一種rna中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物化學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種RNA中5?羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒。該檢測方法包括：將總RNA與變性試劑混合，變性，獲得變性RNA；將變性RNA結(jié)合于硝酸纖維素膜上，烘干，封閉，獲得抗原膜片；將抗原膜片與5?羥甲基胞嘧啶抗體進行第一孵育，然后與特異性第二抗體進行第二孵育，顯影，獲得檢測結(jié)果。本發(fā)明檢測方法可快速對RNA中5?羥甲基胞嘧啶進行檢測分析，靈敏度較高，易于操作，樣品制備較簡單。
【專利說明】
一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物化學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)最早于1952年在噬菌體DNA中被發(fā)現(xiàn)，它能被糖基轉(zhuǎn)移酶介導糖基化修飾，從而使噬菌體基因組在進入宿主后能抵抗宿主限制酶的降解。1972年P(guān)enn等在哺乳動物大鼠、小鼠以及卵生動物牛蛙腦組織提取的DNA中也發(fā)現(xiàn)了羥基化修飾的胞嘧啶，約占DNA總胞嘧啶的15%左右，但此后的研究未能重復這一結(jié)果。直到2009年，Tahi Iiani和Kriauc1ni s的兩個研究團隊在同一期Science中分別報道了 5hmC在人、小鼠大腦及胚胎干細胞中有著豐富表達，羥甲基化的概念才又一次進入人們的視野并得到了重視。
[0003]5-羥甲基胞嘧啶的分子式是C5H7N3O2,是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)的羥基化形式，5-羥甲基胞嘧啶是TET家族的酶通過氧化5-甲基胞嘧啶產(chǎn)生的，被稱為“第六種堿基”，可以調(diào)控基因表達的關(guān)閉，是一種重要的表觀遺傳修飾，可能與去甲基化過程有關(guān)，5-羥甲基胞嘧啶的具體作用機制還不明確。5-羥甲基胞嘧啶在哺乳動物的不同組織間存在差異性分布，這種差異還會隨著年齡、疾病等因素發(fā)生變化。所有的哺乳動物基因組中都含有5-羥甲基胞嘧啶，但是其水平在不同類型細胞中相差很大，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞中含量最高。
[0004]5hmC是一種新型的堿基修飾方式，最近的研究證明其在各類疾病中都發(fā)揮著重要的作用。最新研究證明5hmC不但在DNA序列中存在，而且還在RNA序列中也存在。雖然檢測DNA 5hmC的方法有很多種，如免疫組織化學方法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法、高通量測序分析方法等，但很多都不能在RNA 5hmC的檢測中使用，因為RNA自身的生物學特點——極易降解。因此尋找方便快捷檢測RNA 5hmC的方法就顯得非常重要。
[0005]目前用于檢測RNA5hmC的方法只有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析方法。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜中，液相色譜負責分離待測物與干擾物，質(zhì)譜負責檢測。樣品進樣后首先在流動相的攜帶下進入色譜柱，經(jīng)過色譜柱分離后，進入質(zhì)譜進行檢測。質(zhì)譜根據(jù)被測物的質(zhì)荷比(m/z)進行檢測，被測物在離子源轉(zhuǎn)換成氣相離子進入質(zhì)譜，在三重四級桿中一級質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進入碰撞室，在碰撞室內(nèi)分子離子碰撞裂解，形成子離子進入二級質(zhì)譜，二級質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進入檢測器。但該檢測方法耗時長，所需費用昂貴，不方便，操作較繁瑣，樣品制備比較麻煩。因此，需要提供一種方便快捷、易于操作、樣品制備比較簡單的RNA中5-羥甲基胞嘧啶修飾檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒。該檢測方法可快速對RNA中5-羥甲基胞嘧啶進行檢測分析，靈敏度較高，易于操作，樣品制備較簡單。
[0007]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明提供了一種RNA中5-輕甲基胞嘧啶的檢測方法，包括如下步驟:
[0009]步驟1:將總RNA與變性試劑混合，變性，獲得變性RNA；
[0010]步驟2:將變性RNA結(jié)合于硝酸纖維素膜上，烘干，封閉，獲得抗原膜片；
[0011]步驟3:將抗原膜片與5-羥甲基胞嘧啶抗體進行第一孵育，然后與酶標第二抗體進行第二孵育，顯影，獲得檢測結(jié)果。
[0012]作為優(yōu)選，變性試劑為氫氧化鈉、甲醛或Tris-HCl。
[0013]優(yōu)選地，變性試劑為氫氧化鈉。
[0014]作為優(yōu)選，變性試劑的濃度為0.5?4moI /L。
[0015]優(yōu)選地，變性試劑的濃度為2moI/L。
