確定治療應(yīng)答的方法
【專利摘要】本發(fā)明一般性地涉及確定針對美他多辛治療的應(yīng)答的方法，所述美他多辛治療用于治療脆性X綜合征及其它認(rèn)知障礙。本發(fā)明還涉及鑒定將對美他多辛治療作出應(yīng)答的個(gè)體。
【專利說明】
確定治療應(yīng)答的方法
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求于2013年9月9日提交的臨時(shí)申請USSN 61/875,384、于2013年9月26日 提交的USSN 14/038258和于2014年5月9日提交的臨時(shí)申請USSN 61/991,351的優(yōu)先權(quán)和權(quán) 益，其內(nèi)容均在此通過引用整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般性地涉及確定針對美他多辛治療的應(yīng)答的方法，所述美他多辛治療用 于治療脆性X綜合征及其它認(rèn)知障礙。本發(fā)明還涉及鑒定將對美他多辛治療作出應(yīng)答的個(gè) 體。
【背景技術(shù)】
[0004] 如其名稱所暗示的，脆性X綜合征(Fragile X Syndrome，F(xiàn)XS)與中期染色體中在 圖譜位置Xq 27.3處表達(dá)為等色裂隙的脆性部位相關(guān)。脆性X綜合征是一種遺傳性疾病，其 由位于X染色體上的脆性X智力低下1 (fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1)基因的5'-非翻譯區(qū)中的突變引起。引起FXS的突變與脆性X智力低下基因 FMR1中的CGG重復(fù)相關(guān)。在大 多數(shù)的健康個(gè)體中，CGG重復(fù)的總數(shù)量為小于10至40,平均為約29。在脆性X綜合征中，CGG序 列重復(fù)200次至超過1，000次。當(dāng)對象具有超過約200個(gè)CGG重復(fù)時(shí)，脆性X基因變得超甲基 化，這使該基因沉默。結(jié)果，不產(chǎn)生或者以降低的水平產(chǎn)生脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)，并且該對象表現(xiàn)出FXS的表現(xiàn)。
[0005] FMR1基因的前突變擴(kuò)增(55至200個(gè)CGG重復(fù))在普通群體中較為頻繁，其中估計(jì)流 行率為女性1/259和男性1/812。前突變的攜帶者通常具有正常的IQ，但是情感問題例如焦 慮較為常見。年長的男性前突變攜帶者(50歲及以上)發(fā)生進(jìn)行性意向性震顫和共濟(jì)失調(diào)。 這些運(yùn)動(dòng)障礙頻繁地伴隨著進(jìn)行性認(rèn)知和行為困難，包括記憶喪失、焦慮以及執(zhí)行功能缺 陷、獨(dú)處或應(yīng)激性行為，和癡呆。這一疾病已認(rèn)定為脆性X相關(guān)性震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征 (fragile X-associated tremor/ataxia syndrome，F(xiàn)XTAS)。對患有FXTAS的對象的磁共振 成像揭示小腦中腳和鄰近小腦白質(zhì)中的T2加權(quán)信號強(qiáng)度增強(qiáng)。
[0006] FXS作為外顯率降低的X連鎖顯性疾病而分離。攜帶脆性X突變的任何性別均可表 現(xiàn)出不同嚴(yán)重程度的智力障礙?；加蠪XS的兒童和成人具有不同程度的智力障礙或?qū)W習(xí)障 礙以及行為和情緒問題，包括自閉樣特征和傾向。患有FXS的幼兒通常具有發(fā)育重要事件 (例如學(xué)習(xí)如何坐、行走和說話)的延遲。受侵襲的兒童可具有頻繁發(fā)怒、注意力難以集中、 頻繁癲癇發(fā)作(例如，顳葉癲癇發(fā)作），常常高度焦慮、易于不知所措，可具有感覺性覺醒過 度紊亂、胃腸道紊亂，并且可具有說話問題和異常行為，例如揮舞手和咬手。
[0007] FXS可通過對來自對象的樣品（例如，血樣、口腔樣品）進(jìn)行建立的遺傳測試來診 斷。所述測試基于CGG重復(fù)的數(shù)量來確定該對象的FMR1基因中是否存在突變或前突變。
[0008] 患有FXS的對象還可具有自閉癥。經(jīng)診斷患有自閉癥的所有兒童中約5%具有FMR1 基因的突變并且還具有脆性X綜合征(FXS)。自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder， ASD)見于約30%患有FXS的男性和20%患有FXS的女性中，并且另外的30%FXS個(gè)體表現(xiàn)出 自閉癥癥狀但不診斷具有ASD。雖然智力障礙是FXS的標(biāo)志性特征，但是患有FXS的對象常常 表現(xiàn)出自閉癥特征，范圍從輕度病例中的羞怯、缺乏眼神接觸和社交焦慮到重度受侵襲者 中的揮舞手、咬手和持續(xù)言語?；加蠪XS的對象表現(xiàn)出與自閉癥相關(guān)的其它癥狀，例如注意 力不足和多動(dòng)、癲癇發(fā)作、對感覺刺激過敏、強(qiáng)迫性行為以及胃腸道功能改變。FMR1突變阻 止或者極大地降低了單一蛋白質(zhì)（FMRP)的表達(dá)。認(rèn)為在不存在FMRP情況下的腦發(fā)育導(dǎo)致 FXS的主要癥狀。
[0009] 除核心癥狀之外，患有FXS的兒童還頻繁地具有嚴(yán)重的行為紊亂，例如易怒、攻擊 和自傷行為等。在對患有FXS之男性（8至24歲）的最近研究中，報(bào)道在兩個(gè)月的觀察期內(nèi)， 79 %的對象中有自傷行為且75 %的對象中有攻擊行為。
[0010] 目前，針對患有FXS的人的可用治療方案包括例如行為矯正和用多種藥物（未經(jīng) FDA批準(zhǔn)用于治療FXS)進(jìn)行治療，所述藥物包括抗抑郁和抗精神病藥物。已經(jīng)使用認(rèn)知行為 治療來在患有FXS和自閉癥的個(gè)體中改善語言和社交。近年來，已在患有自閉癥的個(gè)體的治 療中普遍利用使用非典型抗精神病藥利培酮的藥理學(xué)治療來增強(qiáng)非藥理學(xué)方法。在自閉癥 兒童中進(jìn)行利培酮的隨機(jī)化安慰劑對照試驗(yàn)證明臨床總體印象改善（c 1 i n i c a 1 G1 〇 b a 1 Impressions-Improvement)和異常行為量表（Aberrant Behavior Checklist)的易怒分量 表顯著改善(McCracken，J.T.，等，N.Engl.J.Med.347:314-321 (2002))。然而，不良事件包 括體重增加、食欲增加、疲勞、嗜睡、眩暈和流涎。通過施用利培酮并未改善社交隔離和交 流，并且不良副作用（例如錐體束外癥狀和運(yùn)動(dòng)障礙）已與自閉癥兒童中的利培酮使用有 關(guān)。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明提供了在已接受美他多辛治療之患有脆性X綜合征或其它認(rèn)知障礙的對象 中評估美他多辛治療方案的有效性的方法，其如下進(jìn)行:測量來自所述對象的樣品中磷酸 化ERK和Akt蛋白的量;測量所述樣品中ERK和Akt蛋白的總量;計(jì)算磷酸化ERK和Akt蛋白量 與ERK和Akt蛋白總量的比率，并將該計(jì)算比率與由未患病對象測量的計(jì)算比率進(jìn)行比較。 當(dāng)所述對象的計(jì)算比率與已知未患病對象的計(jì)算比率近似時(shí)，所述治療是有效的。
[0013] 本發(fā)明還提供了確定患有脆性X綜合征或其它認(rèn)知障礙的對象是否將從美他多辛 治療方案獲益的方法，其如下進(jìn)行:測量源自所述對象的樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量； 測量所述樣品中ERK和Akt蛋白的總量;計(jì)算磷酸化ERK和Akt蛋白量與ERK和Akt蛋白總量的 比率，并將所述對象計(jì)算比率與由未患病對象測量的計(jì)算比率進(jìn)行比較。當(dāng)所述對象計(jì)算 比率高于已知未患病對象的計(jì)算比率時(shí)，所述對象將從美他多辛治療方案獲益。
[0014] 本發(fā)明還提供了在患有脆性X綜合征或其它認(rèn)知障礙的對象中監(jiān)測美他多辛治療 方案的方法，其如下進(jìn)行:在第一時(shí)期測量來自所述對象的第一樣品中磷酸化ERK和Akt蛋 白的量;在所述第一時(shí)期測量所述第一樣品中ERK和Akt蛋白的總量;計(jì)算磷酸化ERK和Akt 蛋白量與ERK和Akt蛋白總量的第一比率;在第二時(shí)期測量來自所述對象的第二樣品中磷酸 化ERK和Akt蛋白的量;在所述第二時(shí)期測量所述第二樣品中ERK和Akt蛋白的總量;計(jì)算磷 酸化ERK和Akt蛋白量與ERK和Akt蛋白總量的第二比率，并將第一比率與第二比率進(jìn)行比 較。當(dāng)?shù)诙嚷实陀诘谝槐嚷蕰r(shí)，所述治療是有效的。
[0015] 在一些方面中，所述測量步驟包括免疫測定。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是全血 或其級分。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononucleated cell，PBMC)。在一些實(shí)施方案中，所述PMBC是淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞。
[0016] 除非另外限定，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐中可使用與本文中所述那些 類似或等同的方法和材料，下面仍對合適的方法和材料進(jìn)行了描述。本文中提及的所有公 開、專利申請、專利以及其它參照文獻(xiàn)均明確地通過引用以其整體并入。如有沖突，將以本 說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，本文中所述的材料、方法和實(shí)施例僅是示例性的并非旨在限 制。
[0017] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將由以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求書而變得明顯并且涵蓋 在其中。
[0018] 附圖簡述
[0019] 圖1示出了在2月齡Fmrl敲除(knockout，K0)或野生型(Wild Type，WT)小鼠中進(jìn)行 7天載劑('^11；[(316，\0或美他多辛(1116七3(1(?;[116，]\〇(100、150或20〇11^/1^)的每天一次腹膜內(nèi) (intraperitoneal，ip)施用對場景恐懼條件反射的影響。特別地，圖A示出了載劑或150mg/ kg美他多辛的影響。圖B示出了載劑或100mg/kg美他多辛的影響。圖C示出了載劑或200mg/ kg美他多辛的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值土平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（standard error of the mean， 此111)小=10只小鼠/組。、<0.05、***、<0.0001并且吧=不顯著。
[0020]圖2示出了在2月齡Fmrl敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中進(jìn)行7天載劑(V)或150mg/ kg美他多辛(M)的每天一次腹膜內(nèi)施用對社交接近行為的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值±sem，N =10 只小鼠 / 組。*P<〇. 05 和 ****p<0.0001。
[0021]圖3示出了在2月齡Fmrl敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中進(jìn)行7天載劑(V)或150mg/ kg美他多辛（M)的每天一次腹膜內(nèi)施用對Y形迷宮自發(fā)交替（Y-maze spontaneous alternation)(圖A)、Y形迷宮獎(jiǎng)勵(lì)性交替（Y-maze rewarded alternation)(圖B)或Y形迷 宮水迷宮空間辨別（Y-maze water maze spatial discrimination)(圖C)的影響。所示數(shù) 據(jù)為平均值土sem，N=10只小鼠/組。***p<0.001、****p<0.0001并且NS =不顯著。
