fā)明的定量檢測方法的驗證之一:不同培養(yǎng)時間下的有效性驗證 [0044] 1)用接種環(huán)刮取少量實施例1中步驟2)得到的重組細胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線，并于30°C培養(yǎng)48h。用滅菌牙簽隨機挑取 一個單菌落，接種于裝有15mL含100yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基的錐 形瓶中，30°C，250rpm搖床培養(yǎng)。從第12h開始，每隔2h從錐形瓶中取出適量菌液直至20h，將 剩余的菌液放回搖床中繼續(xù)培養(yǎng)。取出的菌液先調節(jié)OD600至1.0，接著取其中的200yL進行 固定處理，其余菌液置于4°C保存。固定后的細菌重懸于GTE緩沖液中，并被保存于4°C，待檢 測用。
[0045] 2)參照實施例1中步驟4)的方法，通過流式細胞儀檢測本實施例步驟1)中不同培 養(yǎng)時間的菌液中MFIe- gai值和MFIHis-toib值，計算得到檢測相對報告因子表達量RRPE。理論 上，TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強度是一定的，因而可以反過來驗證用相對報告因子表 達量RRPE來對蛋白相互作用強度進行定量是否有效。
[0046] 同時，作為對比地，檢測報告因子P-gal的表達量、酶活，TolB蛋白和Pal蛋白的表 達量，驗證其是否可用于對蛋白-蛋白相互作用進行定量分析。
[0047]對比實驗的結果如圖1至圖3所示。圖1中可看出，細菌總體的P-gal酶活性從第12h 的375. lU/mL上升到第16h的702. lU/mL，之后開始逐漸下降。同樣的，TolB蛋白和Pal蛋白的 Western blot實驗也出現了類似現象（圖2)。另一方面，通過流式細胞儀在單細菌水平的分 析可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，表達蛋白的細菌比例以及單個細菌的蛋白表達量均有明顯 變化。圖3是不同培養(yǎng)時間下重組細胞蛋白表達雙參數檢測的流式直方圖，其中FL1為綠色 熒光通道，代表P-gal的表達情況;FL2為紅色熒光通道，代表His-TolB蛋白的表達情況?？?見，表達P-gal蛋白和His-TolB蛋白的陽性菌比例隨培養(yǎng)時間的延長不斷升高（從7.5%到 75.5%)，而這部分陽性菌細菌的熒光強度卻一直下降，其熒光中位值分別從14500(FL1)和 4155(FL2)下降到2508和495,說明單個細菌的蛋白含量隨培養(yǎng)時間的增加反而降低，這一 現象可能是由細菌分裂導致的蛋白質稀釋引起;而陽性菌比例的增加和單個細菌蛋白表達 量的下降，也在單細菌水平解釋了圖1和圖2中0-gal、TolB蛋白和Pal蛋白的總體表達量/活 性含量先升高后下降的現象。
[0048] 正是由于上述原因，導致報告因子0-gal的表達量、酶活，或者TolB蛋白和Pal蛋白 的表達量都無法用于對蛋白相互作用強度進行定量分析。
[0049] 然而，利用本發(fā)明的方法，如圖4所示，通過流式細胞儀檢測本實施例步驟1)中不 同培養(yǎng)時間的菌液中MFIe-gai值和MFI His-toib值，計算得到檢測相對報告因子表達量RRPE。圖 4中可以看出，MFIe- gai值和MFIHis-toib值具有非常好的線性關系(R2 = 0.9995)，表明隨著培養(yǎng) 時間的延長，MFIe-gai值和MFIHi s-toib值的比值RRPE仍然保持恒定，不受培養(yǎng)時間的影響。這 也反過來驗證了本發(fā)明的采用相對報告因子表達量RRPE來對蛋白相互作用強度進行定量 的方法，可以排除培養(yǎng)時間的影響，是有效的。
[0050] 實施例3:本發(fā)明的定量檢測方法的驗證之二:不同的誘導劑IPTG濃度下的有效性 驗證