[0016]作為優(yōu)選，變性的時間為0.5?48h，變性的溫度為O?1 °C。
[0017]優(yōu)選地，變性的時間為0.5h，變性的溫度為4°C。
[0018]作為優(yōu)選，步驟2中結(jié)合的時間不少于60min。
[0019]優(yōu)選地，步驟2中結(jié)合的時間為15min。
[0020]作為優(yōu)選，結(jié)合的溫度為15?30°C。
[0021]作為優(yōu)選，步驟2中烘干的溫度為60?100°C，時間為0.25?2h。
[0022]優(yōu)選地，步驟2中烘干的溫度為80°C，時間為0.5h。
[0023]作為優(yōu)選，總RNA的濃度為12.5?lOOng。
[0024]優(yōu)選地，總RNA的濃度為I OOng。
[0025]作為優(yōu)選，第一孵育的溫度為O?10°C，時間為12?24h。
[0026]優(yōu)選地，第一孵育的溫度為4°C，時間為12h。
[0027]作為優(yōu)選，第二孵育的溫度為15?30°C，時間為0.5?2h。
[0028]優(yōu)選地，第二孵育的溫度為25°C，時間為lh。
[0029]在本發(fā)明提供的一些實施例中，顯影采用的試劑為ECL顯影液。
[0030]在本發(fā)明提供的一些實施例中，酶標第二抗體為兔源HRP標記的第二抗體。
[0031 ]在本發(fā)明提供的一些實施例中，HRP標記的第二抗體為兔源HRP標記的第二抗體。
[0032]作為優(yōu)選，在該檢測方法中所用試劑均采用DEPC水配制。DEPC的中文名為焦碳酸二乙酯，分子式為C6HiqO5,分子量為162.14，是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑，通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性，常用于生物實驗中RNA的提取等。
[0033]在本發(fā)明提供的一些實施例中，封閉采用的試劑為牛奶。
[0034]本發(fā)明還提供了一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測試劑盒，包括試劑:變性試劑、硝酸纖維素膜、5-羥甲基胞嘧啶抗體、酶標第二抗體和顯影液。
[0035]作為優(yōu)選，試劑采用DEPC水配制。
[0036]作為優(yōu)選，變性試劑為氫氧化鈉、甲醛或Tris-HCl。
[0037]優(yōu)選地，變性試劑為氫氧化鈉。
[0038]作為優(yōu)選，變性試劑的濃度為0.5?4moI /L。
[0039 ]優(yōu)選地，變性試劑的濃度為2mo 1/L。
[0040]在本發(fā)明提供的一些實施例中，顯影液為ECL顯影液。
[0041 ]在本發(fā)明提供的一些實施例中，酶標第二抗體為兔源HRP標記的第二抗體。
[0042]在本發(fā)明提供的一些實施例中，HRP標記的第二抗體為兔源HRP標記的第二抗體。
[0043]作為優(yōu)選，該試劑盒還包括硝酸纖維素膜、封閉劑或PBST溶液中的一種或幾種。
[0044]在本發(fā)明提供的一些實施例中，封閉劑為牛奶。
[0045]作為優(yōu)選，RNA中5hmC檢測方法為:
[0046]1、提取總 RNA;
[0047]2、加入2M的NaOH溶液，4°C反應30分鐘；
[0048]3、取硝酸纖維素膜，將變性后的RNA加到膜上，在15?30°C下放置15分鐘；
[0049]4、將膜放置80°C條件下烘烤30分鐘；
[0050]5、從80 °C取出后用牛奶封閉，在15?30 °C下反應I小時，然后用PBST溶液洗滌；
[0051 ]6、用5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應12?24h后PBST溶液洗滌；
[0052 ]7、用特異性二抗孵育NC膜，15?30 °C下反應I小時，然后用PBST溶液洗滌。
[0053]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0054]在本發(fā)明提供的一些實施例中，RNA中5hmC檢測方法具體為:
[0055]1、提取總RNA，并稀釋成濃度10ngAiL ；
[0056]2、加入等體積濃度為2M的NaOH溶液，4°C反應30分鐘；
[0057]3、取硝酸纖維素膜，加變性后的RNA樣品到膜上，常溫放置15分鐘；
[0058]4、將膜放置80°C條件下烘烤30分鐘；
[0059]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用PBST溶液洗滌；
[0060]6、用5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗滌；
[0061 ]7、用特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗滌。
[0062]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0063]本發(fā)明提供了一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒。該檢測方法包括:將總RNA與變性試劑混合，變性，獲得變性RNA;將變性RNA結(jié)合于硝酸纖維素膜上，烘干，封閉，獲得抗原膜片;將抗原膜片與5-羥甲基胞嘧啶抗體進行第一孵育，然后與特異性第二抗體進行第二孵育，顯影，獲得檢測結(jié)果。本發(fā)明具有的有益效果為:
[0064]1、本發(fā)明檢測方法可快速對RNA中5-輕甲基胞嘧啶進行檢測分析，靈敏度較高；
[0065]2、本發(fā)明檢測方法方便快捷，易于操作，樣品制備較簡單。
【附圖說明】
[0066]圖1示不同變性試劑及其不同濃度對實驗結(jié)果的影響；其中，A圖是不同變性試劑對實驗的影響，B為其甲基藍染色圖；C圖是不同NaOH濃度對實驗結(jié)果的影響，D圖為其甲基藍染色圖；
[0067]圖2示不同變性時間對實驗結(jié)果的影響;其中，A圖是加入變性試劑30分鐘、I小時、3小時、6小時、12小時、24小時、48小時后的實驗結(jié)果;B圖為其甲基藍染色圖；
[0068]圖3示不同結(jié)合時間對實驗結(jié)果的影響；其中，A圖是樣品滴加到膜上以后在室溫下靜置不同時間(0min、15min、30min、60min)的實驗結(jié)果，B為其甲基藍染色圖；(3圖是室溫靜置后置于80<€下不同烘干時間(15111；[11、301]1；[11、111、211)對結(jié)果的影響;0圖為其甲基藍染色圖；
[0069]圖4示溶液配制對實驗結(jié)果的影響；其中，A圖是不同水配制溶液后的實驗結(jié)果，DEPC代表所用試劑都是DEPC水配制的，Control代表所用試劑都是用普通純水配制的；B為其甲基藍染色圖；
[0070]圖5示小鼠不同腦區(qū)5hmC的表達情況;其中，A圖是腦干(BS)、海馬(Hipo)、下丘腦(Hypo)、杏仁核(Amy)、皮層(Ctx)、小腦(Cere)六個區(qū)域RNA 5hmC水平檢測結(jié)果;B為其甲基藍染色圖。
【具體實施方式】
[0071]本發(fā)明公開了一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0072]本發(fā)明提供的RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法及其試劑盒中所用生物試劑均可由市場購得。
[0073]所用到的抗體信息如下:5hmC抗體(美國，Active Motif公司)，二抗(美國，Jackson ImmunoResearch公司)。所有試劑溶液均用DEPC水配制。
[0074]下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明:
[0075]實施例1 RNA 5hmC檢測方法
[0076]1、提取總RNA，并稀釋成濃度lOOng/yL。
[0077]2、加入等體積濃度為2M的NaOH溶液，4°C反應30分鐘。
[0078]3、取4X8硝酸纖維素膜，按順序滴加2yL樣品到膜上，常溫放置15分鐘。
[0079]4、將膜放置80 0C烤箱烘烤30分鐘。
[0080]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用I3BST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0081 ] 6、用PBS溶液稀釋好的5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗3次，每次10分鐘。
[0082]7、用5 %牛奶稀釋好的特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0083]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0084]9、曝光后的NC膜用0.02%亞甲基藍溶液進行染色并拍照。
[0085]注:所有試劑溶液均用DEPC水配制。
[0086]實施例2不同變性劑及濃度對RNA 5hmC檢測效果的影響
[0087](一)不同變性試劑對RNA5hmC檢測效果的影響
[0088]變性試劑種類設置:NaOH、甲醛、Tris-HCl ；
[0089]試驗方法為:
[0090]1、提取總RNA，并稀釋成濃度lOOng/yL。
[0091]2、加入等體積濃度為2M的變性試劑溶液(NaOH、甲醛或Tris-HCl)，4°C反應30分鐘。
[0092]3、取4X8硝酸纖維素膜，按順序滴加2yL樣品到膜上，常溫放置15分鐘。
[0093]4、將膜放置80 0C烤箱烘烤30分鐘。
[0094]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用I3BST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0095]6、用PBS溶液稀釋好的5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗3次，每次10分鐘。
[0096]7、用5 %牛奶稀釋好的特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0097]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0098]9、曝光后的NC膜用0.02%亞甲基藍溶液進行染色并拍照。
[0099]注:所有試劑溶液均用DEPC水配制。
[0100]試驗結(jié)果見圖1 (圖1A、圖1B )，結(jié)果表明NaOH是最佳的變性劑。
[0101 ](二)不同變性試劑濃度對RNA5hmC檢測效果的影響
[0102]變性試劑采用他0!1，濃度設置為0.51、謹、21、41;