[0022]圖4示出了在2月齡Fmrl敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中進(jìn)行7天載劑(V)或150mg/ kg美他多辛(M)的每天一次腹膜內(nèi)施用對T形迷宮獎(jiǎng)勵(lì)性交替的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值± sem，N=10 只小鼠 / 組。****p<0.0001。
[0023]圖5示出了在N=10野生型(WT)或Fmrl敲除(K0)2月齡小鼠的組中進(jìn)行7天載劑(V) 或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次處理對在連續(xù)通道任務(wù)(successive alley task)中 的行為的影響。設(shè)備的連續(xù)通道呈現(xiàn)出愈加致焦慮的環(huán)境以對小鼠進(jìn)行研究。因此，從通道 往下移動(dòng)評估為焦慮。此外，還可在該設(shè)備中對整體活動(dòng)水平進(jìn)行量化。
[0024]圖6示出了在2月齡Fmrl敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中進(jìn)行7天載劑(V)或150mg/ kg美他多辛(M)的每天一次腹膜內(nèi)施用對ERK(指示ERK活性）（圖A)和Akt(指示Akt活性）（圖 B)的整體腦磷酸化水平的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值土sem，N=5只小鼠/組?！穚<0.01 /?p <0.001、****?<0.0001且吧=不顯著。
[0025]圖7示出了在6月齡Fmrl敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用載劑(V) 或150mg/kg美他多辛(M)7天對場景恐懼條件反射的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值±sem，N=10 只小鼠/組。****P<〇.〇〇〇l且ns =不顯著。
[0026]圖8示出了如通過嗅探回合次數(shù)或嗅探持續(xù)時(shí)間所測量的，在6月齡Fmrl敲除(K0) 或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用載劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)7天對社交接近 (圖A和C)和社交記憶（圖B和D)行為的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值±sem，N=10只小鼠/組Zp <0.05、****?<0.0001且狀=不顯著。
[0027]圖9示出了在6月齡Fmrl敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用載劑(V) 或150mg/kg美他多辛(M)7天對ERK(圖A)和Akt (圖B)的整體腦磷酸化水平的影響。所示數(shù)據(jù) 為平均值土sem，N=10 只小鼠 / 組。*口<0.05、**口<0.01、****口<0.0001且1^ =不顯著。 [0028] 圖10示出了在2月齡Fmrl敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或經(jīng)口施用 (oral administration，po)載劑(V)或 150mg/kg和300mg/kg美他多辛(M)7天對場景恐懼條 件反射的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值土sem，N=10只小鼠/組。具體地，圖A示出了 Fmrl敲除和 野生型小鼠中使用載劑的ip或經(jīng)口處理。圖B示出了野生型小鼠中使用美他多辛的ip和經(jīng) 口處理。圖C示出了Fmr 1敲除小鼠中使用美他多辛的ip和經(jīng)口處理。<0.01、< 0.0001且ns =不顯著。
[0029] 圖11示出了在2月齡Fmr 1敲除(K0)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或經(jīng)口施用 (P〇)載劑(V)或者150mg/kg或300mg/kg美他多辛(M)7天對社交接近（圖A)和社交記憶（圖B) 的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值土 sem，N=10只小鼠/組。**口<0.01、****口<0.0001且1^ =不顯 著。
[0030]圖12示出了如使用流式細(xì)胞術(shù)所評估的，在2月齡Fmrl敲除(K0)和野生型(WT)小 鼠中每天一次地ip或經(jīng)口施用（P〇)載劑(V)或者150或300mg/kg美他多辛(M)7天對淋巴細(xì) 胞生物標(biāo)志物的影響。所示生物標(biāo)志物為Fmrl敲除或野生型小鼠中的pAkt (圖A)和pERK(圖 B)。所示數(shù)據(jù)為平均值土 sem，N= 10只小鼠/組。****p<0 ? 0001且ns =不顯著。
[0031]圖13示出了每天一次地ip施用載劑(V)或者150mg/kg美他多辛(M)7天對2月齡野 生型(WT)和Fmrl敲除(K0)小鼠腦區(qū)域中pERK水平的影響。所分析區(qū)域?yàn)镕mrl敲除或野生型 小鼠中的海馬（圖A)、前額皮質(zhì)（圖B)和紋狀體（圖C)。所示數(shù)據(jù)為平均值±sem，N=10只小 鼠/組。****p<0.0001且ns =不顯著。
[0032]圖14示出了每天一次地ip施用載劑(V)或者150mg/kg美他多辛(M)7天對2月齡野 生型(WT)和Fmrl敲除(K0)小鼠腦區(qū)域中pAkt水平的影響。所分析區(qū)域?yàn)镕mrl敲除或野生型 小鼠中的海馬（圖A)、前額皮質(zhì)（圖B)和紋狀體（圖C)。所示數(shù)據(jù)為平均值±sem，N=10只小 鼠/組。****p<0.0001且ns =不顯著。
[0033]圖15示出了用載劑(V)或300yM美他多辛(M)進(jìn)行5小時(shí)體外處理對來自Fmrl敲除 (K0)或野生型(WT)小鼠的神經(jīng)元海馬培養(yǎng)物中的絲足密度(filopodia density)(圖A)、長 度（圖B)和寬度（圖C)的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值土sem(野生型，N=20個(gè)神經(jīng)元;Fmrl敲除 小鼠，N=20個(gè)神經(jīng)元）。*、<0.01、**、<0.001并且1^ =不顯著。
[0034]圖16示出了用載劑(V)或300yM美他多辛(M)進(jìn)行體外處理對來自Fmrl敲除(K0)或 野生型（WT)小鼠之400yM海馬切片中的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)從頭合成（basal de novo protein synthesis)的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值土 sem，N = 6個(gè)切片/組。*p<0.001且 0.0001c
[0035] 發(fā)明詳述
[0036] 本發(fā)明涉及鑒定患有脆性X綜合征(FXS)及其它認(rèn)知障礙的個(gè)體之與針對美他多 辛治療的應(yīng)答相關(guān)的生物標(biāo)志物。具體地，發(fā)現(xiàn)美他多辛治療使對象樣品中磷酸化ERK和 Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白的比率恢復(fù)得更接近正常比率。正常比率意指見于正常（即未患 病)對象中的磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白的比率。另外，意外地發(fā)現(xiàn)可在血液中 檢測到磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白之比率的這些變化。
[0037]因此，本發(fā)明提供了用于通過確定對象樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt 蛋白的比率監(jiān)測因 FXS或其它認(rèn)知障礙而正接受美他多辛治療的對象的方法。將該比率與 對照比率(例如由未患認(rèn)知障礙的對象獲得的比率)進(jìn)行比較。對象比率近似于正常對照比 率指示所述治療是有效的。
[0038]另外，本發(fā)明提供了通過確定對象樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白 的比率選擇將從美他多辛治療獲益之患有認(rèn)知障礙的對象的方法。將該比率與對照比率 (例如由未患認(rèn)知障礙的對象獲得的比率)進(jìn)行比較。對象比率大于正常對照比率指示所述 對象可從美他多辛治療獲益。而比率不大于正常對照比率的對象可能不會(huì)從美他多辛治療 獲益。
[0039]對普通技術(shù)人員顯而易見的是，盡管本文中將比率的計(jì)算描述為單向，但是應(yīng)理 解其還涵蓋對倒數(shù)進(jìn)行計(jì)算。另外，盡管如本文中所述計(jì)算比率有益于提供可用的比較數(shù) 值，但是還可采用磷酸化ERK和Akt蛋白水平與總ERK和Akt蛋白水平之間的絕對差以及受試 對象與對照對象之間的絕對差的計(jì)算并且其將有效地用于實(shí)施本發(fā)明。
[0040] 定義
[0041] "精確度"指測量或計(jì)算的量(測試報(bào)道值)與其實(shí)際（真實(shí))值相符的程度。臨床精 確度涉及真實(shí)結(jié)果(真陽性(true positive，TP)或真陰性(true negative，TN))相對于錯(cuò) 誤分類結(jié)果(假陽性(false positive，F(xiàn)P)或假陰性(false negative，F(xiàn)N))的比例，并且可 規(guī)定為靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值(positive predictive value，PPV)或陰性預(yù)測值 (negative predictive value，NPV)，或者規(guī)定為可能性、比值比（odds ratio)以及其它量 度。
[0042] 在本發(fā)明的背景下，"生物標(biāo)志"涵蓋但不限于蛋白質(zhì)、核酸和代謝物，以及其多態(tài) 性、突變、變體、修飾、亞基、片段、蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物和降解產(chǎn)物、蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物、元 素、相關(guān)代謝物及其它分析物或樣品衍生量度。生物標(biāo)志還可包括突變蛋白質(zhì)或突變核酸。 生物標(biāo)志還涵蓋健康狀態(tài)的非血液攜帶因子或非分析物生理標(biāo)志，例如本文中定義的"臨 床參數(shù)"以及本文中還定義的"常規(guī)實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)因子"。生物標(biāo)志物還包括數(shù)學(xué)上生成的任 何計(jì)算指數(shù)或前述任一種或更多種量度(包括時(shí)間趨勢和時(shí)間差)的組合。在可用時(shí)并且除 非本文中另有所述，否則基于官方字母縮寫或基因符號來識別為基因產(chǎn)物的生物標(biāo)志，所 述官方字母縮寫或基因符號由國際人類基因組組織命名委員會(huì)（Human Genome Organization Naming Committee，HGNC)分配并在此申請日列于美國國家生物技術(shù)信息中 心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站。
[0043] "臨床指標(biāo)"為在評價(jià)生物體或細(xì)胞群的生理狀況中單獨(dú)使用或與其它數(shù)據(jù)聯(lián)合 使用的任何生理數(shù)據(jù)。該術(shù)語包括臨床前指標(biāo)。
[0044] "臨床參數(shù)"涵蓋對象健康狀態(tài)的所有非樣品或非分析物生物標(biāo)志或其它特征，例 如但不限于年齡(Age)、種族(RACE)、性別(Sex)或家族史(FamHX)。
[0045] "FN"為假陰性，其對疾病狀態(tài)測試而言意指將患病對象錯(cuò)誤地分類為未患病或正 常。
[0046] "FP"為假陽性，其對疾病狀態(tài)測試而言意指將正常對象錯(cuò)誤地分類為患病。