[0051 ] 1)用接種環(huán)刮取少量實施例1中步驟2)得到的重組細胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線，并于30°C培養(yǎng)48h。用滅菌牙簽隨機挑取 一個單菌落在50yL的LB培養(yǎng)基中攪拌并盡量混勾。從中分別取10yL菌液加入到15mL各含0、 50、500yM IPTG，以及100yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，30°C，250rpm 搖床培養(yǎng)。分別在第6、10、14、18h時取出適量菌液，調節(jié)0D 6QQ至1.0，于4 °C保存，待檢測。 [0052] 2)參照實施例1中步驟4)的方法，通過流式細胞儀檢測本實施例步驟1)中在不同 IPTG濃度誘導下培養(yǎng)的菌液中MFIe-gai值和MFIHis-toib值，計算得到檢測相對報告因子表達 量RRPE。理論上，TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強度不受IPTG濃度的影響，是一定的，因而 可以反過來驗證用相對報告因子表達量RRPE來對蛋白相互作用強度進行定量是否有效。 [0053] 結果顯示，在不同的IPTG濃度誘導情況下，MFIe- gai值和MFIHis-toib值的比值RRPE仍 然保持恒定，不受IPTG濃度的影響。這也反過來驗證了本發(fā)明的采用相對報告因子表達量 RRPE來對蛋白相互作用強度進行定量的方法，可以排除IPTG濃度的影響，是有效的。
[0054]實施例4:本發(fā)明的定量檢測方法的驗證之三:不同單菌落得到的體系中的有效性 驗證
[0055]本領域技術人員可知，細菌個體之間的異質性有時會造成蛋白表達量的巨大差 異，而這些差異可能隨著細菌的增殖而不斷傳遞和放大，最終導致菌落之間的異質性。由不 同單菌落擴增得到的體系中，其P-gal酶活往往有巨大差異，因而對于不同單菌落擴增得到 的體系，通過測定0-gal酶活來判斷TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強度是不準確的。本實 施例之中，驗證了相對報告因子表達量RRPE是否適用于不同單菌落培養(yǎng)得到的體系中蛋白 相互作用強度的檢測。
[0056] 1)用接種環(huán)刮取少量實施例1中步驟2)得到的重組細胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線，并于30°C培養(yǎng)48h。用滅菌牙簽隨機挑取 若干個單菌落，分別接種于2mL含100yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中， 30°C，250rpm搖床培養(yǎng)16h。將菌液的0D600值調節(jié)至1.0待用。
[0057] 2)參照實施例1中步驟4)的方法，通過流式細胞儀檢測本實施例步驟1)中由不同 單菌落培養(yǎng)得到的體系中MFIe-gai值和MFIHis-toib值，計算得到檢測相對報告因子表達量 RRPE。理論上，即使在不同單菌落中，TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強度也都是一定的，因 而可以反過來驗證用相對報告因子表達量RRPE來對蛋白相互作用強度進行定量是否有效。 [0058]結果：圖5顯示了雙參數流式檢測所得的不同單菌落中P-gal表達與His-TolB表達 的相關曲線，可見MFIe- gai值和MFIHis-toib值之間依然存在良好的線性關系(R2 = 0.9789)，即 相對報告因子表達量RRPE仍然保持恒定，與理論上"TolB蛋白和Pal蛋白在不同單菌落中的 相互作用強度一定"相符合，表明RRPE不受不同單菌落的影響。因而也反過來驗證了本發(fā)明 的采用相對報告因子表達量RRPE來對蛋白相互作用強度進行定量的方法，可以排除不同單 菌落這個因素的影響，是有效的。
[0059]圖6顯示了P-gal酶活與相對報告因子表達量RRPE的相關性。P-gal酶活和RRPE的 平均值分別為255.11 ±112.03和2.04±0.16,各自的變異系數為44%和8%。結合圖5中的 線性擬合曲線判斷，表明二者具有良好的相關性。
[0060]此外，除了實施例2-4中提到的培養(yǎng)時間、誘導劑濃度和不同單菌落對報告因子表 達和活性的影響之外，還有一些因素導致無法單獨用報告因子的量來定量蛋白間的相互作 用強度。通過實驗雖然可以排除細菌雙雜交系統(tǒng)中質粒丟失的情況。然而基于單細菌水平 的研究發(fā)現細菌雙雜交系統(tǒng)中細菌個體存在明顯的異質性。
[0061]大腸桿菌中存在全或無的現象，即在乳糖操縱子的作用下，隨著培養(yǎng)基中乳糖類 似物(TMG)濃度的增加，不是所有大腸桿菌個體都線性地增加半乳糖苷酶表達，而是有些 個體完全高活性地表達lacZ基因，而另一部分個體則完全不表達。細菌雙雜交系統(tǒng)中，報告 基因和相互作用蛋白的表達受乳糖操縱子調控，因而蛋白的表達同樣存在雙穩(wěn)態(tài)現象。并 且，相互作用蛋白的表達、cAMP的生成、報告基因的表達形成更為復雜的三級正反饋調節(jié)系 統(tǒng)。此外，兩種質粒在轉化以及細菌分裂時分配的隨機性，會導致細菌個體間質粒拷貝數的 不同，造成蛋白表達量的差異，最終影響到菌落中蛋白表達的比例。