[0103]試驗方法為:
[0104]1、提取總RNA，并稀釋成濃度lOOng/yL。
[0105]2、加入等體積濃度分別為0.5M、IM、2M、4M的NaOH，4 V反應30分鐘。
[0106]3、取4X8硝酸纖維素膜，按順序滴加2yL樣品到膜上，常溫放置15分鐘。
[0107]4、將膜放置80 0C烤箱烘烤30分鐘。
[0108]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用I3BST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0109]6、用PBS溶液稀釋好的5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗3次，每次10分鐘。
[0110]7、用5 %牛奶稀釋好的特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0111]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0112]9、曝光后的NC膜用0.02%亞甲基藍溶液進行染色并拍照。
[0113]注:所有試劑溶液均用DEPC水配制。
[0114]試驗結(jié)果見圖1 (圖1C、圖1D)，結(jié)果表明2M的NaOH是變性的最佳濃度，如圖所示，濃度太大會使RNA發(fā)生降解，濃度太小又會導致甲基藍染色不清楚。
[0115]實施例3不同變性時間對RNA 5hmC檢測效果的影響
[0116]變性時間設置:3011^11、111、311、611、1211、2411、4811;
[0117]試驗方法為:
[0118]1、提取總RNA，并稀釋成濃度lOOng/yL。
[0119]2、加入等體積濃度為21的似0!1，4°(:反應一定時間(分別為301^11、111、311、611、1211、24h、48h)。
[0120]3、取4X8硝酸纖維素膜，按順序滴加2yL樣品到膜上，常溫放置15分鐘。
[0121 ]4、將膜放置80 °C烤箱烘烤30分鐘。
[0122]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用I3BST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0123]6、用PBS溶液稀釋好的5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗3次，每次10分鐘。
[0124]7、用5 %牛奶稀釋好的特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0125]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0126]9、曝光后的NC膜用0.02%亞甲基藍溶液進行染色并拍照。
[0127]注:所有試劑溶液均用DEPC水配制。
[0128]試驗見圖2，結(jié)果顯示在樣品與2MNa0H混合后，通過對不同的反應時間進行檢測后發(fā)現(xiàn)，變性30分鐘后實驗效果為最佳。
[0129]實施例4不同結(jié)合時間與烘干時間對RNA5hmC檢測效果的影響
[0130](一)不同結(jié)合時間對RNA5hmC檢測效果的影響
[0131]RNA與硝酸纖維素膜在常溫下放置時間設置:O、15、30、60min;
[0132]試驗方法為:
[0133]1、提取總RNA，并稀釋成濃度lOOng/yL。
[0134]2、加入等體積濃度為2M的NaOH，4°C反應30min。
[0135]3、取4X8硝酸纖維素膜，按順序滴加2yL樣品到膜上，常溫放置一定時間(分別為O、15、30、60min)。
[0136]4、將膜放置80 0C烤箱烘烤30分鐘。
[0137]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用I3BST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0138]6、用PBS溶液稀釋好的5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗3次，每次10分鐘。
[0139]7、用5 %牛奶稀釋好的特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0140]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0141]9、曝光后的NC膜用0.02%亞甲基藍溶液進行染色并拍照。
[0142]注:所有試劑溶液均用DEPC水配制。
[0143]結(jié)果見圖3(圖3A、圖3B)，通過對室溫下不同的結(jié)合時間進行試驗后發(fā)現(xiàn)，室溫下靜置15分鐘，實驗結(jié)果為最佳。
[0144](二)不同烘干時間對RNA 5hmC檢測效果的影響
[0145]烘干時間設置:O、15、30、60min;
[0146]試驗方法為:
[0147]1、提取總RNA，并稀釋成濃度lOOng/yL。
[0148]2、加入等體積濃度為2M的NaOH，4°C反應30min。
[0149]3、取4X8硝酸纖維素膜，按順序滴加2yL樣品到膜上，常溫放置15min。
[0150]4、將膜放置800C烤箱烘烤一定時間(分別為15min、30min、Ih、2h)。
