電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法利用，魯米諾電致化學發(fā)光被首次應用于單細胞內(nèi)生物分子(如葡萄糖)的檢測。在檢測過程中，單個細胞被直接定位在單個細胞大小的微洞電極；加入含有魯米諾、曲通100和葡萄糖氧化酶的混合溶液后，曲通100可以破壞細胞膜，釋放細胞內(nèi)的葡萄糖到微洞中，和洞內(nèi)的葡萄糖氧化酶反應生成過氧化氫；過氧化氫與魯米諾反應在正電位下產(chǎn)生光信號。這種新發(fā)明的電化學發(fā)光測定方法將有可能被應用于對單細胞中更多的細胞內(nèi)分子進行快速分析，以闡明細胞間的異質(zhì)性。
【專利說明】
電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物儀器檢測領域，具體涉及一種電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法。
【背景技術】
[0002]電化學發(fā)光是物質(zhì)發(fā)生電化學反應后形成的激發(fā)態(tài)物質(zhì)躍迀、釋放能量并誘導光學輻射的一個過程。與化學發(fā)光和熒光等檢測系統(tǒng)相比，電化學發(fā)光結合了電化學和光學方法，具有許多獨特的優(yōu)點。具體而言，與化學發(fā)光相比，電化學發(fā)光更可控，對于發(fā)射光的選擇性分離也更好;與熒光相比，電化學發(fā)光不存在激發(fā)光，這使得背景光的干擾被降到最低，從而獲得較高的靈敏度。因此，在生化分析中，電化學發(fā)光是一種強有力的分析工具。
[0003]眾所周知，魯米諾-過氧化氫體系能產(chǎn)生較強的電化學發(fā)光。在此過程中，魯米諾和過氧化氫發(fā)生電化學反應產(chǎn)生對二氮烯和其他含氧化物，并進一步經(jīng)過高能電子轉(zhuǎn)移反應，生成3-氨基鄰苯二甲酸，進而發(fā)射光信號?？紤]到相應的氧化酶與目標分子反應會產(chǎn)生過氧化氫，我們在先前的工作中引入膽固醇氧化酶，利用魯米諾電化學發(fā)光，對膽固醇在單個細胞細胞膜中的含量進行分析。為了提高分析速度，我們意識到可以使用電化學發(fā)光成像進行平行測定，即使用電子倍增CCD(EM CCD)把多個細胞表面的過氧化氫或者活性膽固醇的發(fā)光情況記錄在一張圖像中。雖然我們的工作已經(jīng)證明了電化學發(fā)光是單細胞分析的有效方法，然而這個方法受限于分析細胞表面分子。因為細胞內(nèi)小分子波動與細胞活性相關聯(lián)，對于生物學研究而言是相當重要，因此如能利用電化學發(fā)光對細胞內(nèi)分子進行，將具有重要的生物學意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法。
[0005]技術方案:為實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明的電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法，待檢測的成分在對應的氧化酶的作用下催化產(chǎn)生雙氧水，其特征在于，包括如下步驟:
[0006](I)提供表面具有若干微孔的氧化銦錫電極表面作為微電極，將該微電極作為工作電極與電化學工作站連接，銀/氯化銀和鉑電極分別作為參比電極和輔助電極，通過電沉積將金納米顆粒沉積到微電極的微孔表面；
[0007](2)以含有200-500μΜ L012的10_20mM PBS的混合溶液作為氧化銦錫片發(fā)光成像的溶液加入到微孔中，將待分析的單個細胞設置于微孔內(nèi)，加入表面活性劑和待分析成分對應的氧化酶，使用電壓發(fā)生器施加正負交替的電壓在電極上誘使發(fā)光，然后使用電化學發(fā)光成像裝置連續(xù)采集曝光時間為60s的兩張照片，來收集來自細胞的發(fā)光信號；