[0047] "公式"、"算法"或"模型"為任何數(shù)學(xué)方程，算法、分析或程序化方法，或采用一個(gè) 或更多個(gè)連續(xù)或分類輸入(本文中稱為"參數(shù)"）并計(jì)算輸出值（有時(shí)稱為"指數(shù)"或"指數(shù) 值"）的統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)。"公式"的非限制性實(shí)例包括和、比率和回歸運(yùn)算子(例如系數(shù)或指數(shù)）， 生物標(biāo)志值轉(zhuǎn)換和歸一化(包括但不限于基于臨床參數(shù)例如性別、年齡或種族的那些歸一 化方案），規(guī)則和指南，統(tǒng)計(jì)分類模型，和對歷史群體訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在小組和組合構(gòu)建 (panel and combination construction)中，特別感興趣的是結(jié)構(gòu)和合作統(tǒng)計(jì)分類算法， 和利用模式識別特征的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)構(gòu)建方法，包括已建立的技術(shù)，例如交叉相關(guān)、主成分分析 (Principal Components Analysis，PCA)、因子方定車專、邏輯回歸（Logistic Regression， LogReg)、線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA)、Eigengene線性判別分析 (Eigengene Linear Discriminant Analysis，ELDA)、支持向量機(jī)（Support Vector Machine，SVM)、隨機(jī)森林（Random Forest，RF)、遞歸分割樹（Recursive Partitioning Tree，RPART)及其它相關(guān)決策樹分類技術(shù)、縮小重心（Shrunken Centro id，SC)、StepAIC、第 k個(gè)最近鄰居(Kth-Nearest Neighbor)、推進(jìn)(Boosting)、決策樹、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、貝葉斯網(wǎng)絡(luò) (Bayesian Network)、支持向量機(jī)和隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model)等。存活和時(shí) 間方面的事件危害分析可使用其它技術(shù)，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的Cox、Weibull、 Kaplan-Meier和Greenwood模型。這些技術(shù)中有很多可與諸如以下的選擇技術(shù)組合使用或 者其可在其自身的技術(shù)中本身包括生物標(biāo)志選擇方法學(xué)：向前選擇、向后選擇或逐步選擇、 給定大小的所有潛在組的完全列舉、遺傳算法。這些可與信息標(biāo)準(zhǔn)例如阿開克信息準(zhǔn)則 (Akaike 7 s Information Criterion，AIC)或貝葉斯1 信息準(zhǔn)貝丨J(Bayes Information Criterion，BIC)結(jié)合以量化附加生物標(biāo)志與模型改善之間的折衷并有助于最小化過擬合。 得到的預(yù)測模型可在其它研究中進(jìn)行驗(yàn)證或者可使用諸如Bootstrap、留一（Leave-One-Out，L00)和10折交叉驗(yàn)證（10-Fold cross-validation，10-Fold CV)的技術(shù)在對其進(jìn)行初 始訓(xùn)練的研究中交叉驗(yàn)證。在各個(gè)步驟中，可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)通過值置換(value permutation)評估假發(fā)現(xiàn)率。"健康經(jīng)濟(jì)效用函數(shù)(health economic utility function)" 是這樣的公式，其衍生自向護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)中引入診斷性或治療性干預(yù)前后兩種情況下理想化適 用患者群中發(fā)生一系列臨床結(jié)果的預(yù)期概率的組合。其涵蓋對此類干預(yù)之精確度、有效性 和性能特征的評估以及對與每種結(jié)果相關(guān)之成本和/或價(jià)值測量(效用）的評估，所述成本 和/或價(jià)值測量可獲自產(chǎn)生每種結(jié)果的實(shí)際健康體系護(hù)理成本(服務(wù)、供應(yīng)、裝置和藥物等） 和/或作為產(chǎn)生每種結(jié)果的估計(jì)可接受值/質(zhì)量調(diào)整壽命年（quality adjusted life year，QALY)獲得。貫穿所有預(yù)測結(jié)果，結(jié)果的預(yù)測群大小乘以相應(yīng)結(jié)果之預(yù)測效用的乘積 的總和為給定護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的總健康經(jīng)濟(jì)效用。（i)對具有干預(yù)之護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算的總健康經(jīng)濟(jì) 效用相對于（ii)無干預(yù)之護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的總健康經(jīng)濟(jì)效用的差異導(dǎo)致對所述干預(yù)之健康經(jīng)濟(jì) 成本或價(jià)值的整體量度。這可本身在所分析的整個(gè)患者組中（或者僅在干預(yù)組中）分配以獲 得每單位干預(yù)的成本，并指導(dǎo)例如市場定位、定價(jià)和推測健康體系接受度的決策。這樣的健 康經(jīng)濟(jì)效用函數(shù)通常用于比較干預(yù)的成本有效性，但是還可被轉(zhuǎn)化以評估健康護(hù)理體系愿 意支付的可接受值/QALY或新干預(yù)所需的可接受的成本有效的臨床成效特征。
[0048] 對于本發(fā)明的診斷性(或預(yù)后)干預(yù)，由于每種結(jié)果(其在疾病分類診斷測試中可 為TP、FP、TN或FN)需要不同的成本，因此基于臨床情況以及各種結(jié)果成本和價(jià)值，健康經(jīng)濟(jì) 效用函數(shù)可優(yōu)先地相比于特異性偏向靈敏度，或者相比于NPV偏向PPV，并因此提供對健康 經(jīng)濟(jì)成效和價(jià)值的另一種量度，其可不同于更直接的臨床或分析成效量度。這些不同的測 量結(jié)果和相對折衷一般將僅在具有零誤差率的完美測試(又稱為:零預(yù)測對象結(jié)果錯(cuò)誤分 類或FP和FN)的情況下匯合，然而所有的成效測量將偏向不完美，但是程度不同。
[0049] "測量"或其變化形式或者可替選地"檢測"或其變化形式意指評估給定物質(zhì)在臨 床樣品或來源于對象的樣品中的存在、不存在、數(shù)量或量(其可為有效量），包括推導(dǎo)出此類 物質(zhì)的定性或定量濃度水平，或者另外地評價(jià)對象之非分析物臨床參數(shù)的值或分類。
[0050] "陰性預(yù)測值"或"NPV"通過TN/(TN+FN)或所有陰性測試結(jié)果的真陰性分?jǐn)?shù)來計(jì) 算。其還固有地受意欲進(jìn)行測試之群體的流行率和驗(yàn)前概率的影響。參見例如C/Marcaigh A S,Jacobson R M，〃Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test,How To Prevent Misleading Or Confusing Results，〃Clin.Ped.l993,32(8):485_491，其討論了 測試(例如臨床診斷測試)的特異性、靈敏度以及陽性和陰性預(yù)測值。通常來說，對于使用連 續(xù)診斷測試測量的二進(jìn)制疾病狀態(tài)分類方法，靈敏度和特異性根據(jù)Pepe等/Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic,Prognostic,or Screening Marker，〃 Am .J.Epidemiol 2004,159(9) :882_890通過接受者操作特征 (Receiver Operating Characteristic，R0C)曲線概括，并通過曲線下面積(Area Under the CurVe，AUC)或c-統(tǒng)計(jì)量概括，其為允許用僅一個(gè)值來表示測試、測定或方法在整個(gè)測 試（或測定）分割點(diǎn)范圍內(nèi)的特異性和靈敏度的指標(biāo)。還參見例如Shultz/Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures，〃Teitz中的第14章 ，F(xiàn)undamentals of Clinical Chemistry，Burtis和Ashwood(編輯），第4次增補(bǔ)版 1996,W.B.Saunders Company，第192-199頁；和Zweig等，〃R0C Curve Analysis:An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronory Artery Disease，〃Clin?Chem.，1992，38(8): 1425-1428。使用似然函數(shù)、比數(shù)比、信息論、預(yù)測值、校準(zhǔn)(包括擬合優(yōu)度)和重分類測量的 替代方法根據(jù)Cook/Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction，〃Circulation 2007，115:928_935進(jìn)行概括。最后，通過測試 確定的對象群中的危害比以及絕對和相對風(fēng)險(xiǎn)比是對臨床精確度和效用的另一種量度。有 多種方法常用于定義異常值或疾病值，包括參照界限、辨別界限和風(fēng)險(xiǎn)閾值。
[0051] "分析精確度"指測量方法本身的可重現(xiàn)性和可預(yù)測性，并且可在諸如變異系數(shù)的 測量和用不同的時(shí)間、使用者、設(shè)備和/或試劑對同一樣品或?qū)φ者M(jìn)行的一致性和校正測試 中概括。評價(jià)新生物標(biāo)志中的這些及其它考慮還在Vasan，2006中進(jìn)行了概括。
[0052] "成效(performance)"是與診斷或預(yù)后測試的整體有用性和質(zhì)量相關(guān)的術(shù)語，尤 其包括臨床和分析精確度、其它分析和方法特征(例如使用特征(例如穩(wěn)定性、使用的容易 性））、健康經(jīng)濟(jì)價(jià)值和測試要素的相對成本。任意這些因素可以是優(yōu)異成效并由此是測試 有用性的來源，并且在相關(guān)時(shí)可通過合適的"成效量度"（例如AUC、產(chǎn)生結(jié)果的時(shí)間、貨架期 等)測量。
[0053] "陽性預(yù)測值"或"PPV"通過TP/(TP+FP)或所有陽性測試結(jié)果的真陽性分?jǐn)?shù)來計(jì) 算。其固有地受意欲進(jìn)行測試之群體的患病率和測試前概率的影響。
[0054] 在本發(fā)明的背景下，"風(fēng)險(xiǎn)"涉及事件將在特定時(shí)期內(nèi)發(fā)生的概率(如對治療的響 應(yīng)性），并且可意指對象的"絕對"風(fēng)險(xiǎn)或"相對"風(fēng)險(xiǎn)。絕對風(fēng)險(xiǎn)可參照在相關(guān)時(shí)間組群的實(shí) 際觀察后測量或者參照由已隨訪相關(guān)時(shí)期的統(tǒng)計(jì)學(xué)有效歷史組群產(chǎn)生的指標(biāo)值來測量。相 對風(fēng)險(xiǎn)指對象的絕對風(fēng)險(xiǎn)相比較于低風(fēng)險(xiǎn)組群的絕對風(fēng)險(xiǎn)或平均群體風(fēng)險(xiǎn)的比率，其可隨 如何評估臨床風(fēng)險(xiǎn)因子而改變。還常常使用比數(shù)比，即給定測試結(jié)果之陽性事件與陰性事 件的比例（比數(shù)根據(jù)公式p/(l-p)，其中P是發(fā)生事件的概率并且（1-P)是不發(fā)生事件的概 率），且無轉(zhuǎn)換。
