基于微球的杯式時間分辨熒光mpo分析方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法及試劑盒；包括在檢測反應(yīng)杯內(nèi)表面包被MPO單抗或多抗；將時間分辨熒光微球與MPO單抗或多抗共價鍵交聯(lián)制備得到熒光標(biāo)記抗體；將待測MPO樣品加入包被后的檢測反應(yīng)杯內(nèi)，再加入所述熒光標(biāo)記抗體，25℃～40℃溫育；清洗去除未結(jié)合的抗原及熒光標(biāo)記抗體，在340～380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試檢測反應(yīng)杯中熒光信號；將所述熒光信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得所述待測MPO樣品的MPO濃度。本發(fā)明可以在較短的檢測時間內(nèi)完成檢測，縮短了檢測時間，并有效的提高了檢測靈敏度。
【專利說明】
基于微球的杯式時間分辨焚光MPO分析方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及MP0檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光MP0分 析方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴(yán)重疾病，已成為21世紀(jì)人類健康的頭號殺 手。2009年8月拜耳醫(yī)藥在歐洲心臟病學(xué)會年會上報道指出2005年全球約有1750萬人死于 心血管疾病，預(yù)計2015年這一數(shù)字將攀升到2000萬人，大約有一半病例發(fā)生在亞太地區(qū)。生 活條件的改善和生活方式的轉(zhuǎn)變，使中國人發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險迅速趕超美國等發(fā)達國 家。
[0003] 我國1990年城市居民心血管疾病死亡率為92/10萬人，2000年為106/10萬人，平均 每年死亡增長率為1.3%。2008年死亡率已達到121/10萬人，相比2000年時，平均死亡增長 率為1.4%，其中急性心肌梗塞的死亡率占到其中的三分之一，說明心肌梗塞死亡率仍呈不 斷增長趨勢。隨著中國人口老齡化趨勢，按平均死亡增長率為1.5%計算，到2015年，血管疾 病死亡率將達到141/10萬人，急性心肌梗塞的死亡率將達到47/10萬人。
[0004] 中國衛(wèi)生部2008年公布的急性心肌梗塞的死亡率為39.72/10萬人，每年急性心肌 梗塞的發(fā)病人數(shù)超過500萬人，至少有超過200萬的人群去醫(yī)院就醫(yī)進行心肌梗塞疾病的相 關(guān)檢測，這并不包含每年因胸痛懷疑為心肌梗塞的病人人數(shù)，實際醫(yī)院每年檢測人數(shù)已達 千萬人次。
[0005] 心肌梗塞的典型臨床癥狀是胸痛，心律失常，心力衰竭等。但實際臨床上胸痛的癥 狀表現(xiàn)復(fù)雜多樣，危險性差異也較大，還有心梗病人無典型癥狀。醫(yī)學(xué)上將急性心肌梗死發(fā) 病后6小時以內(nèi)作為搶救的"黃金時間"，超過這個時間段，治療效果就會大打折扣，甚至產(chǎn) 生嚴(yán)重后果危及生命。中華醫(yī)學(xué)檢驗分會2006年制定的"冠狀動脈疾病和心力衰竭時心臟 標(biāo)志物臨床檢測應(yīng)用建議"指出，適用于臨床的心臟標(biāo)記物應(yīng)具有較好的診斷、危險分層和 預(yù)后估計的價值，分析檢測方法應(yīng)特異、靈敏、快速，而且心臟標(biāo)志物的檢測周轉(zhuǎn)時間< 60min〇
[0006] 髓過氧化物酶(MP0)與冠狀動脈疾病密切相關(guān)。冠心病是心血管系統(tǒng)中最常見的 疾病，而動脈粥樣硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基礎(chǔ)。AS發(fā)病過程中通常出現(xiàn)氧化 低密度脂蛋白，進而巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)變成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的形成在AS的發(fā)生機制中 起關(guān)鍵作用。協(xié)和洛克研究發(fā)現(xiàn)MP0有促進AS病變形成的作用，MP0通過產(chǎn)生自由基和多種 反應(yīng)性物質(zhì)，促進斑塊形成和不穩(wěn)定性增加，加速AS進展，進而引起多種并發(fā)癥如急性冠脈 綜合征(ACS)。研究發(fā)現(xiàn)，MP0缺陷的個體罹患心血管疾病的危險性明顯下降。MP0水平的升 高不僅與患冠狀動脈疾病易感性相關(guān)，還可以預(yù)測早期患心肌梗死的危險性。
