一種基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，特別涉及一種基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒及其制備方法和應(yīng)用,該試劑盒由檢測反應(yīng)杯、熒光標(biāo)記抗體及清洗液組成。在具體檢測時(shí)，先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測樣品加入檢測反應(yīng)杯內(nèi)，再加入熒光標(biāo)記抗體，30℃?40℃溫育，用清洗液清洗去除未結(jié)合的抗原及熒光標(biāo)記抗體；然后將熒光信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得所述待測樣品的肌酸激酶同工酶濃度。所述肌酸激酶同工酶的檢測方法，由于其超高的靈敏度，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，而且反應(yīng)溫度均一，不受環(huán)境因素影響，準(zhǔn)確性更好，精密度也非常優(yōu)異。
【專利說明】
一種基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑 盒及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，特別涉及一種基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸 激酶同工酶分析試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴(yán)重疾病，已成為21世紀(jì)人類健康的頭號殺 手。2009年8月拜耳醫(yī)藥在歐洲心臟病學(xué)會(huì)年會(huì)上報(bào)道指出2005年全球約有1750萬人死于 心血管疾病，預(yù)計(jì)2015年這一數(shù)字將攀升到2000萬人，大約有一半病例發(fā)生在亞太地區(qū)。生 活條件的改善和生活方式的轉(zhuǎn)變，使中國人發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)迅速趕超美國等發(fā)達(dá)國 家。
[0003] 我國1990年城市居民心血管疾病死亡率為92/10萬人，2000年為106/10萬人，平均 每年死亡增長率為1.3%。2008年死亡率已達(dá)到121/10萬人，相比2000年時(shí)，平均死亡增長 率為1.4%，其中急性心肌梗塞的死亡率占到其中的三分之一，說明心肌梗塞死亡率仍呈不 斷增長趨勢。隨著中國人口老齡化趨勢，按平均死亡增長率為1.5%計(jì)算，到2015年，血管疾 病死亡率將達(dá)到141/10萬人，急性心肌梗塞的死亡率將達(dá)到47/10萬人。
[0004] 中國衛(wèi)生部2008年公布的急性心肌梗塞的死亡率為39.72/10萬人，每年急性心肌 梗塞的發(fā)病人數(shù)超過500萬人，至少有超過200萬的人群去醫(yī)院就醫(yī)進(jìn)行心肌梗塞疾病的相 關(guān)檢測，這并不包含每年因胸痛懷疑為心肌梗塞的病人人數(shù)，實(shí)際醫(yī)院每年檢測人數(shù)已達(dá) 千萬人次。
[0005] 心肌梗塞的典型臨床癥狀是胸痛，心律失常，心力衰竭等。但實(shí)際臨床上胸痛的癥 狀表現(xiàn)復(fù)雜多樣，危險(xiǎn)性差異也較大，還有心梗病人無典型癥狀。醫(yī)學(xué)上將急性心肌梗死發(fā) 病后6小時(shí)以內(nèi)作為搶救的"黃金時(shí)間"，超過這個(gè)時(shí)間段，治療效果就會(huì)大打折扣，甚至產(chǎn) 生嚴(yán)重后果危及生命。中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)分會(huì)2006年制定的"冠狀動(dòng)脈疾病和心力衰竭時(shí)心臟 標(biāo)志物臨床檢測應(yīng)用建議"指出，適用于臨床的心臟標(biāo)記物應(yīng)具有較好的診斷、危險(xiǎn)分層和 預(yù)后估計(jì)的價(jià)值，分析檢測方法應(yīng)特異、靈敏、快速，而且心臟標(biāo)志物的檢測周轉(zhuǎn)時(shí)間< 60min〇
[0006] 肌酸激酶同工酶(CK-MB)是一種中晚期心肌標(biāo)志物，在臨床診斷中有十分重要的 意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發(fā)生時(shí)，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，認(rèn) 為在心肌梗塞的診斷中測定肌酸激酶的活性比做心電圖更為可靠。心肌梗死時(shí)，肌酸激酶 在起病6小時(shí)內(nèi)升高，24小時(shí)達(dá)高峰，3-4日內(nèi)恢復(fù)正常。肌酸激酶因其具有重要的生理功能 和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。
[0007]傳統(tǒng)上CK-MB多用化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法或者熒光免疫層析法等方法測 定?；瘜W(xué)發(fā)光法對技術(shù)要求高，操作步驟相對比較繁瑣，需要多步試劑添加過程。膠體金免 疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡便快速，便宜的優(yōu)勢，然而當(dāng)遇到某些樣品中抗原或抗體 含量極低時(shí)，膠體金的顏色將很淺甚至無顯色，很難用肉眼來判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈 敏度較低。熒光免疫層析法雖然靈敏度比膠體金免疫層析法要高，但是其檢測精密度并不 理想，靈敏度與大型化學(xué)發(fā)光或者電化學(xué)發(fā)光儀器仍有差距。
