稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，包括黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，采用乙腈∶水為1∶1的提取體系，并在提取體系中加入復(fù)合型鹽析試劑，所述的復(fù)合型鹽析試劑包括氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、醋酸?醋酸鈉緩沖溶液，采用中性氧化鋁作為凈化劑。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、高效，樣品提取和凈化簡(jiǎn)單，可批量測(cè)定，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)成本低，樣品提取和凈化用到的試劑和耗材均為實(shí)驗(yàn)室日常常見(jiàn)耗材，需要的有機(jī)試劑和有毒試劑少，大大減少了對(duì)操作人員和環(huán)境的污染，與液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜配置使用可實(shí)現(xiàn)稻米中四種毒素的快速、同時(shí)檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】
稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]真菌毒素是產(chǎn)毒真菌分泌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人和動(dòng)物都有極大危害，農(nóng)產(chǎn)品中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的真菌毒素有很多，其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2011限量規(guī)定的真菌毒素有:黃曲霉毒素仏、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇四種；目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GBT18979-2003,GBT 5009.209-2008,GBT 23502-2009,GBT 23503-2009)檢測(cè)方法對(duì)四種真菌毒素的提取方法不一樣，不能同時(shí)提取四種毒素;另外，現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于樣品提取的方法，大多采用采用乙腈/甲醇:水(84:16或者80:20)的提取體系，而且乙腈或甲醇和水是同時(shí)加入的，有機(jī)試劑用量遠(yuǎn)高于水的用量;現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或者已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)，對(duì)于樣品中的毒素提取后需要過(guò)免疫親和柱凈化并進(jìn)行濃縮，用免疫親和柱凈化樣品主要是去除樣品提取溶液中的蛋白質(zhì)和脂肪酸等雜質(zhì)，但成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素的提取中耗用較多有機(jī)物，環(huán)保要求高，以及凈化成本高的不足，提供一種有機(jī)物用量少，對(duì)環(huán)境友好，簡(jiǎn)便、高效，檢測(cè)的穩(wěn)定性和精度較高，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)成本低的稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，包括黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，采用乙腈:水為1:1的提取體系，并在提取體系中加入復(fù)合型鹽析試劑，所述的復(fù)合型鹽析試劑包括氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，采用中性氧化鋁作為凈化劑。
[0005]作為優(yōu)選，包括如下步驟:I)取5.0-10.0g粉碎的均勻試樣于50mL離心管中，加入10.0-20.0mL水，充分浸濕;2)充分浸濕之后加入10.0-20.0mL乙腈，在搖床上振搖I小時(shí)；3)加入5-10g無(wú)水硫酸鎂、l-2g氯化鈉和1.5-3.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH = 3.6)，用手劇烈振搖Imin; 4)將離心管溶液以4000轉(zhuǎn)/分速度離心5min，使乙腈和水相分層;5)移取2.0mL上清液，加入10mg中性氧化招，用手劇烈振搖Imin，并以4000轉(zhuǎn)/分速度離心5min; 6)準(zhǔn)確吸取1.0mL凈化后的上清液，定容至10.0mL，進(jìn)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。將稻米粉碎后提取適量的試樣(樣品)進(jìn)行測(cè)試，本方案提取體系是乙腈:水是50:50，而且水是提前加入的，相比現(xiàn)有的提取體系，本方案的優(yōu)點(diǎn)一是所用有機(jī)試劑少，檢測(cè)成本低，對(duì)環(huán)境友好，二是提前加水并充分浸濕樣品，有利于增加毒素測(cè)定的回收率;復(fù)合型的鹽析試劑(氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液)，其作用一是氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂及酸性的醋酸-醋酸緩沖溶液可以沉淀樣品中的主要干擾物質(zhì)如蛋白質(zhì)，二是用醋酸讓樣品中的脂肪酸變?yōu)樗嵝灾舅?，三是讓乙腈與水分層，四是讓樣品中的真菌毒素分配到乙腈層中，達(dá)到完全提取樣品中真菌毒素的目的；中性氧化鋁用以吸附試樣提取液(上層乙腈)中的酸性脂肪酸；用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)即用免疫親和柱凈化樣品，成本較高，通常測(cè)定一個(gè)樣品中的4個(gè)毒素，需要800元以上，本方案的提取、凈化方法，檢測(cè)成本不超過(guò)50元，檢測(cè)效率比過(guò)去提高約3倍，整個(gè)測(cè)定時(shí)間約需90分鐘/樣，而其他傳統(tǒng)方法測(cè)定四種真菌毒素需要4-5小時(shí)。
[0006]作為優(yōu)選，所述的步驟I中加入的水、步驟2中加入的乙腈與試樣的體積質(zhì)量比均為 2:1。
[0007]作為優(yōu)選，所述的步驟3中加入的無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉的質(zhì)量比為5:1。
