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一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測(cè)的試劑盒的制作方法

文檔序號(hào):10568767閱讀:361來源:國知局
一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測(cè)的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測(cè)的試劑盒。腸致病性大腸桿菌EPEC作用部位在小腸,粘附在十二指腸、空腸和回腸上段粘膜、使微絨毛刷狀緣破壞。是嬰幼兒腹瀉的主要病原菌?,F(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法耗時(shí)耗力,檢測(cè)不便,而本發(fā)明提供了特異性檢測(cè)腸致病性大腸桿菌的試劑盒,試劑盒中含有特異性結(jié)合腸致病性大腸桿菌的適配子,所述適配子為單鏈DNA。本發(fā)明試劑盒具有檢測(cè)時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),在食品與衛(wèi)生安全檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說明】一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測(cè)的試劑盒 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測(cè) 的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 致病性大腸桿菌(EPEC)是一種以糞口途徑傳播的,能導(dǎo)致人類多系統(tǒng)感染的腸道 致病菌,尤其是引起嬰幼兒的腹瀉,成人的腸道及泌尿系統(tǒng)感染。自七十年代以來,EPEC已 成為醫(yī)院獲得性感染中一種活躍的病原微生物。致病性大腸桿菌是嬰兒腹瀉的主要病原 菌,不產(chǎn)生毒素,有高度傳染性,嚴(yán)重者可致死,成人少見。致病性大腸桿菌根據(jù)是否含有 EPEC黏附因子(EPEC adherence factor, EAF)的質(zhì)粒而被分成典型致病性大腸桿菌 (typical EPEC)和非典型致病性大腸桿菌(atypical EPEC)。非典型致病性大腸桿菌既可 以感染人也可以感染牲畜;典型致病性大腸桿菌以人為唯一宿主,而且多見于發(fā)展中國家, 發(fā)達(dá)國家較少見。
[0003] 腸致病性大腸埃希菌是引起全球嬰幼兒腹瀉和成人散發(fā)性腹瀉的重要病原菌之 一,目前研究表明EPEC主要通過黏附和脫落損傷導(dǎo)致腸粘膜損傷。腸致病性大腸埃希菌 EPEC感染的特點(diǎn)是病原菌能本能性粘附到宿主細(xì)胞膜,破壞細(xì)胞微絨毛,并在粘附細(xì)菌下 誘導(dǎo)由細(xì)胞支架蛋白形成杯樣基底膜,運(yùn)種現(xiàn)象稱之為"粘附與脫落損傷"。EPEC的粘附與 脫落效應(yīng)特征是依賴Es地、EspD和EspA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成了對(duì)宿主細(xì)胞的緊密粘附,并在粘附 細(xì)胞下清除細(xì)胞微絨毛,積累纖維肌動(dòng)蛋白。Es地蛋白可與EspD蛋白相互作用而插入宿主 細(xì)胞膜形成微孔,使得EPEC毒力因子可通過細(xì)胞膜上形成的微孔直接進(jìn)入宿主細(xì)胞,入侵 的毒力因子促使細(xì)菌粘附與抹平效應(yīng)的形成。Es地缺失的突變EPEC不能介導(dǎo)臨近粘附細(xì)胞 微絨毛的延伸,也不能阻止巨隧細(xì)胞的吞隧作用。由于Es地蛋白是腸致病性大腸桿菌致病 的關(guān)鍵蛋白,若能找到能抑制EPEC的致病作用的物質(zhì),將為EPEC治療尋找新的策略,為未來 預(yù)防和治療EPEC做出重大貢獻(xiàn)。
[0004] 目前,國內(nèi)外在食品中大腸桿菌檢測(cè)時(shí)常用的檢測(cè)方法因其檢測(cè)手段、識(shí)別對(duì)象 各有不同而各具優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)檢測(cè)大腸桿菌的方法需要先分離再培養(yǎng),然后用經(jīng)典的方法 鑒定,耗時(shí)、不靈敏是這些方法普遍存在的問題。免疫學(xué)方法簡(jiǎn)單、方便、迅速、特異性較好, 但是仍有交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技 術(shù)雖具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn),但其在檢測(cè)數(shù)目較多的樣品時(shí)操作比較繁雜,因此在聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出很多新型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),如多重 PCR技術(shù),然而多重PCR雖簡(jiǎn)化了PCR實(shí)驗(yàn)的操作,但是由于該技術(shù)需數(shù)對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò) 增,很容易產(chǎn)生非特異性條帶或假陽性,影響檢測(cè)結(jié)果。
[0005] 通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)篩選獲得的寡核苷酸序列稱為適配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫,其隨機(jī)序列長(zhǎng)度 在20-100個(gè)堿基左右,將隨機(jī)寡核苷酸文庫與靶分子相互作用,保留結(jié)合的寡核苷酸配基, 經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán),即可使與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集,最終獲得 靶分子的特異寡核苷酸配基。該技術(shù)具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等 優(yōu)點(diǎn)。