[0008] 時(shí)間分辨焚光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一種非同位素焚光標(biāo)記物， 與普通熒光相比，具有Stock位移大，熒光壽命長等特點(diǎn)，可以有效的避免樣品中的本底熒 光，以及激發(fā)光等雜散光的影響，因此相比普通熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。
[0009] 目前市面上采用時(shí)間分辨熒光檢測的試劑均采用解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻?析(DELFIA)，它采用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合物，使其一段與銪(Eu)連接，另一端與抗 體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)后形成免疫復(fù)合 物，由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，需要加入一種解離增強(qiáng)劑，使得銪離子從復(fù) 合物上解離下來，并與增強(qiáng)劑中的另一種螯合劑形成膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的 激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種基于微球的杯式時(shí)間分辨焚光肌酸激酶同工酶分析試 劑盒，該試劑盒能在較短的檢測時(shí)間內(nèi)完成肌酸激酶同工酶的檢測，檢測時(shí)間短，檢測靈敏 度高。
[0011] 本發(fā)明還提供了基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒的制 備方法。
[0012] 本發(fā)明還提供了基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶的檢測方法。
[0013] 為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)效果，本發(fā)明是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0014] -種基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒，其特征在于：該 試劑盒由檢測反應(yīng)杯、熒光標(biāo)記抗體及清洗液組成;該試劑盒的檢測基礎(chǔ)是雙抗體夾心的 免疫反應(yīng)。
[0015] 所述檢測反應(yīng)杯的固相表面包被有肌酸激酶同工酶單克隆抗體或多克隆抗體；
[0016] 所述熒光標(biāo)記抗體為時(shí)間分辨熒光微球與肌酸激酶同工酶單克隆抗體或多克隆 抗體通過共價(jià)鍵交聯(lián)。
[0017] 所述時(shí)間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物，其粒徑為100-1000nm。優(yōu)選的， 所述鑭系元素螯合物為銪螯合物。進(jìn)一步優(yōu)選的，該銪螯合物為Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA) 3/Phen〇
[0018] 上述基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒的制備方法，其步 驟包括，
[0019] (1)、檢測反應(yīng)杯的制備:將肌酸激酶同工酶單克隆抗體或多克隆抗體稀釋后37°C 包被，并用封閉緩沖液封閉、拍干;置于37°C的干燥箱中烘干、密封保存；
[0020] 優(yōu)選的，將肌酸激酶同工酶單克隆抗體或多克隆抗體用〇.2mol/L的磷酸緩沖液稀 釋至40yg/mL，100yL/孔，37 °C包被4小時(shí)，并用封閉緩沖液按300yL/孔加入反應(yīng)杯，37 °C封 閉4小時(shí)，棄去包被反應(yīng)杯中的封閉液，拍干，置于37°C的干燥箱中烘干、密封保存；
[0021] (2)、熒光標(biāo)記抗體的制備:將時(shí)間分辨熒光微球活化;然后加入肌酸激酶同工酶 單克隆抗體或多克隆抗體混勻、封閉、清洗，并用反應(yīng)緩沖液稀釋，獲得終濃度到20-50yg/ mL的熒光標(biāo)記抗體；
[0022] (3)清洗液的制備:該清洗液中含有TO，NaCl，Tween 20，該清洗液的pH值為7-9。優(yōu) 選的，清洗液中含有5mmol/L的PB，0.9 % NaCl，0.05 % Tween 20，該清洗液的pH值為7.2。
[0023] 所述步驟(2)中，時(shí)間分辨熒光微球活化的步驟為，在羧基時(shí)間分辨熒光微球中加 入MES和EDC進(jìn)行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15-60min，加入MES、NHS和EDC進(jìn)行 再次活化處理;每lmg羧基時(shí)間分辨焚光微球?qū)?yīng)lO-lOOyL 50mmol/L氨基己酸。