[0062]因而，單純通過檢測報告因子或相互作用蛋白的量，無法實現對蛋白相互作用強 度的準確定量。但通過本發(fā)明的方法，引入相對報告因子表達量，結合流式細胞檢測技術與 細菌雙雜交系統(tǒng)，能夠排除各項細菌異質性、培養(yǎng)時間、誘導濃度等因素的影響，實現蛋白 質相互作用強度的定量檢測。
[0063]實施例5:本發(fā)明的定量檢測方法的驗證之四：對具有不同相互作用強度的蛋白對 的有效性驗證
[0064]本實施例之中，驗證了本發(fā)明的定量檢測方法是否適用于不同相互作用強度的蛋 白對的檢測。
[0065] TolB-Pal蛋白對中，TolB由N端的a/f3型結構域以及C端與Pal相互作用的f3-propeller型結構域兩部分組成。TolB是一個周質蛋白，含有一段21個氨基酸的信號肽，并 能夠在蛋白進入周質空間時裂解。有文獻指出，To 1B蛋白N端不同長度的敲除會對與Pal的 相互作用產生影響，使二者的親和力下降（Bonsor D A，Hecht 0，Vankemmelbeke M，et al.Allosteric beta-propeller signalling in TolB and its manipulation by translocating colicins[J] .Embo Journal，2009，28(18): 2846-2857 ?)。因此，本實施例 之中，對TolB蛋白N端進行不同長度的敲除(分別為22-25和22-33號氨基酸殘基缺失），利用 其與Pal親和力的變化，得到具有不同相互作用強度的蛋白對，采用本發(fā)明的方法檢測，可 以反過來驗證本發(fā)明的定量檢測方法是否適用于各種蛋白對。
[0066] 1)質粒 pKT25-His-tolBA22-25 和 pKT25-His-tolBA22-33 的構建：
[0067] 以質粒pEB362為模板，利用SEQ ID No.5至SEQ ID No.7所示的引物tolBA22-25-F、 tolBA22_ 33-F和tolB-R，通過PCR反應分別獲得兩端帶有限制性酶切位點EcoR I和Xho I的 tolBA22-25和tolBA22-33的基因，設置PCR反應體系如下：
[0069]以上體系混勻后平均分成兩管，按如下程序進行PCR反應：
[0071] PCR反應結束后，首先對產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，之后利用DNA片段純化試 劑盒對PCR產物進行純化回收。
[0072] 對質粒pKT25-His_tolB和以上PCR產物分別按如下反應體系進行雙酶切：
[0074] 以上體系混勻后分成4管，于37 °C反應3h。質粒的酶切產物采用切膠回收;PCR產物 酶切后用DNA片段純化試劑盒回收。所有純化回收后的產物均用瓊脂糖凝膠電泳驗證，并用 NAN0-DR0P 測定 DNA 濃度。
[0075] 利用T4連接酶將以上雙酶切后的質粒載體與PCR產物連接，設置體系如下：
[0077]連接體系于16°C反應過夜，之后轉化至E.coli ER2738感受態(tài)細菌中。在含有卡那 霉素的平板上挑取單菌落進行PCR驗證，將陽性克隆擴大培養(yǎng)后送測序公司測序。
[0078]如圖7所示，A為目的片段PCR后瓊脂糖凝膠電泳的結果，tolBA22_25和tolB A22_33基 因的理論長度分別為1218bp和1194bp，對照DNA marker可知兩者的條帶位置正確。B為質粒 載體pKT25-His-tolB和PCR產物雙酶切純化后的電泳結果，其中質粒載體的理論長度約為 3400bp，三者的條帶位置均接近理論值。C為菌落PCR驗證的電泳結果，幾個單菌落均有PCR 產物，且條帶位置正確，說明質粒載體中成功插入了目的基因片段。進一步的測序結果證明 插入基因片段的序列完全正確。表明pKT25-His-tolB A22-25和pKT25-His-tolBA22-33質粒成 功構建。