[0055] 在本發(fā)明的背景下，"風(fēng)險(xiǎn)評估"或"評估風(fēng)險(xiǎn)"涵蓋預(yù)測事件或疾病狀態(tài)可能發(fā)生 的概率、比數(shù)或可能性，事件的發(fā)生率，或從一種疾病狀態(tài)轉(zhuǎn)變的發(fā)生率。風(fēng)險(xiǎn)評估還可包 括參照之前測量的群體在絕對或相對方面預(yù)測FXS的未來臨床參數(shù)、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)因子 值或其它指數(shù)。本發(fā)明的方法還可用于連續(xù)地或分類地測量針對治療的響應(yīng)，由此診斷和 定義定義為應(yīng)答者或非應(yīng)答者的一類對象的風(fēng)險(xiǎn)譜。在該分類方案中，本發(fā)明可用于區(qū)分 正常對象組群和其它處于較高應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)之中的對象組群。
[0056] 在本發(fā)明的背景下，"樣品"是從對象分離的生物樣品并且可包括例如但不限于全 血、血清、血衆(zhòng)、腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)、腦細(xì)胞或任何其它分泌物、排泄物或 其它體液。"樣品"可包括單細(xì)胞或多細(xì)胞或細(xì)胞碎片。所述樣品還是組織樣品。所述樣品是 或者包含腦細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。優(yōu)選地，所述樣品是外周血單個(gè)核細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞或單核 細(xì)胞。
[0057] "靈敏度"通過TP/( TP+FN)或患病對象的真陽性分?jǐn)?shù)來計(jì)算。
[0058] "特異性"通過TN/(TN+FP)或者未患病或正常對象的真陰性分?jǐn)?shù)來計(jì)算。
[0059] "統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的"意指變化大于預(yù)期可能僅偶然發(fā)生的變化（其可以是"假陽性 的"）。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來確定。常用的顯著性量度包括P值， 其表示獲得至少與給定數(shù)據(jù)點(diǎn)一樣極端的結(jié)果的概率，假設(shè)該數(shù)據(jù)點(diǎn)僅為偶然的結(jié)果。當(dāng)P 值為0.05或更小時(shí)，認(rèn)為結(jié)果高度顯著。優(yōu)選地，p值為0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001 或更小。
[0060] 在本發(fā)明的背景下，"對象"優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可以是人、非人靈長 類動(dòng)物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但不限于這些實(shí)例?？捎欣厥褂贸酥獾牟溉閯?dòng)物 作為代表FXS的動(dòng)物模型的對象。對象可以是雄性或雌性的。所述對象患有或者懷疑患有 FXS或其它認(rèn)知障礙。
[0061] "TN"為真陰性，其對疾病狀態(tài)測試而言意指將未患病或正常對象正確地分類。
[0062] "TP"為真陽性，其對疾病狀態(tài)測試而言意指將患病對象正確地分類。
[0063] "常規(guī)實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)因子"對應(yīng)于從對象樣品分離或獲得的這樣的生物標(biāo)志，其目前 在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行評價(jià)并且用于常規(guī)的全局風(fēng)險(xiǎn)評估算法。脆性X的其它常規(guī)實(shí)驗(yàn)室風(fēng) 險(xiǎn)因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0064]本發(fā)明的方法
[0065]本文中公開的方法用于因 FXS及其它認(rèn)知障礙而正接受美他多辛治療和/或療法 的對象，并且用于已診斷為患有FXS及其它認(rèn)知障礙的對象。
[0066]本發(fā)明的方法可用于在對象中監(jiān)測FXS以及其它認(rèn)知障礙的治療，和選擇將從美 他多辛治療獲益的對象。
[0067] 一般來說，F(xiàn)XS的體征和癥狀分為五類：智力和學(xué)習(xí)；身體，社交和情感，說話和語 言以及感覺障礙，其通常與脆性X相關(guān)或者與脆性X具有共有特征。例如，患有FXS的個(gè)體具 有受損的智力功能、社交焦慮、語言困難并且對某些感覺敏感。
[0068]認(rèn)知障礙包括其中心理處理的功能障礙/損傷構(gòu)成核心癥狀的障礙組。認(rèn)知障礙 包括神經(jīng)源性認(rèn)知障礙(neurogenetic cognitive disorder)或行為認(rèn)知障礙。
[0069] 認(rèn)知障礙包括發(fā)育障礙、注意缺陷多動(dòng)障礙(attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)、自閉癥譜系障礙、阿爾茨海默病(Alzheimers disease)、精神分裂癥和腦 血管疾病。
[0070] 自閉癥譜系障礙和自閉癥癥狀通常與患有脆性X綜合征的個(gè)體相關(guān)。自閉癥的體 征和癥狀包括顯著語言延遲，社交和交流困難，以及異常的行為和興趣。患有自閉癥性疾病 的很多人還具有智力障礙。
[0071] 確定對象樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白的比率允許監(jiān)測FXS或其 它認(rèn)知障礙的治療過程。在該方法中，生物樣品由正接受治療的對象提供。如果期望的話， 在治療之前、期間或之后于不同時(shí)間點(diǎn)從該對象獲取生物樣品。然后，計(jì)算磷酸化ERK和Akt 蛋白與總ERK和Akt蛋白的比率并將其與對照值進(jìn)行比較。對照值為其磷酸化ERK和Akt蛋白 與總ERK和Akt蛋白水平的比率是已知的或者為指數(shù)值的對照個(gè)體或群體。參照樣品或指標(biāo) 值可取自或獲自未患病(例如未患FXS或其它認(rèn)知障礙)的一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體?；蛘?，參照樣 品或指標(biāo)值可在治療前從對象取得或獲得。例如，可自尚未接受初始治療的對象收集樣品 并且在后續(xù)治療之后收集樣品以監(jiān)測治療的進(jìn)展?？稍诔跏贾委熤髲膶ο笕〉没颢@得參 照樣品或指標(biāo)值。例如，可自已因 FXS而接受初始治療和后續(xù)治療的對象收集樣品以監(jiān)測治 療的進(jìn)展。
[0072] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，參照值為指標(biāo)值或基線值。指標(biāo)值或基線值是來自未患FXS 或其它認(rèn)知障礙之個(gè)體的磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白之比率的復(fù)合樣品。 [0073]可如下監(jiān)測治療的有效性：確定自對象獲得的樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白與總 ERK和Akt蛋白隨時(shí)間的比率并將比率進(jìn)行比較。例如，可在對象接受治療之前獲取第一樣 品，而在對象治療之后或期間獲取一份或更多份后續(xù)樣品。
[0074] "有效的"意指治療導(dǎo)致磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白的比率近似于來 自未患FXS或其它認(rèn)知障礙的對象的比率。可聯(lián)合用于診斷、鑒定或治療FXS的任何已知方 法來確定效力。
[0075] 磷酸化ERK和Akt蛋白以及總ERK和Akt蛋白可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法(例如 免疫測定)來確定。
[0076]本發(fā)明的成效和精確度測量
[0077] 本發(fā)明的成效以及由此的絕對和相對臨床有用性可如上所述以多種方式進(jìn)行評 估。診斷、預(yù)測或預(yù)后測試、測定或方法的精確度涉及該測試、測定或方法區(qū)分響應(yīng)于美他 多辛治療之對象和無響應(yīng)之對象的能力，其基于磷酸化ERK和Akt蛋白與總ERK和Akt蛋白的 比率。正常和異常之比的差異優(yōu)選是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
[0078] 因此，在評估用于評估對象狀況之建議醫(yī)學(xué)測試、測定或方法的精確度和有用性 中，應(yīng)總是將靈敏度和特異性兩者考慮在內(nèi)并且應(yīng)注意報(bào)道靈敏度和特異性的分割點(diǎn)，因 為靈敏度和特異性可在分割點(diǎn)的范圍內(nèi)顯著不同。對使用本發(fā)明的大多數(shù)分類風(fēng)險(xiǎn)測量來 說，優(yōu)選地使用涵蓋所有潛在分割點(diǎn)值的諸如AUC的統(tǒng)計(jì)量，但是對于連續(xù)風(fēng)險(xiǎn)測量而言， 優(yōu)選相對于觀察結(jié)果或其它金標(biāo)準(zhǔn)的擬合優(yōu)度和校準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)量。
[0079] 使用這樣的統(tǒng)計(jì)量，本文中將"可接受的診斷精確度"定義為這樣的測試或測定， 其中AUC(該測試或測定的R0C曲線下面積）為至少0.60,理想地至少0.65,更理想地至少 0.70，優(yōu)選地至少0.75，更優(yōu)選地至少0.80并且最優(yōu)選地至少0.85。
[0080] "非常高的診斷精確度"意指這樣的測試或測定，其中AUC(該測試或測定的R0C曲 線下面積)為至少0.80，理想地至少0.85，更理想地至少0.875，優(yōu)選地至少0.90，更優(yōu)選地 至少0.925并且最優(yōu)選地至少0.95。
[0081] 任何測試的預(yù)測值均取決于該測試的靈敏度和特異性，并且取決于病癥在受試群 體中的流行率。基于貝葉斯定理，這一概念規(guī)定:所篩選的病癥存在于個(gè)體中或群體中的可 能性(測試前概率)越大，陽性測試的有效性越大并且結(jié)果為真陽性的可能性越大。因此，在 病癥存在可能性低的任何群體中使用測試的問題是陽性結(jié)果價(jià)值有限（即更可能為假陽 性）。類似地，在處于非常高風(fēng)險(xiǎn)之中的群體中，陰性測試結(jié)果更可能為假陰性。
[0082] 因此，對于測試在低疾病流行率受試群體(定義為每年的發(fā)生率(發(fā)病率)低于1% 或在特定時(shí)間范圍內(nèi)的累積流行率低于1 〇 %的那些）中的臨床效用，R0C和AUC可具有誤導(dǎo) 性?；蛘撸刹捎帽竟_內(nèi)容中其它地方定義的絕對風(fēng)險(xiǎn)和相對風(fēng)險(xiǎn)比率來確定臨床效用 度。還可根據(jù)測試的測量值將待測試的對象群分類為四份，其中最高四分位數(shù)（群體的 25%)包含對治療無響應(yīng)性具有最高相對風(fēng)險(xiǎn)的對象組，并且最低四分位數(shù)包含對治療無 響應(yīng)性具有最低相對風(fēng)險(xiǎn)的對象組。一般來說，認(rèn)為獲自在低流行率群體中從最高到最低 四分位數(shù)具有超過2.5倍相對風(fēng)險(xiǎn)的測試或測定的值為具有"高診斷精確度"，并且認(rèn)為對 每個(gè)四分位數(shù)具有5至7倍相對風(fēng)險(xiǎn)的那些為具有"非常高診斷精確度"。盡管如此，仍廣泛 地使用獲自在臨床上仍有用之對每個(gè)四分位數(shù)具有僅1.2至2.5倍相對風(fēng)險(xiǎn)的測試或測定 的值作為疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子;至于其對未來事件的預(yù)測，在總膽固醇的情況下和對很多炎性 生物標(biāo)志物而言也是如此。通常來說，這樣的診斷精確度較低的測試必須與另外的參數(shù)組 合以得到治療性干預(yù)的有意義臨床閾值，如與上述全局風(fēng)險(xiǎn)評估指數(shù)組合。
[0083] 健康經(jīng)濟(jì)效用函數(shù)是測量給定測試的成效和臨床價(jià)值的又一種方式，其由以下組 成:基于各自臨床和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的實(shí)際測量來權(quán)權(quán)衡潛在的分類測試結(jié)果。健康經(jīng)濟(jì)成效與 精確度密切相關(guān)，因?yàn)榻】到?jīng)濟(jì)效用函數(shù)特別地分配受試對象之正確分類益處的經(jīng)濟(jì)價(jià)值 和錯(cuò)誤分類的成本。作為成效測量，通常要求測試實(shí)現(xiàn)導(dǎo)致每個(gè)測試的健康經(jīng)濟(jì)價(jià)值增加 (在測試成本之前)超過該測試的目標(biāo)價(jià)格的成效水平。