[0024] 優(yōu)選的，所述初次活化處理包括:每lmg羧基時(shí)間分辨熒光微球，加60yL500mm〇l/L pH5.0-7.0的MES，0.02-0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽，加純化水至 終體積600yL，室溫混勻15~60min;
[0025] 所述再次活化處理包括：加入所述氨基己酸室溫混勻后，加lmL 100mm〇l/L的MES pH6 ? 0，離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清；加400tiL的 100mmol/L的MES pH6 ? 0，超聲分離， 加0.02-0.211^1羥基琥珀酰亞胺，加0.01-0.111^0(：，室溫混勻15111111;加11^100臟〇1/1的 MES pH5.0-7.0緩沖液，離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清；100mmol/L MES pH5.0-7.0緩 沖液恢復(fù)到lmL。熒光微粒活化過程中添加氨基己酸作為手臂，使得抗體與微球之間的距離 增加，有效的降低了空間位阻效應(yīng)，提高了檢測系統(tǒng)靈敏度。
[0026] 上述基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶的檢測方法，其步驟包括，
[0027] (A)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試 劑盒測定不同濃度的校準(zhǔn)品，并根據(jù)熒光讀數(shù)儀上的熒光信號值，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)， 以熒光信號值為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0028] (B)、將待測樣品加入檢測反應(yīng)杯內(nèi)，再加入熒光標(biāo)記抗體，30°C-4(TC溫育，用清 洗液清洗去除未結(jié)合的抗原及熒光標(biāo)記抗體；
[0029] (C)在340-380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試檢測反應(yīng)杯中熒光信號，檢測波長為600- 630nm；
[0030] (D)將所述熒光信號與步驟(A)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得所述待測樣品的肌酸激酶 同工酶濃度。
[0031] 所述步驟(A)中，濃度為為0、0.5、2、5、10、25、50、1001^/11^的校準(zhǔn)品中加入熒光標(biāo) 記抗體，37°C溫育5-25min，然后用清洗液清洗去除未結(jié)合的抗原及熒光標(biāo)記抗體，所述校 準(zhǔn)品與熒光標(biāo)記抗體的體積比為1:4-6。
[0032] 所述步驟(B)中，待測樣品與熒光標(biāo)記抗的體積比為1:4-6,溫育溫度為37°C。
[0033]本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 1)本發(fā)明所制備的熒光標(biāo)記物為時(shí)間分辨熒光乳膠微球，每個(gè)微球中填充了幾萬 到幾十萬個(gè)稀土元素離子螯合物，檢測過程中并不需要解離增強(qiáng)過程，便可發(fā)出很強(qiáng)的熒 光，簡化了時(shí)間分辨熒光檢測步驟，解離增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光檢測往往需要1個(gè)小時(shí)左右時(shí)間 才能得到檢測結(jié)果，而采用時(shí)間分辨熒光微球作為標(biāo)記物，由于每個(gè)微球中填充了大量的 鑭系元素螯合物，熒光信號放大數(shù)千倍以上，因此可以在5-20分鐘的檢測時(shí)間內(nèi)完成檢測， 縮短了檢測時(shí)間，并有效的提高了檢測靈敏度。
[0035] 2)熒光微粒活化過程中添加氨基己酸作為手臂，使得抗體與微球之間的距離增 加，有效的降低了空間位阻效應(yīng)，提高了檢測系統(tǒng)靈敏度。
[0036] 3)本發(fā)明提供的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶的檢測方法，由于 其超高的靈敏度，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，而且反應(yīng)溫度均一，不受環(huán)境因素影響，準(zhǔn)確性更 好，精密度也非常優(yōu)異。
【附圖說明】
[0037]圖1是本發(fā)明的原理示意圖。
[0038] 圖2是本發(fā)明根據(jù)熒光讀數(shù)儀上的熒光信號值，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以熒光信 號值為縱坐標(biāo)，繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039] 圖3是采用實(shí)施例1中制備的試劑組合成肌酸激酶同工酶時(shí)間分辨熒光定量試劑 盒，測定臨床樣本，與化學(xué)發(fā)光臨床樣本測試結(jié)果的對比結(jié)果圖。
[0040] 圖1中：1為熒光標(biāo)記抗體，2為肌酸激酶同工酶抗原，3為包被抗體，4為反應(yīng)杯固相 表面，5為光免疫復(fù)合物。