[0007] MP0促進ACS病變形成，并影響粥樣斑塊的穩(wěn)定性，通過增大氧化應(yīng)激而引起ACS。 研究表明，MP0是預(yù)測ACS患者發(fā)生不良心血管事件的一個新的預(yù)測因子，特別是在肌鈣蛋 白T (TnT)水平較低的患者，MP0能夠識別那些將來發(fā)生心血管事件危險性較高的患者。
[0008]傳統(tǒng)上MP0多用化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法或者熒光免疫層析法等方法測 定。化學(xué)發(fā)光法對技術(shù)要求高，操作步驟相對比較繁瑣，需要多步試劑添加過程。膠體金免 疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡便快速，便宜的優(yōu)勢，然而當(dāng)遇到某些樣品中抗原或抗體 含量極低時，膠體金的顏色將很淺甚至無顯色，很難用肉眼來判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈 敏度較低。熒光免疫層析法雖然靈敏度比膠體金免疫層析法要高，但是其檢測精密度并不 理想，靈敏度與大型化學(xué)發(fā)光或者電化學(xué)發(fā)光儀器仍有差距。
[0009] 時間分辨焚光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一種非同位素焚光標(biāo)記物， 與普通熒光相比，具有Stock位移大，熒光壽命長等特點，可以有效的避免樣品中的本底熒 光，以及激發(fā)光等雜散光的影響，因此相比普通熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。
[0010] 目前市面上采用時間分辨熒光檢測的試劑均采用解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖叻?析(DELFIA)，它采用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合物，使其一段與銪(Eu)連接，另一端與抗 體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)后形成免疫復(fù)合 物，由于這種復(fù)合物在水中的熒光強度非常弱，需要加入一種解離增強劑，使得銪離子從復(fù) 合物上解離下來，并與增強劑中的另一種螯合劑形成膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的 激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有熒光免疫層析法測定MP0檢測精密度不理想以及 時間分辨熒光檢測法需要解離增強過程，檢測步驟繁雜、時間長、精度差等不足，提供一種 基于微球的杯式時間分辨焚光MP0分析方法及試劑盒。該方法基于時間分辨焚光微球可高 靈敏度定量檢測MP0。
[0012] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0013]第一方面，本發(fā)明涉及一種基于微球的杯式時間分辨焚光MP0分析方法，所述方法 包括如下步驟：
[0014] S1、在檢測反應(yīng)杯內(nèi)表面包被針對MP0特定抗原識別位點的一個或多個抗體(所述 抗體為單克隆抗體或者多克隆抗體，或者多個抗體的組合形式；即，包被MP0單抗或者多 抗)；
[0015] S2、將時間分辨熒光微球與MP0單抗或者多抗通過共價鍵交聯(lián)制備得到熒光標(biāo)記 抗體；
[0016] S3、將待測MP0樣品加入步驟S1包被后的檢測反應(yīng)杯內(nèi)，再加入所述熒光標(biāo)記抗 體，25°C~40°C溫育；
[0017] S4、清洗去除未結(jié)合的抗原及焚光標(biāo)記抗體，在340~380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試檢 測反應(yīng)杯中熒光信號；
[0018] S5、將所述熒光信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得所述待測MP0樣品的MP0濃度。
[0019] 優(yōu)選的，所述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物。
[0020] 優(yōu)選的，所述鑭系元素螯合物為Eu (TTA) 3/T0P0或Eu(TTA) 3/Phen (其中TTA為噻吩 甲酰三氟丙酮(Thenoyltrif luoroacetone)，T0P0為三辛基氧化膦，Phen為鄰菲略啉）。
[0021 ]優(yōu)選的，所述時間分辨熒光微球的粒徑范圍為100~lOOOnrn。