[0079] 2)參照實施例1中的步驟，將構建成功的質粒pKT25-His-tolBA22- 25和pKT25-His- tolBA22-33 ,以及pKT25-His-tolB，分別和質粒pUT18C-Flag-pal共轉化至報告菌株E.coli BTH101中，接著各自挑取3個單菌落培養(yǎng);之后進行免疫熒光雙染，并用流式細胞儀檢測。 [0080]圖8顯示了三種不同相互作用強度蛋白對雙雜交細菌某一單菌落樣品的雙熒光散 點圖以及它們對應熒光通道的信號分布直方圖。三者的蛋白表達比例各異。但是通過計算 各自的相對報告因子表達量可以看出該參數與蛋白的相互作用強度有很好的相關性。如圖 9所示，Pal與T 〇lB、T〇lBA22-25和T〇lB A22-33各自構成的雙雜交細菌的相對報告因子表達量分 別為2.04±0.21、0.88 ±0.07和0.91 ±0.06,而文獻報道的三者的解離常數分別為38 土 3碰、313$151^1和337±18碰，而解離常數越小，相互作用越強。有上述結果可知，當蛋白 對的相互作用越強，相對報告因子表達量則越大。以上實驗結果，一方面驗證了本發(fā)明的定 量方法在不同相互作用強度蛋白對中的有效性，也進一步說明了相對報告因子表達量能用 于細菌雙雜交系統(tǒng)中各種蛋白對相互作用強度的評估。
[0081 ]附：
[0082]本發(fā)明實施例中，涉及的引物如下所示（同時記載在說明書核苷酸和氨基酸序列 表)：
[0084]本發(fā)明實施例中，除有特別說明外，其余的PCR反應體系如下所示：
[0086]本發(fā)明實施例中，除有特別說明外，其余的PCR反應進程如下所示：
[0088] 將質粒、細菌基因組或者菌液（重懸于超純水中，95°C加熱處理lOmin)樣品與PCR 反應的其他組份按4倍用量混合均勻后，分裝至熒光定量PCR專用的PCR管中，每管20yL，共3 管，作為平行樣進行PCR反應。
[0089]以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依 本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。
【主權項】
1. 一種定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，其特征在于:基于細菌雙雜交系統(tǒng)與流 式細胞檢測技術，包括： 1) 選擇一對待確定相互作用強度的蛋白質A與蛋白質B;構建帶有編碼蛋白質A的基因 序列a與第一標簽的第一載體，構建帶有編碼蛋白質B的基因序列b與第二標簽的第二載體； 其中第一載體為低拷貝載體，第二載體為高拷貝載體； 2) 將所述第一載體與第二載體共轉化至報告細菌，得到同時包含基因序列a和基因序 列b的重組細胞； 3) 在適合表達蛋白質A與蛋白質B的條件下，培養(yǎng)步驟2)得到的重組細胞；重組細胞表 達蛋白質A與蛋白質B;蛋白質A與蛋白質B相互作用后可促進報告基因的轉錄與表達，產生 報告因子； 4) 在步驟3)得到的體系中對報告因子和第一標簽進行直接或間接的免疫熒光雙染;通 過流式細胞檢測技術分別檢測報告因子和第一標簽相對應的熒光強度，分別得到報告因子 和蛋白質A的表達量;報告因子表達量與蛋白質A表達量的比值為相對報告因子表達量，該 相對報告因子表達量的值可定量蛋白質A與蛋白質B相互作用的強度:該相對報告因子表達 量的值越大，表明蛋白質A與蛋白質B的相互作用越強;該相對報告因子表達量的值越小，表 明蛋白質A與蛋白質B的相互作用越弱。2. 根據權利要求1所述的定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，其特征在于:所述第一 標簽為 His，Flag，TC，HA。3. 根據權利要求1所述的定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，其特征在于:所述第二 標簽為 Flag，His，TC，HA。4. 根據權利要求1所述的定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，其特征在于:所述第一 載體為 pKT25，pKT25N，pKT25-Hi s。5. 根據權利要求1所述的定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，其特征在于:所述第二 載體為 pUT18C，pUT18，pUT18-Flag。6. 根據權利要求1所述的定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，其特征在于:所述報告 細菌為E. coli BTHlOl，E. coli DHMl。7. 根據權利要求1所述的定量檢測蛋白質相互作用強度的方法，其特征在于:所述報告 基因為IacZ，gf ρ，egf ρ;其對應的報告因子分別為β-半乳糖苷酶，GFP，EGFP。
【文檔編號】G01N33/533GK105891462SQ201610474048
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】吳麗娜, 汪旭, 顏曉梅
【申請人】廈門大學