[0008]作為優(yōu)選，所述的步驟3中加入的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的pH值為3.6。
[0009]作為優(yōu)選，所述步驟5中加入的中性氧化鋁與移取上清液的質(zhì)量體積比為50:1。
[0010]作為優(yōu)選，所述的步驟6中獲得的上清液，用甲醇甲酸混合液定容至10.0mL后用
0.22μπι有機(jī)濾膜過(guò)濾然后進(jìn)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，所述的甲醇甲酸混合液中甲醇與甲酸的比例為40:60，其中甲酸為0.1 %甲酸溶液。
[0011]因此，本發(fā)明具有如下有益效果:(I)操作簡(jiǎn)便、高效，樣品提取和凈化簡(jiǎn)單，可批量測(cè)定，檢測(cè)時(shí)間短；(2)檢測(cè)成本低，樣品提取和凈化用到的試劑和耗材均為實(shí)驗(yàn)室曰常常見(jiàn)耗材；(3)需要的有機(jī)試劑和有毒試劑少，大大減少了對(duì)操作人員和環(huán)境的污染；(4)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜配置使用可實(shí)現(xiàn)稻米中四種毒素的快速、同時(shí)檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0013]稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，包括黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素Α、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，采用乙腈:水為1:1的提取體系，并在提取體系中加入復(fù)合型鹽析試劑，復(fù)合型鹽析試劑包括氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，采用中性氧化鋁作為凈化劑；
[0014]具體實(shí)施過(guò)程是，包括如下步驟:
[0015]I)取6.0g粉碎的均勾試樣于50mL離心管中，加入12.0mL水，充分浸濕；
[0016]2)充分浸濕之后加入12.0mL乙腈，在搖床上振搖I小時(shí)；
[0017]3)加入6g無(wú)水硫酸鎂、I.2g氯化鈉和I.8mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH= 3.6)，用手劇烈振搖lmin;
[0018]4)將離心管溶液以4000轉(zhuǎn)/分速度離心5min，使乙腈和水相分層；
[0019]5)移取2.0mL上清液，加入10mg中性氧化鋁，用手劇烈振搖lmin，并以4000轉(zhuǎn)/分速度離心5min;
[0020]6)準(zhǔn)確吸取1.0mL凈化后的上清液，用甲醇+ 0.1 %甲酸溶液(40+60 )定容至
10.0mL，再用0.22μπι有機(jī)濾膜過(guò)濾后，進(jìn)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定；
[0021]其中，步驟I中加入的水、步驟2中加入的乙腈與試樣的體積質(zhì)量比均為2:1，步驟3中加入的無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉的質(zhì)量比為5:1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，包括黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，其特征在于，采用乙腈:水為1:1的提取體系，并在提取體系中加入復(fù)合型鹽析試劑，所述的復(fù)合型鹽析試劑包括氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，采用中性氧化鋁作為凈化劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，其特征是，包括如下步驟:I)取5.0-10.0g粉碎的均勻試樣于50mL離心管中，加入10.0-20.0mL水，充分浸濕;2)充分浸濕之后加入10.0-20.0mL乙腈，在搖床上振搖I小時(shí);3)加入5_10g無(wú)水硫酸鎂、l_2g氯化鈉和1.5-3.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，用手劇烈振搖lmin;4)將離心管溶液以4000轉(zhuǎn)/分速度離心5min，使乙腈和水相分層； 5)移取2.0mL上清液，加入10mg中性氧化鋁，用手劇烈振搖lmin，并以4000轉(zhuǎn)/分速度離心5min;6)準(zhǔn)確吸取1.0mL凈化后的上清液，定容至10.0mL，進(jìn)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，其特征是，所述的步驟I中加入的水、步驟2中加入的乙腈與試樣的體積質(zhì)量比均為2:1。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，其特征是，所述的步驟3中加入的無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉的質(zhì)量比為5:1。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，其特征是，所述的步驟3中加入的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的pH值為3.6。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，其特征是，所述步驟5中加入的中性氧化鋁與移取上清液的質(zhì)量體積比為50:1。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的稻米中四種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化方法，其特征是，所述的步驟6中獲得的上清液，用甲醇甲酸混合液定容至10.0mL后用0.22μπι有機(jī)濾膜過(guò)濾然后進(jìn)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，所述的甲醇甲酸混合液中甲醇與甲酸的比例為40:60，其中甲酸為0.1 %甲酸溶液。
【文檔編號(hào)】G01N30/14GK105911191SQ201610352218
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】牟仁祥, 曹趙云, 陳銘學(xué), 朱智偉, 孫偉華, 楊歡
【申請(qǐng)人】中國(guó)水稻研究所