[0022]優(yōu)選的，所述時間分辨熒光微球為前處理后的羧基時間分辨熒光微球;所述前處 理包括:加入MES、EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15~60min，加入MES、NHS 和EDC進行再次活化處理;每lmg羧基時間分辨熒光微球?qū)?yīng)10~lOOul 50mM氨基己酸。 [0023] 更優(yōu)選的，所述初次活化處理包括：每lmg羧基時間分辨熒光微球，加60ul500mM MES( 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸）緩沖液pH5.0~7.0，加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基丙基）-3_乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積400yL，室溫混勻15~30min;所述再次活化處 理包括:加入所述氨基己酸室溫混勾后，加lmLIOOmM MES pH6.0，15000rpm離心清洗10~ 25min，棄去上清；加400ul lOOmM MESpH5.0~7.0,超聲分離，加0.02~0.2mg N-羥基琥珀 酰亞胺(NHS)，加0.01 ~O.lmgEDC，室溫混勻 10~20min;加lmL lOOmM MES pH5.0~7.0緩沖 液，15000rpm離心清洗10~25min，棄去上清；100mM MES pH5.0~7.0緩沖液恢復(fù)到lml。 [0024]優(yōu)選的，步驟S2中，還包括將共價鍵交聯(lián)制備得到的熒光標(biāo)記抗體進行封閉、清洗 后用反應(yīng)緩沖液稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測用熒光標(biāo)記抗體的步驟;所述每1L反應(yīng) 緩沖液中含有50~200mM PB，1~5%酪蛋白，0.9~3%NaCl，0.5~2%PEG，0.02~2.0% tween 20，pH6.0~9.0。更優(yōu)選含有50mM PB，1%酪蛋白，0.9%NaCl，l%PEG，0.5%tween 20，pH7.2。
[0025] 優(yōu)選的，所述清洗采用的清洗液每1L含5~lOOmM PB，0.9~3%NaCl，0.02~1.0% Tween 20，pH6~9。更優(yōu)選含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0026]優(yōu)選的，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為系列濃度的MP0校準(zhǔn)品的MP0濃度與對應(yīng)的熒光信號的關(guān) 系曲線;該熒光信號為采用所述基于微球的杯式時間分辨熒光MP0分析方法測得的熒光信 號。
[0027] 第二方面，本發(fā)明涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光MP0分析試劑盒，所述試 劑盒包括檢測反應(yīng)杯、熒光標(biāo)記抗體和清洗液；
[0028] 所述檢測反應(yīng)杯內(nèi)表面包被MP0單抗或者多抗；
[0029] 所述熒光標(biāo)記抗體是由時間分辨熒光微球與MP0單抗或者多抗通過共價鍵交聯(lián)制 備而得；
[0030] 所述清洗液每 1L含5~lOOmM PB，0.9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，pH6~9〇
[0031] 更優(yōu)選含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.2。
[0032] 該試劑盒的檢測基礎(chǔ)是雙抗體夾心的免疫反應(yīng)。
[0033]所述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素化合物;較優(yōu)的，該鑭系元素螯合物為 銪螯合物;最優(yōu)的，該銪螯合物可為Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen。
[0034] 優(yōu)選的，所述時間分辨熒光微球粒徑范圍為100~lOOOnm。
[0035]第三方面，本發(fā)明涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光MP0分析試劑盒的制備 方法，包括以下步驟：
[0036] (1)檢測反應(yīng)杯的制備
[0037]采用MP0單抗或者多抗采用物理吸附的方式結(jié)合在反應(yīng)杯內(nèi)表面；
[0038] (2)熒光標(biāo)記抗體的制備
[0039]采用MP0的單抗或者多抗采用共價交聯(lián)的方式與熒光微球偶聯(lián)；
[0040] (3)清洗液配制
[0041]優(yōu)選的，所述偶聯(lián)具體為：每lml前處理后的羧基時間分辨熒光微球中加入 0. lmgMPO的單抗或者多抗，室溫混勾20~40min進行偶聯(lián)(即，共價鍵交聯(lián)）。
[0042] 優(yōu)選的，所述前處理包括:加入MES、NHS和EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室 溫混勻15~60min，加入MES、NHS和EDC進行再次活化處理;每lmg羧基時間分辨熒光微球?qū)?應(yīng)10~100ul 50mM氛基己酸。