[0008](3)使用Image J軟件計算兩個圖像中發(fā)光強度的差異，同時為了校準來自ITO微孔處的發(fā)光差異，將50-100μΜ過氧化氫水溶液引入微孔內(nèi)并對微孔發(fā)光的光強進行采集，在微電極的微孔內(nèi)的單個細胞的發(fā)光強度和加入的過氧化氫收集到的發(fā)光強度的比率作為信號被用于細胞內(nèi)成分的分析檢測。
[0009]其中，所述的待檢測成分可以為葡萄糖、乳酸或膽固醇中的任意一種或其他在氧化酶作用下可以產(chǎn)生雙氧水的物質(zhì)。
[0010]優(yōu)選地，步驟(I)中，所謂微電極表面設置有64-256個用于容納單個細胞的微孔。[0011 ] 所述金納米粒子的電沉積通過在含有l(wèi)-5mM HAuCl4的0.1M HCl溶液中，循環(huán)掃描得到，其中，電勢由-0.2V到0.55V，循環(huán)掃描400-800s。
[0012]所述電壓發(fā)生器施加的正負交替的電壓為lV，2s和_lV，0.5s。
[0013]步驟(2)中，所述的表面活性劑為0.1 -0.5 %的Tr i ton X-100，所述的葡萄糖氧化酶的濃度為0.l-0.5U/mL。
[0014]在本文中，電化學發(fā)光方法被首次嘗試用來分析單細胞中的物質(zhì)，細胞內(nèi)的葡萄糖被選為模型分子。如圖1所示，單個細胞被置于氧化銦錫電極表面的微孔上。加入的表面活性劑，如triton X-100，可以溶解細胞膜，使得細胞內(nèi)葡萄糖被釋放，與溶液中的葡萄糖氧化酶進行反應;生成的過氧化氫在正電壓的刺激下，可以誘導發(fā)光，以實現(xiàn)細胞內(nèi)葡萄糖的分析。微孔結構的設計不僅可以保留單個細胞，也可以降低過氧化氫從氧化銦錫電極表面擴散到微孔的過程，從而可以在一段時間內(nèi)應該使用魯米諾發(fā)光成像系統(tǒng)持續(xù)地收集光信號，實現(xiàn)單細胞的快速檢測。本發(fā)明實現(xiàn)了可以同時檢測多個細胞，增加了檢測通量，并通過對微孔鍍金修飾，增強了發(fā)光信號，從而實現(xiàn)微洞的電致發(fā)光成像。
【附圖說明】
[0015]圖1電致化學發(fā)光成像裝置和單細胞細胞內(nèi)葡萄糖的檢測技術示意圖；
[0016]圖2微孔中電沉積AuNPs(實線)和未沉積Au NPs(虛線)的ITO區(qū)域的特征發(fā)光曲線。光電倍增管(PMT)電壓為800V;
[0017]圖3氧化銦錫片上制備的微洞鍍金后在含有200μΜL012的1mM PBS中電致化學發(fā)光照片。(A)明場照片；(B-H)5，10，20，50，100，200，500μΜ雙氧水加入前后的發(fā)光差異照片；
(I)發(fā)光差異強度和雙氧水濃度的相關性。誤差棒代表來自64個微洞的發(fā)光強度的標準偏差;
[0018]圖4(A)單個細胞位于微洞中的明場照片；(B)加入葡萄糖氧化酶和曲通100后在第一個60s采集的發(fā)光照片；(C)第二個60s采集的發(fā)光照片；(D)這兩張照片的發(fā)光差異；
[0019]圖5(A)微洞中單個饑餓細胞的明場圖像；(B)只加入曲通100后，第一個個60s內(nèi)收集到的發(fā)光圖像;(C)第二個60s內(nèi)收集的發(fā)光圖像;(D)兩張圖像之間的發(fā)光差異；
[0020]圖6(A)微孔中單個饑餓細胞的明場圖像；(B)加入葡萄糖氧化酶/曲通100后首個60s內(nèi)收集到的發(fā)光圖像;(C)第二個60s內(nèi)收集的發(fā)光圖像;(D)兩張圖像之間的發(fā)光差異；[0021 ]圖7(A) 128個正常細胞的發(fā)光比率；(B) 128個饑餓處理4h的細胞.每個點代表一個細胞。
【具體實施方式】
[0022]下面通過具體的實例詳細說明本發(fā)明的技術方案。
[0023]化學試劑和細胞培養(yǎng):光致抗蝕劑SU-8和顯影劑是從Microchem公司(Newton，MA)購置的?；衔?-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3，4-d]噠嗪-1，4(2H，3H)_ 二酮(L012)從光化工美國公司購買得到。其他所有化學試劑都是從西格瑪奧德里奇公司購置的。實驗中采用電阻率為18.2MΩ /cm的純水。緩沖溶液均經(jīng)過消毒處理。