[0084]臨床算法的構(gòu)建
[0085] 可使用任何公式來將結(jié)果組合成可用于實(shí)施本發(fā)明的指數(shù)。如上所述但不受限 制，除多種其它指示之外，這樣的指數(shù)還可指示對美他多辛作出響應(yīng)的概率、可能性、絕對 或相對機(jī)會(huì)。這可針對特定的時(shí)期或時(shí)間范圍，或者針對剩余壽命風(fēng)險(xiǎn)，或者簡單地提供為 相對于另一參照對象群的指數(shù)。
[0086] 盡管在此對多種優(yōu)選公式進(jìn)行了描述，但是除本文中和上述定義中提及的那些之 外的數(shù)種其它模型和公式類型也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?；谒褂玫膶?shí)際模型類型或 公式在訓(xùn)練群中之結(jié)果的成效和精確度特征，其本身可選自潛在模型的領(lǐng)域。優(yōu)選的公式 包括廣泛種類的統(tǒng)計(jì)分類算法，特別是使用判別分析。判別分析的目的是由之前鑒別的特 征組來預(yù)測類別隸屬。在線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA)的情況下， 鑒別根據(jù)一些標(biāo)準(zhǔn)使組之間的分離最大化的線性特征組合。對于LDA而言，可使用具有不同 閾值之基于e igengene的方法（ELDA)來鑒別特征，或者使用基于多元方差分析 (multivariate analysis of variance，MANOVA)的步進(jìn)算法來鑒別特征?？蛇M(jìn)行基于 Hotel 1 ing-Lawley統(tǒng)計(jì)量使得無分離的概率最小化的向前、向后和逐步算法。
[0087] 基于Eigengene的線性判別分析（Eigengene-based Linear Discriminant Analysis，ELDA)是由Shen等（2006)開發(fā)的特征選擇技術(shù)。該公式使用經(jīng)改進(jìn)的本征分析 (eigen analysis)在多元框架中選擇特征(例如生物標(biāo)志）以鑒別與最重要本征向量相關(guān) 的特征。"重要"定義為解釋試圖相對于某閾值進(jìn)行分類之樣品間差異的最大方差的那些本 征向量。
[0088] 支持向量機(jī)(SVM)是試圖發(fā)現(xiàn)分離兩種類別的超平面的分類公式。該超平面包含 支持向量，即恰好為遠(yuǎn)離該超平面的邊緣距離的數(shù)據(jù)點(diǎn)。在當(dāng)前的數(shù)據(jù)尺寸中不存在分隔 超平面的可能情況下，通過借助采用原始變量的非線性函數(shù)將數(shù)據(jù)映射到更大的尺寸，維 度得到極大拓寬(Venables和Ripley，2002)。盡管不要求，但是過濾SVM的特征常常改善預(yù) 測。對于支持向量機(jī)而言，使用非參數(shù)Kruskal-Wallis(KW)測試來鑒別特征（例如生物標(biāo) 志）以選擇最佳的單變量特征。還可單獨(dú)或者組合地使用隨機(jī)森林(random forest，RF， Breiman，2001)或遞歸分割（recursive part it ioning，RPART，Bre iman等，1984)來鑒別最 重要的生物標(biāo)志組合。KW和RF兩者均要求從所有特征中選擇多個(gè)特征。RPART使用可用生物 標(biāo)志的亞組生成單個(gè)分類樹。
[0089] 可使用其它公式來在其提交于預(yù)測公式之前將各個(gè)ERK和/或Akt磷酸化測量的結(jié) 果預(yù)先處理成更具價(jià)值的信息形式。最顯著的是，歸一化生物標(biāo)志結(jié)果、使用常見的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn) 換(例如對數(shù)函數(shù)或邏輯函數(shù)）、作為正態(tài)或其它分布位置、參照群體的平均值等全部都是 本領(lǐng)域人員公知的。特別感興趣的是基于臨床參數(shù)(例如年齡、性別、種族或性)的一組歸一 化，其中特定公式僅用于一類中的對象，或者將臨床參數(shù)連續(xù)地組合為輸入。在另一些情況 下，可將基于分析物的生物標(biāo)志組合成后續(xù)代入公式的計(jì)算變量。
[0090] 除潛在歸一化之一個(gè)對象的單獨(dú)參數(shù)值之外，還可根據(jù)dAgostino等，（2001) JAMA 286:180-187中概括的技術(shù)或其它類似的歸一化和重校準(zhǔn)技術(shù)基于對群體的預(yù)期流 行率和平均生物標(biāo)志參數(shù)值的調(diào)整來重校準(zhǔn)或另外地調(diào)整用于所有對象或任何已知類對 象的整體預(yù)測公式本身。這些流行病學(xué)調(diào)整統(tǒng)計(jì)量可如下不斷捕獲、確認(rèn)、改善和更新:登 陸提交于可機(jī)讀模型或其它模型的過去數(shù)據(jù)，或者偶爾通過回溯查詢儲(chǔ)存的樣品或參照對 這樣的參數(shù)和統(tǒng)計(jì)量的歷史研究?？梢允枪街匦?zhǔn)或其它調(diào)整的對象的另外實(shí)例包括有 關(guān)比數(shù)比限制之Pepe，M.S.等，2004的研究、涉及R0C曲線的C 〇〇k，N.R.，2007中使用的統(tǒng)計(jì) 量。最后，可通過參照實(shí)際臨床群體以及研究結(jié)果和觀察終點(diǎn)對分類機(jī)公式的數(shù)值結(jié)果自 身進(jìn)行處理后轉(zhuǎn)換，以相對于絕對風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行校準(zhǔn)并提供用于改變分類機(jī)或風(fēng)險(xiǎn)公式之?dāng)?shù)值 結(jié)果的置信區(qū)間。其一個(gè)實(shí)例是給出絕對風(fēng)險(xiǎn)和該風(fēng)險(xiǎn)的置信區(qū)間，其使用參照Genomic Health，Inc ?之Oncotype Dx產(chǎn)品（Redwood City，Calif)中復(fù)發(fā)評分公式的輸出選擇的實(shí) 際臨床研究得到。進(jìn)一步的改進(jìn)是基于分類機(jī)或風(fēng)險(xiǎn)公式的輸出為了針對較小的研究亞群 進(jìn)行調(diào)整，并根據(jù)其臨床參數(shù)(例如年齡或性別)來限定和選擇。 實(shí)施例
[0091 ]實(shí)施例1: 一般性方法
[0092]本文中所述的實(shí)施例是使用下文一般性描述的試劑和方法進(jìn)行的。
[0093] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0094] Fmrl敲除小鼠（K02) (The Dutch-Belgium Fragile X Consortium，1994)最初從 Jackson Laboratory獲得，野生型(WT)同窩小鼠基于C57BL/6J背景產(chǎn)生并且在C57BL/6J背 景上反復(fù)回交超過八代。將Fmrl敲除小鼠以相同基因型為組圈養(yǎng)在具有12小時(shí)照明/黑暗 循環(huán)的溫度和濕度受控室內(nèi)（照明為7am至7pm;測試在照明期進(jìn)行）。連續(xù)記錄容納室內(nèi)的 室溫和濕度，同時(shí)食物和水可自由獲取。在行為實(shí)驗(yàn)期間，對2或6月齡的健康Fmrl敲除小鼠 及其野生型同窩小鼠（N=10小鼠/處理組)進(jìn)行測試。將小鼠圈養(yǎng)在市售的塑料籠中并根據(jù) UK Animals(Scientific Procedures)Act，1986的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均由對基因型 和藥物處理盲態(tài)的實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行。在進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)之前，均允許動(dòng)物具有最短一周的適應(yīng)期。 在適應(yīng)期內(nèi)不施用預(yù)防性或治療性處理。
[0095] 藥物
[0096] 對于研究1(實(shí)施例2)，將美他多辛溶解于鹽水中并以100、150或200mg/kg的劑量 每天一次地腹膜內(nèi)施用7天。對于研究2(實(shí)施例3)，在體內(nèi)測試中，將美他多辛溶解于鹽水 中并以150mg/kg/天的腹膜內(nèi)劑量，或者以150或300mg/kg/天（以0 ? lml的體積）的經(jīng)口劑量 每天一次地施用7天。對于研究2,在體外測試中，將美他多辛以300yM的濃度施用5小時(shí)。在 所有情況下，均使用鹽水作為載劑(對照）。
[0097]行為測試
[0098] 社交相互作用和社交識別記憶:小鼠是社交性物種，其參與容易評分的社交行為， 包括接近、跟隨、嗅探、梳理、侵略性接觸（aggressive encounter )、性互動(dòng)（sexual interaction)、親職行為（parental behavior)、筑巢和成群條縮睡覺（sleeping in a group of huddle)。小鼠中的社交接近通過針對新小鼠的嗅探持續(xù)時(shí)間進(jìn)行評價(jià)。
[0099] 將小鼠置于尺寸與成年小鼠居住籠具有相同數(shù)量級并且地面上具有新鮮木肩的 測試場地/籠中（40 X 23 X 12cm籠，具有有機(jī)玻璃蓋以有利于觀察小鼠）。背景小鼠氣味通過 在測試之前在設(shè)備中放入一些非實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生。在測試前10至15分鐘，將小鼠轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn) 室。將受試對象和幼仔同時(shí)置于測試籠中。評估社交研究的總持續(xù)時(shí)間和回合(bout)數(shù)3分 鐘，其限定為在受試小鼠對刺激幼仔的嗅探和親密跟隨(距離尾部<2(^)。30分鐘之后，使 用相同的刺激幼仔來重復(fù)測試。收集的數(shù)據(jù)參數(shù)為用于獲取和識別的嗅探回合的總持續(xù)時(shí) 間和總次數(shù)。推導(dǎo)出社交記憶率(social memory ratio)，其定義為試驗(yàn)2/試驗(yàn)1+2。因此， 無記憶(例如，20/(20+20) =0.5,記憶(例如，10/(20+10) = <0.5。
[0100] Y形迷宮交替:進(jìn)行兩個(gè)任務(wù)。第一個(gè)任務(wù)是對臂進(jìn)入之間的自發(fā)交替進(jìn)行非學(xué)習(xí) 性評估。第二個(gè)任務(wù)是空間參考記憶任務(wù)，其中動(dòng)物必須學(xué)習(xí)記住兩個(gè)臂中哪一個(gè)裝有食 物獎(jiǎng)勵(lì)誘餌。在開始訓(xùn)練前的當(dāng)天，允許動(dòng)物自由探索迷宮5分鐘。接著，使其接受兩個(gè)試 驗(yàn)，在一個(gè)試驗(yàn)中，將食物放置在左臂，在一個(gè)試驗(yàn)中將食物定位在右臂。該操作防止發(fā)生 偏向一個(gè)臂。
[0101 ] Y形迷宮水迷宮:透明的有機(jī)玻璃Y形迷宮填充有2cm的20 °C水。這促使小鼠在趟水 至一個(gè)臂遠(yuǎn)端的出口管后離開迷宮。將迷宮放置在突出視覺提示圍繞的室的中間。
[0102] 獎(jiǎng)勵(lì)性T形迷宮交替:使用T形式(水平放置時(shí)）的升高或封閉設(shè)備。將小鼠放置在T 的底部并允許其選擇鄰接主干臂（stem)另一端的一個(gè)目標(biāo)臂?？焖龠B續(xù)地進(jìn)行兩個(gè)試驗(yàn)， 第二個(gè)試驗(yàn)要求小鼠選擇之前未訪問過的臂，反映對第一次選擇的記憶（自發(fā)交替）。如果 其交替選擇的話，則通過使動(dòng)物饑餓并用偏愛的食物對其進(jìn)行獎(jiǎng)勵(lì)來增強(qiáng)這一傾向。特別 地，在T形迷宮上的4天適應(yīng)期之后，訓(xùn)練小鼠交替臂選擇以接受甜煉乳作為獎(jiǎng)勵(lì)。