[0043] 更優(yōu)選的，所述初次活化處理包括：每lmg羧基時間分辨熒光微球，加60ul500mM MES( 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸）緩沖液pH5.0~7.0，加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基丙基）-3_乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加0.3~0.4mg N-羥基琥珀酰亞胺，加純化水至終體積300yL，室 溫混勻15~30min;所述再次活化處理包括：加入所述氨基己酸室溫混勻后，加lmL 100mM MES pH6.0，15000rpm離心清洗 10~25min，棄去上清；加400ul 100mM MES pH6.0,超聲分 離，加0.02~0.2mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，加0.01~0. lmgEDC，室溫混勻10~20min。 [0044] 優(yōu)選的，所述前處理包括:每lmg羧基時間分辨熒光微球，加入60ul500mMpH6.0的 MES、0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、0.4mg N-羥基琥珀酰亞胺NHS， 加純化水至終體積300yL，室溫混勻活化10~20min。
[0045] 優(yōu)選的，步驟(2)中偶聯(lián)之后還包括將共價鍵交聯(lián)制備得到的熒光標(biāo)記抗體進行 封閉、清洗后用反應(yīng)緩沖液稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測用熒光標(biāo)記抗體的步驟;所 述每 1L反應(yīng)緩沖液中含有50mM PB，1%酪蛋白，0.9%NaCl，l%PEG，0.5%tween 20，pH7.2。
[0046] 第四方面，本發(fā)明涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光MP0分析試劑盒的使用 方法，包括將待測MP0樣品加入檢測反應(yīng)杯中，然后加入熒光標(biāo)記抗體，37°C溫育，用清洗液 清洗去除未結(jié)合的抗原及焚光標(biāo)記抗體，在340~380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試反應(yīng)杯中焚光 信號，檢測波長為600~630nm。
[0047] 本發(fā)明的方法將待測樣品中的抗原抗體反應(yīng)信息轉(zhuǎn)化成了另一種更為直觀的光 信號信息（熒光信號），利用該方法，經(jīng)過一系列的研究工作，可以獲得光子信號(熒光信號） 與待測抗原之間的對應(yīng)關(guān)系，進而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過對光子信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對或 者與陰陽性參考光子信號的比較檢測最終獲得待測抗原的定量或者定性檢測結(jié)果。
[0048] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0049] 1)熒光標(biāo)記物為時間分辨熒光乳膠微球，每個微球中填充了幾萬到幾十萬個稀土 元素離子螯合物，檢測過程中并不需要解離增強過程，便可發(fā)出很強的熒光，簡化了時間分 辨熒光檢測步驟，解離增強時間分辨熒光檢測往往需要1個小時左右時間才能得到檢測結(jié) 果，而采用時間分辨熒光微球作為標(biāo)記物，由于每個微球中填充了大量的鑭系元素螯合物， 熒光信號放大數(shù)千倍以上，因此可以在較短的檢測時間內(nèi)完成檢測，縮短了檢測時間，并有 效的提高了檢測靈敏度。
[0050] 2)熒光微?；罨^程中添加氨基己酸作為手臂，使得抗體與微球之間的距離增 加，有效的降低了空間位阻效應(yīng)，提高了檢測系統(tǒng)靈敏度。
[0051] 3)熒光免疫層析法，其特點檢測時間短，但其精密度不理想，受環(huán)境溫度影響較 大，且要手工操作，本發(fā)明采用基于微球的杯式時間分辨熒光分析，由于其超高的靈敏度， 其檢測時間并不比層析長，一方面易于實現(xiàn)自動化操作，另一方面反應(yīng)溫度均一，不受環(huán)境 因素影響，準(zhǔn)確性更好，精密度也優(yōu)于層析試劑。
【附圖說明】
[0052] 圖1為本發(fā)明的原理不意圖；
[0053] 圖2為MP0檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0054] 其中，1為焚光標(biāo)記抗體，2為MP0抗原，3為包被抗體，4為反應(yīng)杯固相表面，5為發(fā)光 免疫復(fù)合物。