[0024]Hela細胞來自于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所(中國上海)C=Hela細胞在加有10% (v/v)牛胎血清(FBS)和I %(v/v)抗菌素(青霉素/鏈霉素)的DEME高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)過程在37 °C恒溫，含5 % C02的濕潤環(huán)境中進行。
[0025]本實例提供了一種電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法，包括如下步驟:
[0026](I)金納米顆粒(Au-NPs)在氧化銦錫微洞電極表面的沉積:在氧化銦錫表面上制備獲得了直徑為30微米的64個微洞，用于容納單個細胞。簡要來說，在氧化銦錫片(邊長2cm)上旋轉(zhuǎn)鍍上一層厚度約30μπι的SU-8光刻膠，65°C軟烤3分鐘，95°C軟烤7分鐘后，通過氧化鐵掩模片和光刻系統(tǒng)對氧化銦錫玻璃上的光刻膠紫外照射20s;接著65°C軟烤I分鐘，95°C軟烤3分鐘，未聚合的光刻膠通過SU-8顯影劑進行移除;暴露出來的ITO區(qū)域就可以導電，得到一個有64個孔徑為30μπι的微孔電極。接下來，將具有微洞的玻片在120°C下硬烤30min;并將O型圈粘附在氧化銦錫片上，以形成細胞室。將該微電極作為工作電極與電化學工作站(CHI 630E，辰華公司)連接，銀/氯化銀和鉑電極分別作為參比電極和輔助電極。金納米粒子的電沉積通過在含有ImM HAuCl4的0.1M HCl溶液中.循環(huán)掃描(電勢由-0.2V到0.55V，400s)得到。(2)電化學發(fā)光成像:化學發(fā)光成像的光學裝置如圖1所示，其由1X目鏡(Olympus ,Japan)、一根管和 EM CCD (Evo Ive ,Photometries，Tuson，AZ)所組成，這種直立的成像系統(tǒng)設計使得傳輸過程中化學發(fā)光損失達到最小，且提供了最短的光通路傳輸。分散的細胞在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4，1011^)環(huán)境中與20(^1 L012—起加入細胞格室，單個細胞借助其自身重力落入細胞格室大小的微孔中，顯微鏡下通過反復操作達到高負載效率。多余的細胞在粘附在洞外表面前，使用新鮮緩沖溶液反復輕柔清除掉。裝有細胞的64微孔的氧化銦錫玻璃片作為工作電極，Ag/AgCl電極和Pt絲分別作為參考電極和輔助電極連接;含有200μΜ L012的1mM PBS(pH 7.4)作為氧化銦錫片發(fā)光成像的溶液。電壓發(fā)生器(DG1021，1^801，0^肪)施加正負交替的電壓(1￥，28和-1￥，0.58)在電極上誘使發(fā)光。隨后，在緩沖溶液中加入0.1%的Triton X-100和0.lm/mL葡萄糖氧化酶，對細胞進行裂解;釋放細胞內(nèi)的葡萄糖與葡萄糖氧化酶發(fā)生反應雙氧水，提高發(fā)光強度。使用EM CCD連續(xù)采集曝光時間為60s的兩張照片，來收集來自細胞的發(fā)光信號。這兩個圖像中發(fā)光強度的差異，使用Image J軟件進行計算。為了校準來自ITO微孔處的發(fā)光差異，50μΜ過氧化氫水溶液被引入并對微孔發(fā)光的光強進行采集。在微洞電極上細胞和過氧化氫收集到的發(fā)光強度的比率作為信號被用于細胞內(nèi)葡萄糖的分析檢測。
[0027]實驗結果