【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0042] 實(shí)驗(yàn)所用到的設(shè)備:PerkinElmer公司的Victor X4多功能酶標(biāo)儀。
[0043] 本發(fā)明的原理示意圖如圖1所示，包被抗體3結(jié)合在反應(yīng)杯固相表面4上，在反應(yīng)杯 中添加一定量的樣品使得樣品中的肌酸激酶同工酶抗原2與反應(yīng)杯固相表面結(jié)合的抗體3 結(jié)合，再加入熒光標(biāo)記抗體1，溫育形成發(fā)光免疫復(fù)合物5,采用清洗液清洗反應(yīng)杯后去除未 結(jié)合的抗原及熒光標(biāo)記抗體，檢測反應(yīng)杯中的熒光信號，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，得到待測樣 本中肌酸激酶同工酶的濃度。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] (1)、檢測反應(yīng)杯的制備：
[0046] A、檢測反應(yīng)杯包被:肌酸激酶同工酶抗體7501(Medix公司）用0.2mol/L的磷酸緩 沖液(PH7.8)稀釋成40μg/ml，1 OOyL/孔，37 °C包被4小時(shí)，洗板。
[0047] B、檢測反應(yīng)杯封閉：用封閉緩沖液按200yL/孔加入反應(yīng)杯，37°C封閉4小時(shí)，棄去 包被反應(yīng)杯中的封閉液，拍干。
[0048] C、檢測反應(yīng)杯干燥:將上述封閉好的反應(yīng)杯放置于濕度低于30%的37°C干燥箱中 烘干8小時(shí)，密封干燥保存。
[0049] (2)、熒光標(biāo)記抗體的制備：
[0050] A、熒光微?；罨?br>[0051 ]取111^羧基時(shí)間分辨焚光微球（20〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加60此 500mmol/L的MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_ 乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積600此，室溫混勻15min。加100yL 50mmol/L 氨基己酸，室溫混勾30min。加lmL 100mmol/LMES pH6.0,離心清洗15000rpm 20min，棄去上 清。加400liL 100mmol/L MES pH6.0,超聲分離，加0.2mg N-羥基琥I自酰亞胺（NHS)，加 O.lmgEDC，室溫混勾 15min。加lmL 100mmol/L MES pH6.0緩沖液，離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清。100mmol/L MES pH6.0緩沖液恢復(fù)到lml。
[0052] B、抗體交聯(lián)：加0.2mg的肌酸激酶同工酶單克隆抗體7502(Medix公司），室溫25°C 混勾60min。
[0053] C、封閉：加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0054] D、清洗:加3mL交聯(lián)緩沖液，25000rpm離心清洗30min，棄去上清。加500yL緩沖液， 超聲分離，終濃度2mg/mL。
[0055] E、工作用熒光標(biāo)記抗體配制：
[0056] 配制反應(yīng)緩沖液:緩沖液中含有50mmol/L tris，1 %BSA，0 ? 9%NaCl，1 %葡聚糖， 0.5 % tween 20,pH7.2〇
[0057]用反應(yīng)緩沖液將上述清洗好的熒光標(biāo)記抗體稀釋到終濃度到30iig/mL，作為檢測 用熒光標(biāo)記抗體。
[0058] (3)、清洗液的制備
[0059] 配制清洗緩沖液，含5mmol/L PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.2。
[0060] 實(shí)施例2
[00611 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
[0062]采用實(shí)施例1中制備的試劑組合成肌酸激酶同工酶時(shí)間分辨熒光定量試劑盒，測 定校準(zhǔn)品，每個(gè)濃度重復(fù)10次。
[0063]每個(gè)檢測中加入校準(zhǔn)品10此，熒光標(biāo)記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進(jìn)行讀數(shù)(激發(fā)波長340-380nm,檢測波 長600-630nm)具體數(shù)據(jù)如表1所示。
[0064]表 1
[0066] 根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以熒光信號均值為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo) 準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，可以通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣本中所含的 肌酸激酶同工酶濃度進(jìn)行定量分析。
[0067] 通過表1結(jié)果可知，檢測試劑盒的批內(nèi)精密度良好，校準(zhǔn)品各濃度點(diǎn)精密度均小于 10%，且試劑靈敏度良好(0值校準(zhǔn)品除外），在〇.5ng/mL水平與0值校準(zhǔn)品有顯著區(qū)分。 [0068] (2)、樣本檢測