【具體實施方式】
[0055] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員 進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0056] 本發(fā)明的原理示意圖如圖1所示，包被抗體3結(jié)合在反應(yīng)杯固相表面4上，在反應(yīng)杯 中添加一定量的樣品使得樣品中的MP0抗原2與反應(yīng)杯固相表面結(jié)合的抗體3結(jié)合，再加入 熒光標(biāo)記抗體1，溫育形成發(fā)光免疫復(fù)合物5,采用清洗液清洗反應(yīng)杯后去除未結(jié)合的抗原 及熒光標(biāo)記抗體，檢測反應(yīng)杯中的熒光信號，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比，得到待測樣本中MP0抗 原濃度。
[0057] 實施例1
[0058] 1、檢測反應(yīng)杯的制備
[0059] (1)檢測反應(yīng)杯包被
[0060]將 MP0 抗體 1703(Medix 公司）用 0.2M 磷酸緩沖液(pH7.8)稀釋成 10μg/ml，200yL/ 孔，37 °C包被2小時，洗板。
[0061 ] (2)檢測反應(yīng)杯封閉
[0062]用封閉緩沖液按300yL/孔加入反應(yīng)杯，37°C封閉2小時，棄去包被反應(yīng)杯中的封閉 液，拍干。
[0063] (3)檢測反應(yīng)杯干燥
[0064] 將上述封閉好的反應(yīng)杯放置于濕度低于30 %的37 °C干燥箱中烘干4小時，密封干 燥保存。
[0065] 2、熒光標(biāo)記抗體的制備 [0066] (1)熒光微粒前處理
[0067]取111^羧基時間分辨焚光微球（30〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積400此，室溫混勻15min。加100ul 50mM氨基己酸，室 溫混勾30min。加lmL 100mM MES pH6.0,離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清。加400ul 100mM MES pH6.0,超聲分離，加0.2mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)，加O.lmgEDC，室溫混勻 15min。加lmL lOOmMMES pH6.0緩沖液，離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清。100mM MES pH6.0緩沖液恢復(fù)到lml。
[0068] (2)抗體交聯(lián)
[0069]加O.lmg MP0單克隆抗體 1701(Medix公司），室溫25。(：混勻30min。
[0070] (3)封閉
[0071] 加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0072] (4)清洗
[0073] 加3mL交聯(lián)緩沖液（100mM MES pH6.0)，25000rpm離心清洗30min，棄去上清。加 500ul交聯(lián)緩沖液(lOOmM MES pH6.0)，超聲分離，終濃度2mg/ml。
[0074] (5)工作用熒光標(biāo)記抗體配制
[0075] 配制反應(yīng)緩沖液:緩沖液1L中含有50mM PB，1 %酪蛋白，0.9 % NaCl，1 % PEG，0.5 % tween 20，pH7.2。
[0076]用反應(yīng)緩沖液將上述清洗好的熒光標(biāo)記抗體稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測 用熒光標(biāo)記抗體。
[0077] 3、清洗液的配制
[0078] 配制清洗緩沖液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0079] 4、MP0 檢測 [0080] (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
[0081]采用上述方法制備的試劑組合成MP0時間分辨熒光定量試劑盒，測定校準(zhǔn)品，每個 濃度重復(fù)10次。
[0082]每個檢測中加入校準(zhǔn)品10此，熒光標(biāo)記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進行讀數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)如表1所示，標(biāo) 準(zhǔn)曲線如圖2所示。
[0083] 由圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線我們可以看到，該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，可以通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣 本中所含的MP0濃度進行定量分析。