[0028]為了實現(xiàn)細胞內(nèi)葡萄糖的分析檢測，對微孔中過氧化氫溶液的成像是非常關鍵的。我們在之前的一些工作中已經(jīng)證實了，通過電化學發(fā)光成像，氧化銦錫表面ΙΟμΜ濃度的過氧化氫是可以被檢測到的。然而，氧化銦錫玻璃在經(jīng)過多重的微加工過程制備微洞后發(fā)光很弱，造成較高的檢測限。發(fā)光效率的損失可能是由于氧化銦錫的微孔區(qū)域在經(jīng)過微加工后殘留的光刻膠所導致的。由于有報道表明，金納米粒子(Au NPs)能夠加速與魯米諾電化學發(fā)光相關聯(lián)的電化學反應，產(chǎn)生更多的電化學發(fā)光信號，因此我們在氧化銦錫微孔中電鍍產(chǎn)生Au NPs以改善檢測限。優(yōu)化后的的電鍍時間為400s，相對于沒有修飾Au NPs的ITO區(qū)域，Au NPs覆蓋的氧化銦錫區(qū)域的發(fā)光量增加了十倍，發(fā)光情況如圖2中所示。發(fā)光強度的增加使得氧化銦錫微孔中過氧化氫電化學發(fā)光具有了較好的檢測限。
[0029]圖3A顯示出，在10倍目鏡下氧化銦錫片上的64微孔在電鍍修飾AuNPs后的明場照片。當過氧化氫濃度從5μΜ上升到升高到500μΜ時，魯米諾發(fā)光照片被收集。圖3Β-Η中計算并展示了過氧化氫加入前后光信號的差異。加入后發(fā)光信號的增強說明過氧化氫在氧化銦錫微洞電極上可以被觀測到。發(fā)光強度的增加與過氧化氫的濃度呈正相關，如圖31所示，這表明了我們的平臺可以提供單細胞的定量檢測。過氧化氫的檢測限是5μΜ，比我們以前實驗中的檢測限(ΙΟμΜ)有所改善。這些64孔板中微孔的發(fā)光強度的相對標準偏差為17.6%，接近我們課題組之前報告過的八個微電極陣列的標準偏差15.6%。這種標準偏差的相似性說明微孔中Au NPs覆蓋的ITO區(qū)域是相對均勻的。
[0030]為了實現(xiàn)單個細胞中葡萄糖的快速分析，電致化學發(fā)光成像被應用于同時記錄64個細胞/微孔的發(fā)光強度。圖4Α顯示了有單細胞的64微孔的明場圖像。細胞成功進入到微孔中的效率超過了80%。無細胞的微孔或有多個細胞的微孔在接下來的電化學發(fā)光分析中被排除。在葡萄糖氧化酶/Titron Χ-100被加入到緩沖溶液中之后，視頻記錄顯示了微孔中的細胞在第45-60S開始破碎。因此，如圖4Β和C所示，以60s的曝光時間進行成像。在第一幅圖像中，發(fā)光強度顯示背景發(fā)光僅僅是來源于L012的。在第二個圖像中，L012，以及從細胞內(nèi)釋放出的葡萄糖與水溶液中葡萄糖氧化酶反應產(chǎn)生的過氧化氫是發(fā)光的主要來源。圖4D展示了這兩張圖像的發(fā)光差異，每個微孔顯示出了更多的發(fā)光。如圖5中所示，加入Titron X-100進行對照實驗表明，這兩張圖像沒有給出任何發(fā)光差異。這些結果表明，我們的電致化學發(fā)光成像方法能夠在單細胞層面實現(xiàn)對胞內(nèi)葡萄糖的可視化。
[0031]為了校準從這些細胞產(chǎn)生的光強，裝載有細胞的氧化銦錫片被洗凈，除去殘留在微孔中的過氧化氫;然后，由50μΜ過氧化氫，200μΜ L012和0.1 %的Titron Χ-100構成的新鮮緩沖液被加入到氧化銦錫表面，重新進行發(fā)光成像。圖7Α中顯示了 128個細胞在給予50μΜ過氧化氫下的發(fā)光情況，平均發(fā)光率的計算結果是1.06±0.46，證明了微孔中過氧化氫濃度在50μΜ附近。考慮一個細胞和一個微孔的體積分別是IpL和21pL，細胞內(nèi)的葡萄糖濃度被估計為約1禮，這是與文獻值比較接近的。128個細胞的相對標準偏差是43.4% ;根據(jù)目前我們所能了解到的，這是首次對細胞內(nèi)葡萄糖水平的巨大差異有所報道。由于葡萄糖是細胞中重要的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，這種差異可以促進我們進一步理解細胞之間的異質(zhì)性。