[0151]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用I3BST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0152]6、用PBS溶液稀釋好的5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗3次，每次10分鐘。
[0153]7、用5 %牛奶稀釋好的特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0154]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0155]9、曝光后的NC膜用0.02 %亞甲基藍溶液進行染色并拍照。
[0156]注:所有試劑溶液均用DEPC水配制。
[0157]結(jié)果見圖3(圖3C、圖3D)，通過對80°C下不同的烘干時間進行試驗后發(fā)現(xiàn)，80°C烘干30分鐘實驗結(jié)果為最佳。
[0158]實施例5溶液配制用水對RNA 5hmC檢測效果的影響
[0159]試劑配制用水設置:DEPC水配制試劑與普通純水配制試劑;試劑指本實施例中所有需要用水配制的試劑；
[0160]試驗方法:
[0161]1、提取總RNA，并稀釋成濃度lOOng/yL。
[0162]2、加入等體積濃度為2M的NaOH，4°C反應30min。
[0163]3、取4X8硝酸纖維素膜，按順序滴加2yL樣品到膜上，常溫放置15min。
[0164]4、將膜放置800C烤箱烘烤一定時間(分別為15min、30min、Ih、2h)。
[0165]5、從80 °C取出后用5 %牛奶封閉，室溫反應I小時，然后用I3BST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0166]6、用PBS溶液稀釋好的5hmC抗體孵育NC膜，4°C反應過夜后PBST溶液洗3次，每次10分鐘。
[0167]7、用5 %牛奶稀釋好的特異性二抗孵育NC膜，室溫下反應I小時，然后用PBST溶液洗3次，每次1分鐘。
[0168]8、ECL顯影液顯影后，用X光片進行曝光。
[0169]9、曝光后的NC膜用0.02%亞甲基藍溶液進行染色并拍照。
[0170]結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示通過比較DEPC水配制所用試劑與普通純水配制試劑的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEPC水配制試劑所出的結(jié)果更好。
[0171]實施例6檢測實例
[0172]采用實施例1方法，對小鼠不同腦區(qū):腦干(BS)、海馬(Hipo)、下丘腦(Hypo)、杏仁核(Amy)、皮層(Ctx)、小腦(Cere)六個區(qū)域RNA5hmC的水平進行了檢測，結(jié)果見圖5。實驗證明本發(fā)明檢測方法既方便快捷又可靠實用，且靈敏度較高，完全可以適用于各類科研研究。
[0173]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法，其特征在于，包括: 步驟I:將總RNA與變性試劑混合，變性，獲得變性RNA; 步驟2:將所述變性RNA結(jié)合于硝酸纖維素膜上，烘干，封閉，獲得抗原膜片； 步驟3:將所述抗原膜片與5-羥甲基胞嘧啶抗體進行第一孵育，然后與酶標第二抗體進行第二孵育，顯影，獲得檢測結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述變性試劑為氫氧化鈉、甲醛或Tris-HCl03.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述變性試劑的濃度為0.5?4mol/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述變性的時間為0.5?48h，變性的溫度為O?10°C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟2中結(jié)合的時間不少于60mino6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟2中烘干的溫度為60?100°C，時間為0.25?2h。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第一孵育的溫度為O?10°C，時間為12?24h。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述第二孵育的溫度為15?30°C，時間為0.5?2h。9.一種RNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測試劑盒，其特征在于，包括試劑:RNA變性試劑、5-羥甲基胞嘧啶抗體、酶標第二抗體和顯影液。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑采用DEPC水配制。
【文檔編號】G01N33/544GK105891467SQ201610191996
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月30日
【發(fā)明人】徐興順, 苗志剛
【申請人】蘇州大學