[0084] 通過表1結(jié)果可知，檢測試劑盒的批內(nèi)精密度良好，校準(zhǔn)品各濃度點熒光信號精密 度均小于10% (除0值以外），且試劑靈敏度良好，在0.1ng/ml水平與0值校準(zhǔn)品有顯著區(qū)分。 [0085] 表1 MP0定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
[0087] (2)樣本測試
[0088]采用上述方法制備的試劑組合成MP0時間分辨熒光定量試劑盒，測定高低濃度質(zhì) 控品，每個濃度做10次。
[0089] 每個檢測中加入樣品10yL，熒光標(biāo)記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測杯， 在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進行讀數(shù)，將測試結(jié)果帶入圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線，計 算樣品測試濃度，測試結(jié)果如表2所示，檢測結(jié)果顯示試劑精密度良好。
[0090] 表2質(zhì)控品測試結(jié)果

[0093] 實施例2
[0094] (1)檢測反應(yīng)杯包被
[0095]將 MP0 抗體 1703(Medix 公司）用0.2M 磷酸緩沖液(pH7.8)稀釋成 10μg/ml，200yL/ 孔，37 °C包被2小時，洗板。
[0096] (2)檢測反應(yīng)杯封閉
[0097]用封閉緩沖液按300yL/孔加入反應(yīng)杯，37°C封閉2小時，棄去包被反應(yīng)杯中的封閉 液，拍干。
[0098] (3)檢測反應(yīng)杯干燥
[0099] 將上述封閉好的反應(yīng)杯放置于濕度低于30 %的37 °C干燥箱中烘干4小時，密封干 燥保存。
[0100] 2、熒光標(biāo)記抗體的制備
[0101] (1)熒光微粒前處理
[0102]取111^羧基時間分辨焚光微球（30〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加0.4mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，40yL，10mg/mL)，加純化水至終體積 400yL，室溫23°C混勻 15min。加lmL lOOmMMES pH6.0緩沖液，15000rpm離心清洗20min，棄去 上清，100mM MES pH6.0緩沖液恢復(fù)到lml。
[0103] (2)抗體交聯(lián)
[0104] 加O.lmg MP0單克隆抗體1701(Medix公司），室溫25°C混勻30min。
[0105] (3)封閉
[0106] 加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0107] (4)清洗
[0108] 加3mL交聯(lián)緩沖液（100mM MES pH6.0)，25000rpm離心清洗30min，棄去上清。加 500ul交聯(lián)緩沖液(100mM MES pH6.0)，超聲分離，終濃度2mg/ml。
[0109] (5)工作用熒光標(biāo)記抗體配制
[0110] 配制反應(yīng)緩沖液:緩沖液1L中含有50mM PB，1%酪蛋白，0.9%NaCl，l%PEG，0.5% tween 20,pH7.2。 用反應(yīng)緩沖液將上述清洗好的熒光標(biāo)記抗體稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測 用熒光標(biāo)記抗體。
[0112] 3、清洗液的配制
[0113] 配制清洗緩沖液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0114] 4、校準(zhǔn)品測試
[0115] 采用上述方法制備的試劑組合成MP0時間分辨熒光定量試劑盒，測定校準(zhǔn)品，每個 濃度重復(fù)10次。
[0116] 每個檢測中加入校準(zhǔn)品10此，熒光標(biāo)記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進行讀數(shù)。
[0117]通過表3結(jié)果可知，檢測試劑盒的批內(nèi)精密度良好，校準(zhǔn)品各濃度點熒光信號精密 度均小于10% (除0和0.1ng/ml水平以外），試劑靈敏度相比實施例1來說有所降低，僅在 lng/ml水平與0值校準(zhǔn)品有較為顯著區(qū)分。說明熒光微粒前處理過程中通過添加手臂的方 式能有有效的提升檢測的靈敏度。
[0118]表3 MP0定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
【主權(quán)項】