[0032]為了進一步驗證我們對細胞內(nèi)葡萄糖含量的測定方法，對“饑餓”細胞進行了實驗。在此實驗中，這些細胞被置于細胞外緩沖溶液(ECB:135mM NaCl，5mM KCl, ImM MgCl2,ImM CaCl2aOmM HEPES，5mM glucose,pH 7.4)中培養(yǎng)4個小時，以降低細胞內(nèi)的葡萄糖含量?！梆囸I”細胞的明場和圖像之間的差異顯示在圖6中。在微孔中觀測到了微弱的發(fā)光，這也證實了在“饑餓”細胞中仍然存在一定量的葡萄糖。與對正常細胞的測定類似，利用50μΜ過氧化氫產(chǎn)生的光強對128個細胞的發(fā)光情況進行校正，如圖7Β所示。與正常細胞的結果相比，對“饑餓”細胞的發(fā)光情況進行計算可以得到一個較小的平均值，約為0.36±0.19，這應當歸因于在饑餓期間的葡萄糖消耗。根據(jù)圖31中的校準曲線，可以估計細胞內(nèi)的葡萄糖濃度約為0.36mM。這個對不同狀態(tài)下細胞內(nèi)葡萄糖水平的變化證實了發(fā)光強度與細胞內(nèi)葡萄糖濃度是相關聯(lián)的。這個實驗的相對標準偏差為52.8%，揭示了在饑餓處理后細胞的異質(zhì)性仍然存在。
[0033]在本實例中，魯米諾電化學發(fā)光首次被應用在對單個細胞內(nèi)的葡萄糖進行分析。在與電化學發(fā)光成像平臺結合之后，64個單細胞在60s內(nèi)就能得到分析，這大大加快了單細胞分析速度。在對正常細胞和饑餓細胞的胞內(nèi)葡萄糖進行觀測后，研究結果顯示細胞之間展現(xiàn)出了高度的異質(zhì)性。這是首次利用電致化學發(fā)光分析對單細胞內(nèi)分子進行檢測，這將解除此前該技術僅能被用于測量細胞表面物質(zhì)的限制。因此，這種方法將會被用于檢測更多的細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，從而對更多的生物現(xiàn)象加以探討。
【主權項】
1.一種電致化學發(fā)光成像方法快速分析單細胞內(nèi)成分的方法，待檢測的成分在對應的氧化酶的作用下催化產(chǎn)生雙氧水，其特征在于，包括如下步驟: (1)提供表面具有若干微孔的氧化銦錫電極表面作為微電極，將該微電極作為工作電極與電化學工作站連接，銀/氯化銀和鉑電極分別作為參比電極和輔助電極，通過電沉積將金納米顆粒沉積到微電極的微孔表面； (2)以含有200-500μΜL012的10-20mM PBS的混合溶液作為氧化銦錫片發(fā)光成像的溶液加入到微孔中，將待分析的單個細胞設置于微孔內(nèi)，加入表面活性劑和待分析成分對應的氧化酶，使用電壓發(fā)生器施加正負交替的電壓在電極上誘使發(fā)光，然后使用電化學發(fā)光成像裝置連續(xù)采集曝光時間為60s的兩張照片，來收集來自細胞的發(fā)光信號； (3)使用ImageJ軟件計算兩個圖像中發(fā)光強度的差異，同時為了校準來自ITO微孔處的發(fā)光差異，將50-100μΜ過氧化氫水溶液引入微孔內(nèi)并對微孔發(fā)光的光強進行采集，在微電極的微孔內(nèi)的單個細胞的發(fā)光強度和加入的過氧化氫收集到的發(fā)光強度的比率作為信號被用于細胞內(nèi)成分的分析檢測。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述的待檢測成分為葡萄糖、乳酸或膽固醇中的任意一種。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所謂微電極表面設置有64-256個用于容納單個細胞的微孔。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述金納米粒子的電沉積通過在含有l(wèi)_5mM HAuClJ^0.lM HCl溶液中，循環(huán)掃描得到，其中，電勢由-0.2V到0.55V，循環(huán)掃描400-800s。5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述電壓發(fā)生器施加的正負交替的電壓為lV，2s和-lV，0.5s。6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的表面活性劑為0.Ι-Ο.5 % 的Triton X_100，所述的葡萄糖氧化酶的濃度為0.1-0.5U/mL。
【文檔編號】G01N21/76GK105928927SQ201610237426
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】江德臣, 方丹君, 徐晶晶
【申請人】南京大學