[0103] 連續(xù)通道:該設(shè)備由4個(gè)連續(xù)的、線性排列的、致焦慮作用遞增的通道組成(每個(gè)后 面的通道均涂成較淺的顏色、具有較低的壁和/或比前面的通道窄），所述通道由涂漆的木 材制成。每個(gè)部分或通道的長度為25cm。通道1具有25cm高的壁，寬度為8.5cm并且涂成黑 色。0.5cm的步降（step down)導(dǎo)向通道2，其寬度也為8.5cm但是具有1.3cm高的壁并且為灰 色。1.0cm的步降導(dǎo)向通道3，其寬度為3.5cm、具有0.8cm高的壁并且為白色。0.4cm的步降導(dǎo) 向通道4,其也為白色但是寬度為1.2cm，并且具有0.2cm高的壁。通過將通道1的背面錨定至 50cm高的臺子升高設(shè)備。在臂3和4下方提供有墊料以防小鼠跌落。將每只小鼠放置在通道1 的封閉端，面向壁。針對以下啟動(dòng)計(jì)時(shí)器：1)測試的總時(shí)長(5分鐘)+進(jìn)入每個(gè)壁的潛伏期， 和2)在通道1中花費(fèi)的時(shí)間。當(dāng)小鼠將四肢全部放到下一個(gè)通道時(shí)，認(rèn)為其已進(jìn)入該通道。 記錄在每個(gè)通道中（四肢全部)花費(fèi)的總時(shí)間。
[0104]場景恐懼條件反射:在恐懼條件反射實(shí)驗(yàn)中，將小鼠放置在新環(huán)境(暗室）中并使 其接受成對的暗示和足電擊(〇. 2mA持續(xù)1秒(研究1)或者0.7mA持續(xù)0.5秒(研究2))。隨后， 當(dāng)在初始訓(xùn)練情境中測試時(shí)，小鼠表現(xiàn)出稱為凝滯(freezing) (Blanchard，1969)的自然防 御反應(yīng)或場景恐懼條件反射。凝滯時(shí)間限定為小鼠在除呼吸之外的不活動(dòng)行為中花費(fèi)的時(shí) 間。數(shù)據(jù)表示為測試時(shí)間的百分比。在訓(xùn)練期后24小時(shí)，在不提供電擊下在訓(xùn)練室內(nèi)對小鼠 測試5分鐘，并且觀察凝滯行為。
[0105] 統(tǒng)計(jì)學(xué)：采用多元方差分析來評估數(shù)據(jù)上的組差異。對行為數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量 AN0VA。在每個(gè)AN0VA中的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性影響之后使用Newman-Keuls檢驗(yàn)(研究1)或Tukey檢 驗(yàn)(研究2)進(jìn)行事后比較。認(rèn)為小于0.05的p值是顯著的。
[0106] 生化測試：
[0107] 磷酸化ERK和Akt:Ras-Mek-ERK和PI3K-Akt-mToR信號傳導(dǎo)途徑參與介導(dǎo)突觸可塑 性潛在變化的基因轉(zhuǎn)錄的活性依賴性改變（Klann和Dever，2004)。如Lopez Verrilli (Lopez Verri 11 i等，2009)先前所述通過western印跡分析測量磷酸化ERK和Akt蛋白的表 達(dá)。所采用的抗體為針對Akt (1/1000)和激酶(ERK) 1 /2 (1 /2000)的抗磷酸特異性抗體(Ce 11 Signaling Technology，Danvers，MA，USA)。針對磷酸-ERK的抗體檢測磷酸-ERK1/2的磷酸 化(Thr202/Tyr204)而針對磷酸-Akt的抗體檢測磷酸-Akt的磷酸化(Thr308) jkt和ERK 1/ 2蛋白總含量以及磷酸化的ERK和Akt通過具有抗磷酸-Akt (1/1000)和抗磷酸-ERK抗體（1/ 2000)(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)的印跡膜進(jìn)行評價(jià)。Akt或ERK磷酸 化根據(jù)同一樣品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行歸一化并表示為相對于基礎(chǔ)條件的變化％，認(rèn)為基礎(chǔ) 水平為100%。如下評價(jià)蛋白質(zhì)負(fù)載：剝離膜并用肌動(dòng)蛋白抗體（1/1〇〇〇)(31811^-Aldrich，St. Louis，M0，USA)重新印跡膜。血液淋巴細(xì)胞中的磷酸化ERK和Akt蛋白表達(dá)通過 流式細(xì)胞術(shù)測量。對于淋巴細(xì)胞生物標(biāo)志物測定，使用激發(fā)激光調(diào)節(jié)在488nm的FACStar plus(Becton Dickinson)，并通過515nm至545nm的帶通濾波器收集來自FITC的綠色焚光 (GST)。平均FITC熒光強(qiáng)度相對于參照細(xì)胞的熒光進(jìn)行計(jì)算。平均細(xì)胞熒光強(qiáng)度（mean cellular fluorescence intensity，MFI)與每個(gè)細(xì)胞所結(jié)合的Ab分子的平均數(shù)量成正比。
[0108] 神經(jīng)元形態(tài):海馬細(xì)胞培養(yǎng)物由在妊娠17.5的胚胎日（E17.5)的野生型和Fmr 1K0 胎兒小鼠制備。通過頸脫位處死小鼠并將經(jīng)解離的海馬細(xì)胞鋪在15mm的多孔容器(Falcon Primaria)中。在體外5天后，轉(zhuǎn)染綠色焚光蛋白（GFP)以有利于在藥物處理之后監(jiān)測樹突棘 形態(tài)發(fā)生（Ethell和Yamaguchi，1999 ;Ethell等，2001 ;Henkemeyer等，2003)。在體外約 16天 (DIV)時(shí)形成樹突棘。在第17天，用300yM濃度的美他多辛體外處理培養(yǎng)物5小時(shí)。
[0109] 經(jīng)GFP轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元的絲足密度通過對疊加蔡司透鏡(Zeiss)的共焦生成圖像(40 X物鏡，20 X 0.2wii的疊加)進(jìn)行Shol 1分析來量化。使用Metamorph軟件，在每個(gè)神經(jīng)元的細(xì) 胞體周圍畫等距的同心圓（每20wn)，隨后對每個(gè)圓的絲足數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用未配對的雙 尾Student T檢驗(yàn)對計(jì)數(shù)的平均值進(jìn)行比較。
[0110] 經(jīng)GFP轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元的棘成熟度使用Metamorph軟件（Molecular Devices， Sunny val e，CA)進(jìn)行分析。每個(gè)神經(jīng)元選擇兩個(gè)70wii至1 OOwii的遠(yuǎn)端樹突節(jié)段以用于進(jìn)行棘 形態(tài)測定分析。對于每個(gè)棘，對長度和寬度進(jìn)行測量。將長度定義為從突出底部到突出末端 的距離；而將寬度定義為垂直于棘長軸的最大距離。用已校正為用于多重比較的未配對的 雙尾Student T檢驗(yàn)和AN0VA對測量結(jié)果進(jìn)行比較。
[0111] 海馬蛋白從頭合成：橫向海馬切片(400WI1)獲自6周大的Fmrl敲除和WT小鼠。蛋白 質(zhì)合成測定如先前所述使用基于非放射性熒光激活細(xì)胞分選的測定（翻譯的表面感測 (surface sensing of translation，SUnSET)方法)進(jìn)行，其允許在單獨(dú)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和異 質(zhì)細(xì)胞群中監(jiān)測并量化整體蛋白質(zhì)合成(Hoeffer，2011)。本研究中所使用的美他多辛濃度 為300yM。
[0112] 實(shí)施例2:在脆性X綜合征的Fmrl敲除小鼠模型中，美他多辛（100至200mg/kg)處理 對學(xué)習(xí)和記憶缺陷以及生化異常的影響(研究1)
[0113]行為分析
[0114] 場景恐懼條件反射:初始實(shí)驗(yàn)在N=10WT和Fmrl敲除小鼠的組中測試每天一次地 腹膜內(nèi)施用載劑或150mg/kg美他多辛7天對場景恐懼條件反射的影響。如在測試期期間凝 滯降低所反映的，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠在場景恐懼條件反射模式中表現(xiàn)出學(xué)習(xí)方面 的缺陷（圖1，圖A(p<0.0001))。美他多辛施用在Fmrl敲除小鼠中逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)缺陷作用，這種 逆轉(zhuǎn)是部分的，使得經(jīng)美他多辛處理的動(dòng)物與經(jīng)美他多辛處理的WT動(dòng)物具有差異（p< 0.05)。在N=10WT和Fmrl敲除小鼠的組中重復(fù)該實(shí)驗(yàn)來研究每天一次地腹膜內(nèi)施用載劑、 100或200mg/kg美他多辛7天對場景恐懼條件反射的劑量依賴性影響（圖1，圖B和圖C)。在該 實(shí)驗(yàn)中，與經(jīng)載劑處理的WT小鼠相比，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)缺陷（p< 0.0001)，復(fù)現(xiàn)第一實(shí)驗(yàn)。100mg/kg美他多辛在Fmrl敲除小鼠中產(chǎn)生缺陷逆轉(zhuǎn)(P<0.05)，但 是這是部分逆轉(zhuǎn)，因?yàn)榻?jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的野生型小鼠具 有差異(P<〇.〇〇〇l)。在用200mg/kg i.p.美他多辛處理之后，在Fmrl敲除小鼠中觀察到的 學(xué)習(xí)缺陷完全逆轉(zhuǎn)（經(jīng)處理的Fmrl小鼠與經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠具有差異（P< 0.0001)，但是與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠并無差異）。在任一實(shí)驗(yàn)中，美他多辛處理對WT小 鼠均無影響（圖1，圖A-C)。
[0115] 社交接近:如嗅探回合所指示的，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠表現(xiàn)出較差的社交 接近（圖2(p<0.0001))。用150mg/kg美他多辛每天一次地腹膜內(nèi)處理7天在Fmrl敲除小鼠 中提高社交接近(P<〇.0001，相比較于經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠）。經(jīng)美他多辛處理的 Fmrl敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠具有差異(p<0.05 )，但是具有接近WT小鼠的效 應(yīng)的趨勢。美他多辛處理對WT小鼠無影響。
[0116] Y形迷宮自發(fā)交替：圖3,圖A中示出了在N=10WT或Fmr 1敲除小鼠的組中用載劑或 150mg/kg美他多辛進(jìn)行7天的每天一次處理對自發(fā)交替的影響。與經(jīng)載劑處理的WT小鼠相 比，經(jīng)載劑處理的Fmr 1敲除小鼠表現(xiàn)出較差的自發(fā)交替(p<0.0001)。在Fmr 1敲除小鼠中， 與載劑處理相比，美他多辛處理提高自發(fā)交替(P<〇.0001)，但是相比較于經(jīng)美他多辛處理 的WT小鼠，經(jīng)美他多辛處理的Fmr 1敲除小鼠仍表現(xiàn)出缺陷（p<0.01)。因此，美他多辛產(chǎn)生 在Fmrl敲除小鼠中觀察到的缺陷部分逆轉(zhuǎn)。
[0117] Y形迷宮參考記憶任務(wù)：圖3,圖B中示出了在N = 10WT或Fmr 1敲除小鼠的組中用載 劑或150mg/kg美他多辛進(jìn)行7天的每天一次處理對獎(jiǎng)勵(lì)性參考記憶學(xué)習(xí)的影響。與經(jīng)載劑 處理的WT小鼠相比，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠表現(xiàn)出較不適當(dāng)?shù)谋圻M(jìn)入(p<0.0001)。與 經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠相比，美他多辛處理降低這一缺陷(p<0.0001)，使得經(jīng)美他多 辛處理的Fmrl敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠并無差異。美他多辛處理對WT小鼠無影 響。
[0118] Y形迷宮水迷宮左右辨別：圖3，圖C中示出了在N= 10WT或Fmrl敲除小鼠的組中用 載劑或150mg/kg美他多辛進(jìn)行7天的每天一次處理對厭惡性激發(fā)空間辨別學(xué)習(xí)的影響。與 經(jīng)載劑處理的WT小鼠相比，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠顯示出較高的不正確臂進(jìn)入次數(shù)。 通過用美他多辛處理，這一缺陷得到降低。