1. 一種基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： 51、 在檢測反應(yīng)杯內(nèi)表面包被MPO單抗或者多抗； 52、 將時間分辨熒光微球與MPO單抗或者多抗通過共價鍵交聯(lián)制備得到熒光標(biāo)記抗體； 53、 將待測MPO樣品加入步驟Sl包被后的檢測反應(yīng)杯內(nèi)，再加入所述熒光標(biāo)記抗體，25 。(:~40 °C溫育； 54、 清洗去除未結(jié)合的抗原及焚光標(biāo)記抗體，在340~380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試檢測反 應(yīng)杯中熒光信號，檢測波長為600~630nm; 55、 將所述熒光信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得所述待測MPO樣品的MPO濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法，其特征在于，所 述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法，其特征在于，所 述鑭系元素螯合物為Eu (TTA) 3/T0P0或Eu (TTA) 3/Phen。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法，其特征在于，所 述時間分辨熒光微球的粒徑范圍為100~1000 nm。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的基于微球的杯式時間分辨焚光MPO分析方法，其 特征在于，所述時間分辨焚光微球為前處理后的羧基時間分辨焚光微球;所述前處理包括： 加入MES、EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15~60min，加入MES、NHS和EDC進 行再次活化處理;每Img羧基時間分辨熒光微球?qū)?yīng)10~IOOul 50mM氨基己酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于微球的杯式時間分辨焚光M P 0分析方法，其特征在于，所 述初次活化處理包括：每Img羧基時間分辨熒光微球，加60ul 500mM MES緩沖液pH5.0~ 7.0，加0.02~0.2mgEDC，加純化水至終體積400yL，室溫混勻15~30min;所述再次活化處理 包括:加入所述氨基己酸室溫混勻后，加 ImLlOOmM MES pH5.0~7.0，15000rpm離心清洗10 ~25min，棄去上清；加400ul IOOmM MES ρΗ5·0~7.0,超聲分離，加0.02~0.2mg NHS，加 0·01~0·lmgEDC，室溫混勻10~20min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法，其特征在于，步 驟S2中，還包括將共價鍵交聯(lián)制備得到的熒光標(biāo)記抗體進行封閉、清洗后用反應(yīng)緩沖液稀 釋到終濃度50μg/ml，作為檢測用熒光標(biāo)記抗體的步驟;所述每IL反應(yīng)緩沖液中含有50~ 200mM PB，1 ~5%酪蛋白，0.9~3%NaCl，0.5~2%PEG，0.02~2.0%tween 20，ρΗ6·0~ 9 · 0 〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法，其特征在于，所 述清洗采用的清洗液每IL含5~IOOmM ΡΒ，0·9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，ρΗ6~9。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析方法，其特征在于，所 述標(biāo)準(zhǔn)曲線為系列濃度的MPO校準(zhǔn)品的MPO濃度與對應(yīng)的熒光信號的關(guān)系曲線;該熒光信號 為米用所述基于微球的杯式時間分辨焚光MPO分析方法測得的焚光信號。10. -種基于微球的杯式時間分辨熒光MPO分析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 檢測反應(yīng)杯、熒光標(biāo)記抗體和清洗液； 所述檢測反應(yīng)杯內(nèi)表面包被MPO單抗或者多抗； 所述熒光標(biāo)記抗體是由時間分辨熒光微球與MPO單抗或者多抗通過共價鍵交聯(lián)制備而 得； 所述清洗液每IL含5~IOOmM PB，0.9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，pH6~9。
【文檔編號】G01N33/573GK105891477SQ201610210093
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】石曉強, 徐建新, 李福剛, 周奕璇, 楊晶
【申請人】上海奧普生物醫(yī)藥有限公司