[0069] 采用實(shí)施例1中制備的試劑組合成肌酸激酶同工酶時(shí)間分辨熒光定量試劑盒，測 定臨床樣本，與Beckman access2系統(tǒng)測試結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。
[0070] 每個(gè)檢測中加入樣品10此，熒光標(biāo)記抗體50iiL，37°C溫育20min，然后清洗檢測杯， 在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進(jìn)行讀數(shù)(激發(fā)波長340-380nm,檢測波長 600-630nm)，將測試結(jié)果帶入圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品測試濃度，測試結(jié)果如表2所示，與 Beckman access2系統(tǒng)測試結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性曲線如圖3所示。
[0071]表2臨床樣本測試結(jié)果
[0072]
[0073] 從圖3中可知，本發(fā)明的試劑盒測定結(jié)果與Beckman儀器及配套試劑盒測定結(jié)果相 關(guān)系數(shù)R2為0.960，相關(guān)性很好。Beckman access2系統(tǒng)和配套的肌酸激酶同工酶試劑盒是 知名的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，但其價(jià)格昂貴，一般只有大型三甲醫(yī)院的中心實(shí)驗(yàn)室才有配 置，其精度和結(jié)果公認(rèn)可靠。但是本發(fā)明制備的試劑盒無論從價(jià)格上還是從檢測準(zhǔn)確度上 考慮，可用于臨床診斷使用。
[0074] 實(shí)施例3
[0075] (1)、檢測反應(yīng)杯的制備：
[0076] A、檢測反應(yīng)杯包被:肌酸激酶同工酶抗體7501(Medix公司）用0.2mol/L的磷酸緩 沖液(PH7.8)稀釋成40μg/ml，1 OOyL/孔，37 °C包被4小時(shí)，洗板。
[0077] B、檢測反應(yīng)杯封閉：用封閉緩沖液按200yL/孔加入反應(yīng)杯，37°C封閉4小時(shí)，棄去 包被反應(yīng)杯中的封閉液，拍干。
[0078] C、檢測反應(yīng)杯干燥:將上述封閉好的反應(yīng)杯放置于濕度低于30%的37°C干燥箱中 烘干8小時(shí)，密封干燥保存。
[0079] (2)、熒光標(biāo)記抗體的制備：
[0080] A、熒光微?；罨?br>[0081 ]取111^羧基時(shí)間分辨焚光微球（20〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加0.4mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，40yL，10mg/mL)，加純化水至終體積 600此，室溫混勾 15min。加lmL 1 OOmmol /], MES pH6.0,離心清洗 15000rpm 20min，棄去上 清。
[0082] B、抗體交聯(lián)：加0.2mg的肌酸激酶同工酶單克隆抗體7502(Medix公司），室溫25°C 混勾60min。
[0083] C、封閉：加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0084] D、清洗:加3mL交聯(lián)緩沖液，25000rpm離心清洗30min，棄去上清。加500yL緩沖液， 超聲分離，終濃度2mg/mL。
[0085] E、工作用熒光標(biāo)記抗體配制：
[0086] 配制反應(yīng)緩沖液:緩沖液中含有50mmol/L tris，1 %BSA，0 ? 9%NaCl，1 %葡聚糖， 0.5 % tween 20,pH7.2〇
[0087]用反應(yīng)緩沖液將上述清洗好的熒光標(biāo)記抗體稀釋到終濃度到30iig/mL，作為檢測 用熒光標(biāo)記抗體。
[0088] (3)、清洗液的制備
[0089]配制清洗緩沖液，含5mmol/L PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.2。
[0090] (4)、校準(zhǔn)品測試
[0091] 采用上述方法制備的試劑組合成肌酸激酶同工酶時(shí)間分辨熒光定量試劑盒，測定 校準(zhǔn)品，每個(gè)濃度重復(fù)10次。
[0092] 每個(gè)檢測中加入校準(zhǔn)品10此，熒光標(biāo)記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數(shù)儀上進(jìn)行讀數(shù)。
[0093] 通過表3結(jié)果可知，檢測試劑盒的批內(nèi)精密度良好，校準(zhǔn)品各濃度點(diǎn)熒光信號精密 度均小于10% (除0和0.5ng/ml水平以外），試劑靈敏度相比實(shí)施例1來說有所降低，僅在 2ng/mL水平與0值校準(zhǔn)品有較為顯著區(qū)分。說明熒光微粒前處理過程中通過添加手臂的方 式能有有效的提升檢測的靈敏度。