[0119] T形迷宮獎(jiǎng)勵(lì)性交替任務(wù)：圖4中示出了在N=10WT或Fmrl敲除小鼠的組中用載劑 或150mg/kg美他多辛進(jìn)行7天的每天一次處理對獎(jiǎng)勵(lì)性交替工作記憶的影響。與經(jīng)載劑處 理的WT小鼠相比，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠表現(xiàn)出較長的到達(dá)正確臂的潛伏期（p< 0.0001)。在Fmrl敲除小鼠中，與載劑處理相比，美他多辛處理降低這一缺陷(p<0.0001)， 這種逆轉(zhuǎn)是部分的，因?yàn)橄啾容^于WT小鼠，經(jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠響應(yīng)較慢(p< 0.0001)。
[0120] 連續(xù)通道:N=10WT或Fmrl敲除小鼠的組中用載劑或150mg/kg美他多辛進(jìn)行7天的 每天一次處理對在連續(xù)通道任務(wù)中的表現(xiàn)的影響示于圖5中，并且在下文進(jìn)行了進(jìn)一步描 述。
[0121] 連續(xù)通道測試有效地測量焦慮（進(jìn)入通道1的潛伏期）和活動(dòng)過度(通道2至4)。從 通道1到通道2、3和4的進(jìn)展與對顏色逐漸明亮的環(huán)境暴露有關(guān)，所述環(huán)境具有越來越低的 壁和越來越窄的更加暴露的開放臂。時(shí)間花費(fèi)在開放臂上并且進(jìn)入開放臂指示焦慮;反之， 在更多的開放臂中花費(fèi)更久的時(shí)間反映活動(dòng)過度。這些因素允許進(jìn)行涵蓋一系列焦慮樣表 現(xiàn)以及活動(dòng)過度的敏感性測試。
[0122] 通道1:與WT小鼠相比，F(xiàn)mrl敲除小鼠表現(xiàn)得較為焦慮(p<0.001)。與經(jīng)載劑處理 的Fmrl敲除小鼠相比，經(jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠表現(xiàn)出焦慮方面的改善（p< 0.001)，使得發(fā)生完全正常化。經(jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小 鼠之間不存在差異。此外，美他多辛處理對WT小鼠并無影響。
[0123] 通道2:當(dāng)與Fmrl敲除小鼠相比時(shí)，WT小鼠在通道2中表現(xiàn)得較不活躍（p< 0.0001)。在Fmrl敲除小鼠中，美他多辛處理降低活動(dòng)過度(p<0.001)，但是活動(dòng)過度的這 種逆轉(zhuǎn)是部分的，因?yàn)榻?jīng)美他多辛處理的Fmr 1敲除小鼠和WT小鼠具有差異(p<0.001)。美 他多辛處理對WT小鼠并無影響。
[0124] 通道3:與WT小鼠相比，F(xiàn)mrl敲除小鼠表現(xiàn)出活動(dòng)過度(p<0.0001)。這種活動(dòng)過度 不能通過美他多辛逆轉(zhuǎn)，因?yàn)榻?jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠與經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小 鼠并無差異。美他多辛處理對WT小鼠并無影響。
[0125] 通道4:與WT小鼠相比，F(xiàn)mr 1敲除小鼠表現(xiàn)出活動(dòng)過度(p<0.01)。美他多辛處理逆 轉(zhuǎn)這種活動(dòng)過度，因?yàn)榻?jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠相比較于與經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除 小鼠表現(xiàn)得較不活躍(P<〇.01)。該影響反應(yīng)了正?；?，因?yàn)榻?jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小 鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠并無差異。美他多辛處理對WT小鼠并無影響。
[0126] 總之，不期望受理論的限制，連續(xù)通道測試顯示，與WT小鼠相比，F(xiàn)mrl敲除小鼠的 焦慮和活動(dòng)過度增加。美他多辛處理在Fmrl敲除小鼠中降低這種焦慮和活動(dòng)過度，而對WT 小鼠并無影響。
[0127] 生化分析
[0128] ERK和Akt的磷酸化：圖6中示出了在N = 5Fmr 1敲除或WT小鼠的組中用載劑或 150mg/kg美他多辛進(jìn)行7天的每天一次腹膜內(nèi)處理對腦中ERK和Akt的整體腦磷酸化的影 響。磷酸化水平以磷酸化ERK與總ERK的比率進(jìn)行評估。該比率增加表示ERK被活化。與載劑 對照相比，在經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除中ERK的磷酸化增加(p<0.001)，這一效應(yīng)復(fù)現(xiàn)在患有 脆性X綜合征的人對象中觀察到的異常ERK活化(Wang等，2012)。美他多辛處理降低了這一 效應(yīng)(P <0.01 )，使得相比較于經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠并無差異。美他多辛對WT小鼠中的 ERK磷酸化或任何小鼠中的總ERK水平無影響。與經(jīng)載劑處理的WT小鼠相比，在經(jīng)載劑處理 的Fmrl敲除小鼠中磷酸化Akt與總AKT的比率也增加(p<0.0001)。在Fmrl敲除小鼠中，用美 他多辛處理降低磷酸化Akt的相對水平(p<0.01)，使得Fmrl敲除小鼠與對照并無差異。美 他多辛處理對WT小鼠或任何小鼠的總Akt水平并無影響。
[0129] 實(shí)施例3.在Fmrl敲除脆性X小鼠模型中對美他多辛的評價(jià)(研究2)
[0130] 美他多辛在6月齡Fmrl敲除小鼠中的行為影響
[0131] 場景恐懼條件反射:初始實(shí)驗(yàn)在N=10WT和Fmrl敲除6月齡小鼠的組中測試每天一 次地腹膜內(nèi)施用載劑或150mg/kg美他多辛7天對場景恐懼條件反射的影響。如在測試期期 間凝滯降低所反映的，與經(jīng)載劑處理的WT小鼠（WT-V)相比，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠 (K0-V)在場景恐懼條件反射模式中表現(xiàn)出學(xué)習(xí)方面的缺陷（圖7(p<0.0001))。在Fmrl敲除 小鼠中，美他多辛施用逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)缺陷效應(yīng)化<〇.〇〇〇1，1(0，-150相對于1(0，）。這是完全逆 轉(zhuǎn)，使得經(jīng)美他多辛處理的K0小鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠沒有差異。
[0132] 社交接近和社交記憶:社交接近數(shù)據(jù)(初始試驗(yàn)1)示于圖8,圖A(嗅探回合次數(shù))和 圖C(嗅探持續(xù)時(shí)間）中。社交記憶數(shù)據(jù)(試驗(yàn)2,試驗(yàn)1后24小時(shí)）示于圖8,圖B(嗅探回合次 數(shù))和圖D(嗅探持續(xù)時(shí)間）中。這些結(jié)果在下文進(jìn)一步討論。
[0133] 在試驗(yàn)1期間，與WT小鼠相比，F(xiàn)mrl敲除小鼠顯示嗅探回合次數(shù)增加(p<0.0001) (參見圖8,圖A)而嗅探持續(xù)時(shí)間降低(p<0.0001)(參見圖8,圖C)。這些社交相互作用缺陷 與其它研究者對Fmrl敲除小鼠的報(bào)道的那些(Thomas等，2011)-致。對于嗅探回合次數(shù)和 持續(xù)時(shí)間兩者，使用美他多辛進(jìn)行處理產(chǎn)生Fmrl敲除小鼠中的異常的逆轉(zhuǎn)（均為p< 0.0001，KO-M-150相對于KO-V)，使得經(jīng)美他多辛處理的Fmr 1敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的 WT小鼠在嗅探回合次數(shù)量度方面沒有差異。同時(shí)，顯示嗅探持續(xù)時(shí)間量度有所補(bǔ)救，但是這 種效應(yīng)是部分的，因?yàn)镕mrl敲除小鼠在美他多辛處理之后與WT小鼠相比仍具有差異（p< 0.05)。美他多辛對WT小鼠并無影響。這些數(shù)據(jù)表明，美他多辛補(bǔ)救Fmr 1敲除小鼠中的異常 社交接近行為。
[0134] 在試驗(yàn)2期間，與野生型小鼠相比，F(xiàn)mrl敲除小鼠顯示嗅探回合次數(shù)增加并且嗅探 持續(xù)時(shí)間增加(對于每個(gè)量度而言，P<〇. 0001;分別為圖8,圖B和圖D)。這反映適應(yīng)失敗，并 且因此反映出社交記憶缺陷。美他多辛處理降低了這些差異(P<〇. 0001，K0-M-150相對于 K0-V)。對嗅探回合次數(shù)的逆轉(zhuǎn)是部分的，因?yàn)榻?jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠和經(jīng)美他多 辛處理的WT小鼠之間仍存在差異(p<0.05)。通過美他多辛的逆轉(zhuǎn)對嗅探持續(xù)時(shí)間而言是 完全的，因?yàn)樵诮?jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠和經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠之間并未觀察 到差異。美他多辛對WT小鼠沒有影響。這些數(shù)據(jù)表明，美他多辛在Fmrl敲除小鼠中降低社交 記憶受損。下面通過社交記憶率(在實(shí)施例1中進(jìn)行了描述）的計(jì)算來對社交記憶缺陷的這 種降低進(jìn)行舉例說明：
[0135] 社交記憶率定義為嗅探回合的持續(xù)時(shí)間：試驗(yàn)2/試驗(yàn)1+2。因此，無記憶的一個(gè)實(shí) 例為(例如20/(20+20) =0.5,而記憶的一個(gè)實(shí)例為(例如10/(20+10) = <0.5。
[0136] 計(jì)算的社交記憶率如下：
[0137] WT-V試驗(yàn)2/試驗(yàn)1+試驗(yàn)2:12.4/12.4+26.8 = 0.3，<0.5記憶
[0138] K0-V 試驗(yàn) 2/試驗(yàn) 1+試驗(yàn) 2:325/325+24 ? 1 =0 ? 9，無記憶
[0139] WT-M 試驗(yàn)2/試驗(yàn) 1+試驗(yàn)2:12 ? 5/38.5+12.5 = 0.2，<0.5 記憶
[0140] K0-M試驗(yàn)2/試驗(yàn)1+試驗(yàn)2:12 ? 7/28 ? 4+12 ? 7 = 0 ? 3，<0 ? 5記憶。
[0141] 美他多辛在6月齡Fmr 1敲除小鼠中的生化影響
[0142] 繼上述行為測試之后，圖9中示出了在N=10Fmrl敲除或WT小鼠中用載劑或150mg/ kg美他多辛進(jìn)行7天的每天一次ip處理對腦中的整體腦pERK(圖9，圖A)和pAkt(圖9，圖B)的 影響。具體地，圖9，圖A示出了pAkt的腦水平，如在之前的實(shí)驗(yàn)中所觀察到的，相比較于WT小 鼠，在Fmr 1敲除小鼠中pAkt的腦水平增加(P<0.0001)。使用美他多辛進(jìn)行處理逆轉(zhuǎn)了腦 pAkt的這一增加化<0.0001，1(0，-150相對于1(0，），使得經(jīng)美他多辛處理的?11^1敲除小鼠 與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠沒有差異。圖9，圖B示出了pERK的腦水平，如在之前實(shí)驗(yàn)中所觀 察到的，相比較于WT小鼠，在Fmrl敲除小鼠中pERK的腦水平增加(p<0.0001，K0-M-150相對 于K0-V)。美他多辛處理逆轉(zhuǎn)了這一增加(p<0.0001)，使得經(jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小 鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠沒有差異。
[0143] 美他多辛在腹膜內(nèi)或經(jīng)口施用之后對2月齡小鼠的行為的影響