[0094]表3肌酸激酶同工酶定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒，其特征在于:該試 劑盒由檢測反應(yīng)杯、熒光標(biāo)記抗體及清洗液組成； 所述檢測反應(yīng)杯的固相表面包被有肌酸激酶同工酶單克隆抗體或多克隆抗體； 所述熒光標(biāo)記抗體為時(shí)間分辨熒光微球與肌酸激酶同工酶單克隆抗體或多克隆抗體 通過共價(jià)鍵交聯(lián)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒， 其特征在于:所述時(shí)間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物，其粒徑為l〇〇-l〇〇〇nm。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒， 其特征在于:所述鑭系元素螯合物為銪螯合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒的 制備方法，其步驟包括， (1) 、檢測反應(yīng)杯的制備：將肌酸激酶同工酶單克隆抗體或多克隆抗體稀釋后37°C包 被，并用封閉緩沖液封閉、拍干;置于37 tC的干燥箱中烘干、密封保存； (2) 、熒光標(biāo)記抗體的制備:將時(shí)間分辨熒光微球活化;然后加入肌酸激酶同工酶單克 隆抗體或多克隆抗體混勻、封閉、清洗，并用反應(yīng)緩沖液稀釋，獲得終濃度到20-50yg/mL的 熒光標(biāo)記抗體； (3) 清洗液的制備:該清洗液中含有PB，NaCl，Tween 20，該清洗液的pH值為7-9。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒的 制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，時(shí)間分辨熒光微球活化的步驟為，在羧基時(shí)間分辨 熒光微球中加入MES和EDC進(jìn)行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15-60min，加入MES、 NHS和EDC進(jìn)行再次活化處理;每Img羧基時(shí)間分辨熒光微球?qū)?yīng)IO-IOOyL 50mmol/L氨基己 酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒的 制備方法，其特征在于：所述初次活化處理包括：每Img羧基時(shí)間分辨熒光微球，加60yL 500mmol/L ρΗ5·0-7·0的MES，0.02-0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽， 加純化水至終體積600yL，室溫混勻15-60min; 所述再次活化處理包括：加入所述氨基己酸室溫混勻后，加 ImL lOOmmol/L的MES pH6 · 0，離心清洗15000rpm 20min，棄去上清；加400yL的100mmol/L的MES pH6 · 0，超聲分離， 加0.02-0.211^1羥基琥珀酰亞胺，加0.01-0.111^0(：，室溫混勻151^11;加11^100臟〇1/1的 MES ρΗ5·0-7·0緩沖液，離心清洗 15000rpm20min，棄去上清；lOOmmol/L MES ρΗ5·0-7·0緩 沖液恢復(fù)到ImL。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒的 制備方法，其特征在于:所述步驟（3)中的清洗液中含有5mmo 1/L的PB，0.9 %NaCl，0.05 % Tween 20,該清洗液的pH值為7.2。8. 權(quán)利要求1所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶的檢測方法，其步 驟包括， (A)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶分析試劑盒 測定不同濃度的校準(zhǔn)品，并根據(jù)熒光讀數(shù)儀上的熒光信號值，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以熒 光信號值為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線； (B) 、將待測樣品加入檢測反應(yīng)杯內(nèi)，再加入熒光標(biāo)記抗體，30°C-4(TC溫育，用清洗液 清洗去除未結(jié)合的抗原及焚光標(biāo)記抗體； (C) 在340-380nm激發(fā)光激發(fā)下，測試檢測反應(yīng)杯中熒光信號，檢測波長為600-630nm; (D) 將所述熒光信號與步驟(A)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得所述待測樣品的肌酸激酶同工 酶的濃度。9. 權(quán)利要求8所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶的檢測方法，其特 征在于:所述步驟(A)中，濃度為0、0.5、2、5、10、25、50、1001^/11^的校準(zhǔn)品中加入熒光標(biāo)記 抗體，37°C溫育5-25min，然后用清洗液清洗去除未結(jié)合的抗原及熒光標(biāo)記抗體，所述校準(zhǔn) 品與熒光標(biāo)記抗體的體積比為1:4-6。10. 權(quán)利要求8所述的基于微球的杯式時(shí)間分辨熒光肌酸激酶同工酶的檢測方法，其特 征在于:所述步驟(B)中，待測樣品與熒光標(biāo)記抗的體積比為1:4-6,溫育溫度為37°C。
【文檔編號】G01N33/533GK105911284SQ201610210309
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】石曉強(qiáng), 徐建新, 李福剛, 周奕璇, 楊晶
【申請人】上海奧普生物醫(yī)藥有限公司