[0144] 圖10示出了在2月齡Fmrl敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或者150和300mg/kg經(jīng)口 的劑量每日一次地施用美他多辛7天對場景恐懼條件反射的影響。具體地，圖10，圖A示出了 來自用載劑ip和經(jīng)口處理后的Fmrl敲除和WT小鼠的場景恐懼條件反射數(shù)據(jù)。對于載劑的施 用途徑來說，不存在差異。在通過ip和經(jīng)口途徑進(jìn)行載劑處理之后，相比較于WT小鼠 ，F(xiàn)mrl 敲除小鼠顯示了凝滯行為的降低(在任一情況下，p<0.0001)。圖10,圖B示出了通過兩種施 用途徑進(jìn)行美他多辛處理對WT小鼠的影響。未觀察到影響。圖10,圖C顯示，F(xiàn)mrl敲除小鼠中 的ip 150mg/kg以及經(jīng)口 150和300mg/kg美他多辛處理逆轉(zhuǎn)了在Fmrl敲除小鼠中所觀察到 的凝滯行為減輕（分別為 P<0.01、P<0.0001 和 p<0.0001，針對 K〇-M-ip、K〇-M-po 150 和 KO-M-po 300相對于KO-V-ip和KO-V po)。施用150mg po美他多辛的影響與施用300mg/kg P〇美他多辛的影響沒有差異。在Fmrl敲除小鼠中，150和300mg/kg經(jīng)口美他多辛的影響與 150mg/kg ip美他多辛的影響沒有差異。在任一情況下，逆轉(zhuǎn)都是完全的，因?yàn)榻?jīng)美他多辛 處理的Fmrl敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠沒有差異。
[0145] 圖11示出了在Fmrl敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或者150和300mg/kg經(jīng)口的劑 量每日一次地施用美他多辛7天對社交接近和社交記憶的影響。具體地，圖11，圖A示出了 Fmrl敲除或WT小鼠中載劑或者150mg/kg ip或150和300mg/kg經(jīng)口的美他多辛對社交接近 行為的影響。在用載劑進(jìn)行ip或經(jīng)口處理之后，與WT小鼠相比，在Fmrl敲除小鼠中嗅探行為 的持續(xù)時(shí)間縮短（均為P<〇. 0001)。任意劑量的美他多辛處理對WT小鼠均無影響。然而， 150mg/kg ip、150mg/kg和300mg/kg經(jīng)口的美他多辛處理產(chǎn)生Fmr 1敲除小鼠中所觀察到的 社交接近缺陷逆轉(zhuǎn)（分別為P<〇.0001，針對K〇-M-po 150和K〇-M-po 300相對于K0-V po)。 經(jīng)口美他多辛的影響在150mg/kg和300mg/kg之間不是劑量依賴性的。這種逆轉(zhuǎn)是完全的， 因?yàn)榻?jīng)美他多辛處理的Fmrl敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠沒有差異。在Fmrl敲除小 鼠中，150mg/kg ip美他多辛的影響與150mg/kg經(jīng)口或300mg/kg經(jīng)口美他多辛的影響沒有 差異。圖11，圖B示出了Fmrl敲除或WT小鼠中載劑或者150mg/kg ip或150和300mg/kg經(jīng)口的 美他多辛對社交記憶的影響。在用載劑進(jìn)行ip或經(jīng)口處理之后，與WT小鼠相比，在Fmrl敲除 小鼠中嗅探行為的持續(xù)時(shí)間延長(均為P<〇. 0001)。任意劑量的美他多辛處理對WT小鼠均 無影響。然而，150mg/kg ip、150mg/kg經(jīng)口和300mg/kg經(jīng)口的美他多辛處理產(chǎn)生Fmrl敲除 小鼠中所觀察到的社交接近缺陷逆轉(zhuǎn)(分別為P<〇. 0001、<〇. 05和p<0.01，針對K〇-M-ip 150、0-M-po 50和KO-M-po 300相對于K〇-V-ip和K0-V po)。這種逆轉(zhuǎn)是完全的，因?yàn)榻?jīng)美他 多辛處理的Fmrl敲除小鼠與經(jīng)美他多辛處理的WT小鼠沒有差異。在Fmrl敲除小鼠中， 150mg/kg ip美他多辛的影響與150mg/kg經(jīng)口或300mg/kg經(jīng)口美他多辛的影響沒有差異。 此外，經(jīng)口美他多辛處理的影響在150mg/kg和300mg/kg之間不存在劑量依賴性。
[0146] 在2月齡小鼠中美他多辛在腹膜內(nèi)或經(jīng)口施用之后對生化標(biāo)志物的影響
[0147] 外周淋巴細(xì)胞：圖12示出了如通過流式細(xì)胞術(shù)所測量的，在2月齡Fmrl敲除和WT小 鼠中以150mg/kg ip或150mg/kg和300mg/kg經(jīng)口的劑量每天一次地施用美他多辛7天對淋 巴細(xì)胞pAkt(圖12，圖A)和pERK(圖12，圖B)的影響。具體地，圖12，圖A顯示:與接受等量載劑 處理的WT小鼠相比，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠表現(xiàn)出增加的淋巴細(xì)胞Akt磷酸化（p< 0 ? 0001，針對ip和經(jīng)口施用兩者）。用美他多辛以150mg/kg ip或者150mg/kg或300mg/kg的 經(jīng)口劑量每天一次地處理7天使過度活化的Akt正?；?，使得pAkt水平在經(jīng)美他多辛處理的 Fmrl敲除小鼠和接受相同處理的WT小鼠之間沒有差異。圖12,圖B顯示：與接受等量載劑處 理的WT小鼠相比，經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠表現(xiàn)出增加的淋巴細(xì)胞ERK磷酸化（p< 0 ? 0001，針對ip和經(jīng)口施用兩者）。用美他多辛以150mg/kg ip或者150mg/kg或300mg/kg的 經(jīng)口劑量每天一次地處理7天使過度活化的ERK正?；沟胮ERK水平在經(jīng)美他多辛處理的 Fmrl敲除小鼠和接受相同處理的WT小鼠之間沒有差異。
[0148] 腦區(qū)域：圖13示出了施用150mg/kg美他多辛7天對海馬、前額皮質(zhì)和紋狀體中的 pERK水平的影響。在所有三個(gè)腦區(qū)域中，相比較于WT小鼠，在Fmrl敲除小鼠中pERK水平均提 高（在所有情況下，P<〇.0001)。與經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠相比，在經(jīng)美他多辛處理的 Fmr 1敲除小鼠中pERK水平降低(在所有情況下，p <0.0001)。KO-M和WT-M組之間在海馬和紋 狀體中沒有差異，表明ERK活化的完全逆轉(zhuǎn)。在前額皮質(zhì)中的影響是部分的，K0-V和K0-M組 保持不同(P <〇. 05)。美他多辛對WT小鼠并無影響。
[0149] 圖14示出了施用150mg/kg美他多辛7天對海馬、前額皮質(zhì)和紋狀體中的pAkt水平 的影響。在所有三個(gè)腦區(qū)域中，相比較于WT小鼠，在Fmrl敲除小鼠中pAkt水平均提高(在所 有情況下，P<〇.0001)。在所有三個(gè)腦區(qū)域中，與經(jīng)載劑處理的Fmrl敲除小鼠相比，在經(jīng)美 他多辛處理的Fmrl敲除小鼠中pAkt水平均降低（在所有情況下，p<0.0001)。在所有情況 下，K0-M和WT-M組之間均沒有差異，表明Akt活化的完全逆轉(zhuǎn)。美他多辛對WT小鼠并無影響。 腦和血液高水平的磷酸化ERT和Akt的降低與Fmrl敲除小鼠的行為改善結(jié)果有關(guān)，表明磷酸 化水平是美他多辛處理響應(yīng)的生物標(biāo)志。
[0150] 美他多辛對來自Fmrl敲除小鼠之原代海馬神經(jīng)元中的樹突絲足密度和成熟的體 外影響。
[0151] 圖15(圖A至C)示出了用300yM美他多辛處理5小時(shí)的影響。將樹突分成10個(gè)lOywn 的節(jié)段，每個(gè)均基于離胞體的距離(近端至遠(yuǎn)端，從左到右）。在節(jié)段3中，與來自WT小鼠的神 經(jīng)元相比，在來自Fmr 1敲除小鼠的神經(jīng)元中棘密度增加。具體地，圖15，圖A示出了神經(jīng)元絲 足的密度。來自Fmrl敲除小鼠的原代海馬神經(jīng)元顯示絲足密度增加(p<0.001)。用300yyM 美他多辛處理在Fmrl敲除小鼠中降低了神經(jīng)元絲足密度的異常增加(p<0.001)。來自Fmrl 敲除小鼠的神經(jīng)元示出具有不成熟特征的較長（圖15,圖B(p<0.01))和較窄（圖15,圖C(p <0.01))的絲足。用美他多辛處理逆轉(zhuǎn)絲足長度的這種增加（圖15,圖B(p<0.01))并且逆 轉(zhuǎn)寬度的減?。▓D15,圖C(p<0.01))。
[0152 ]美他多辛對Fmr 1敲除小鼠中的海馬蛋白質(zhì)從頭合成的體外影響 [0153]圖16示出了來自Fmrl敲除或WT小鼠的400yM海馬切片中用載劑或300yM美他多辛 處理對蛋白質(zhì)基礎(chǔ)從頭合成的影響。與經(jīng)載劑處理的WT對照海馬相比，在經(jīng)載劑處理的來 自Fmrl敲除小鼠的海馬中蛋白質(zhì)合成較高(p<0.0001)。在Fmrl敲除小鼠的海馬中，美他多 辛處理降低了蛋白質(zhì)合成速率。這種影響是部分的，因?yàn)閬碜訤mrl敲除小鼠的海馬相比較 于經(jīng)美他多辛處理之來自WT小鼠的海馬保持較高的蛋白質(zhì)合成速率(p<0.001)。

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 在已接受美他多辛治療之患有脆性X綜合征或其它認(rèn)知障礙的對象中評估美他多辛 治療方案之有效性的方法，其包括： a) 測量源自所述對象的樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量； b) 測量所述樣品中ERK和Akt蛋白的總量； c) 計(jì)算步驟(a)中確定的磷酸化ERK和Akt蛋白量與步驟b)中確定的ERK和Akt蛋白量的 比率;和 d) 將步驟c)的計(jì)算比率與由未患病對象測量的計(jì)算比率進(jìn)行比較，其中當(dāng)步驟c)的計(jì) 算比率與所述未患病對象的計(jì)算比率近似時(shí)，指示所述治療是有效的。2. 確定患有脆性X綜合征或其它認(rèn)知障礙的對象是否將從美他多辛治療方案獲益的方 法，其包括： a) 測量源自所述對象的樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量； b) 測量所述樣品中ERK和Akt蛋白的總量； c) 計(jì)算步驟(a)中確定的磷酸化ERK和Akt蛋白量與步驟b)中確定的ERK和Akt蛋白量的 比率;和 d) 將步驟c)的計(jì)算比率與由未患病對象測量的計(jì)算比率進(jìn)行比較，其中當(dāng)步驟c)的計(jì) 算比率高于所述未患病對象的計(jì)算比率時(shí)，指示所述對象將從所述美他多辛治療方案獲 益。3. 在患有脆性X綜合征或其它認(rèn)知障礙的對象中監(jiān)測美他多辛治療方案的方法，其包 括： a) 在第一時(shí)期測量來自所述對象的第一樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量； b) 在所述第一時(shí)期測量所述第一樣品中ERK和Akt蛋白的總量； c) 計(jì)算步驟a)中確定的磷酸化ERK和Akt蛋白量與步驟b)中確定的總ERK和Akt蛋白量 的第一比率； d) 在第二時(shí)期測量來自所述對象的第二樣品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量； e) 在所述第二時(shí)期測量所述第二樣品中ERK和Akt蛋白的總量； f) 計(jì)算步驟d)中確定的磷酸化ERK和Akt蛋白量與步驟e)中確定的ERK和Akt蛋白總量 的第二比率以生成第二比率； d)將所述第一比率與所述第二比率進(jìn)行比較。4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中當(dāng)所述第二比率低于所述第一比率時(shí)，指示所述治療是 有效的。5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測量步驟包括免疫測定。6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是全血或其級分。7. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述PMBC是淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞。
【文檔編號】G01N33/50GK105917225SQ201480060722
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年9月9日
【發(fā)明人】喬納森·魯賓, 亞龍·達(dá)尼埃, 約翰娜·舒曼
【申請人】阿爾考布拉有限公司