在臨床檢測(cè)方面,特別是對(duì)一些未知的致病性細(xì)菌或病毒的研究,雖然不知道其內(nèi)部 結(jié)構(gòu)、功能以及這些物質(zhì)的表位,但將其作為靶物質(zhì),通過SELEX技術(shù)篩選到其相應(yīng)的適配 子,以檢測(cè)靶物質(zhì),已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0006] 利用SELEX技術(shù)篩選獲得的適配子識(shí)別分子的模式與蛋白抗體類似,但與蛋白類 抗體相比,核酸類配基具有更多的優(yōu)越性,如不受免疫條件和免疫源性限制,可體外人工合 成,變性與復(fù)性可逆,可修飾并有利于長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸?shù)取8匾氖?,適配子的靶分 子更為廣泛,包括金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸、細(xì)胞因子、輔因子、氨基糖苷、抗生素、堿基 類似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白質(zhì)類靶分子最多,包括酶、生長(zhǎng)因子、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì) 胞粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒和細(xì)菌病原體,甚至完整的細(xì)胞也可以通過復(fù)合 靶子SELEX技術(shù)或消減SELEX技術(shù)篩選出高親和力的寡核苷酸配基。適配子比抗體具有更高 的特異性和精確識(shí)別能力,甚至能識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)分子。這些特性使得適配子 在生物醫(yī)藥和食品衛(wèi)生研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,成為不可缺少的有力工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測(cè)腸致病性大腸桿菌EPEC的方法,提高了它的 檢測(cè)和診斷效率。
[0008] 為了解決現(xiàn)有大腸氏菌檢測(cè)中存在的檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低、假陽性多等問題,本 發(fā)明提供一種特異識(shí)別腸致病性大腸桿菌的試劑盒及其應(yīng)用。
[0009] 上述試劑盒,適配子可以采用生物素標(biāo)記。
[0010] 本發(fā)明中,所述的核酸適配體能夠特異結(jié)合腸致病性大腸桿菌。
[0011] 本發(fā)明另外提供一種腸致病性大腸桿菌適配子的篩選方法。
[0012] 隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0013] 隨機(jī)單鏈DNA文庫:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n35代表35個(gè)A、T、C、G堿基中任意一種的35個(gè)集合)。
[0014] 引物1:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0015] 引物n :5'-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3'
[0016]
[0017]引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0018] 2. SELEX篩選獲得腸致病性大腸桿菌特異的寡核苷酸適配子
[0019] 1) SELEX 篩選過程:
[0020] a.首輪篩選,取合成的隨機(jī)單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結(jié)合緩沖液,95度變性 5min,然后迅速置于冰上lOmin;
[0021 ] b.加入lmL腸致病性大腸桿菌菌懸液2.0 X 108,于37°C搖床lOOrpm結(jié)合1.2小時(shí), 使單鏈DNA文庫與菌充分作用;
[0022] c.更換離心管,以去除與管壁結(jié)合的單鏈DNA,室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結(jié)合的單鏈DNA文庫;
[0023] d.棄上清,加入600yL 1 X沖洗緩沖液,離心10 OOOrpm離心10min,重復(fù)此過程4 次,目的是洗去未與菌結(jié)合的核酸片段;
[0024] e ?接上步離心后去上清,加入lOOliL去離子水99°C加熱3min,高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀,換管留上清(核酸片段存于上清中),-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0025] 2)PCR富集與腸致病性大腸桿菌特異結(jié)合的寡核苷酸適配子:
[0026] 每輪篩選后獲得的與腸致病性大腸桿菌特異結(jié)合的寡核苷酸適配子文庫通過PCR 擴(kuò)增得到富集;
[0027] a.以上述上清為模板,通過引物I和引物IV擴(kuò)增產(chǎn)生一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈 DNA;
[0028] b. PCR擴(kuò)增條件:95 °C預(yù)變性3min,然后進(jìn)行30循環(huán)95 °C變性35s,60 °C退火37s,72 °C延伸33s,最后72°C延伸10min;
[0029] c. PCR產(chǎn)物純化后,一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯(lián)的磁珠結(jié)合,經(jīng)過IX連接(the standard Binding and Washing Buffer,B&W)緩沖液洗滌3次,用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min,使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯(lián)的磁珠上洗脫下來,測(cè)定其單鏈DNA的濃度,用作下一輪篩選的富集庫。
[0030] 3)重復(fù)篩選:重復(fù)上述SELEX篩選過程和PCR擴(kuò)增富集過程,共進(jìn)行12輪篩選,其中 第6、8輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進(jìn)行反篩。
[0031 ]特異識(shí)別腸致病性大腸桿菌的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下:

[0056] 本發(fā)明通過SELEX技術(shù)的篩選過程,獲得高親和性特異識(shí)別腸致病性大腸桿菌的 寡核苷酸適配子(適配體),用于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)腸致病性大腸桿菌。
[0057] 以上述核酸適配子篩選文庫為基礎(chǔ),可對(duì)文庫兩端的固定序列的個(gè)別核苷酸進(jìn)行 替換、顛倒、移位,或?qū)ζ溟L(zhǎng)度進(jìn)行小幅延長(zhǎng)或縮短,或?qū)ξ膸熘虚g的隨機(jī)序列進(jìn)行延長(zhǎng)或 縮短,或?qū)U(kuò)增文庫的引物作相應(yīng)的簡(jiǎn)單改造,然后制備簡(jiǎn)單改造后的文庫和引物進(jìn)行核 酸適配子的篩選、PCR擴(kuò)增和分析與應(yīng)用。
[0058] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明設(shè)計(jì)出了一個(gè)性能優(yōu)秀的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫。文 庫具有接近長(zhǎng)度下限的短固定序列和較長(zhǎng)的隨機(jī)序列,充分保證了文庫中單鏈寡核苷酸的 多樣性。文庫固定序列(引物序列)的獨(dú)特設(shè)計(jì)能使用高退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增,既能有效獲 得目的產(chǎn)物,又能有效抑制非特異性產(chǎn)物。本文庫及引物應(yīng)用于腸致病性大腸桿菌的核酸 適配子篩選獲得成功,所述的適配子可以用于制備檢測(cè)試劑盒,從而用于食品中的腸致病 性大腸桿菌的檢測(cè)。本方法具有檢測(cè)時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),在食 品與衛(wèi)生安全檢測(cè)中能夠得到廣泛應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 實(shí)施例1腸致病性大腸桿菌菌液的制備
[0060] 將購買的保藏編號(hào)為編號(hào)ATCC43887的EPEC菌株,在LB液體培養(yǎng)基試管中,37攝氏 度,180r/min搖動(dòng)過夜,備用。
[0061] 實(shí)施例2適配子的獲得
[0062] 1、隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0063] 隨機(jī)單鏈DNA文庫:5'_
[0064] TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3'(注:n35代表35個(gè)A、T、C、 G堿基中任意一種的35個(gè)集合)。
[0065] 引物 1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0066] 引物 n : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0067] 引物 m : 5 地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0068] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0069] 2. SELEX篩選獲得腸致病性大腸桿菌特異的寡核苷酸適配子
[0070] 1)SELEX 篩選過程:
[0071] a.首輪篩選,取合成的隨機(jī)單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結(jié)合緩沖液,95度變性 5min,然后迅速置于冰上lOmin;
[OO72] b.加入lmL腸致病性大腸桿菌菌懸液2.0 X 108,于37°C搖床lOOrpm結(jié)合1.2小時(shí), 使單鏈DNA文庫與菌充分作用;
[0073] c.更換離心管,以去除與管壁結(jié)合的單鏈DNA,室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結(jié)合的單鏈DNA文庫;
[0074] d.棄上清,加入600yL 1 X沖洗緩沖液,離心10 OOOrpm離心10min,重復(fù)此過程4 次,目的是洗去未與菌結(jié)合的核酸片段;
[0075] e ?接上步離心后去上清,加入lOOliL去離子水99°C加熱3min,高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀,換管留上清(核酸片段存于上清中),-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0076] 2)PCR富集與腸致病性大腸桿菌特異結(jié)合的寡核苷酸適配子:
[0077] 每輪篩選后獲得的與腸致病性大腸桿菌特異結(jié)合的寡核苷酸適配子文庫通過PCR 擴(kuò)增得到富集;
[0078] a.以上述上清為模板,通過引物I和引物IV擴(kuò)增產(chǎn)生一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈 DNA;
[0079] b. PCR擴(kuò)增條件:95 °C預(yù)變性3min,然后進(jìn)行30循環(huán)95 °C變性35s,60 °C退火37s,72 °C延伸33s,最后72 °C延伸lOmin;
[0080] c. PCR產(chǎn)物純化后,一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯(lián)的磁珠結(jié)合,經(jīng)過IX連接(the standard Binding and Washing Buffer,B&W)緩沖液洗滌3次,用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min,使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯(lián)的磁珠上洗脫下來,測(cè)定其單鏈DNA的濃度,用作下一輪篩選的富集庫。 [0081 ] 3)重復(fù)篩選:重復(fù)上述SELEX篩選過程和PCR擴(kuò)增富集過程,共進(jìn)行12輪篩選,其中 第6、8輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進(jìn)行反篩。
[0082] 4)富集寡核苷酸適配子與菌結(jié)合率的測(cè)定:
[0083]第7、9、11、12輪SELEX篩選的產(chǎn)物,以標(biāo)記地高辛的引物m和標(biāo)記生物素的引物IV 進(jìn)行PCR擴(kuò)增,純化的PCR產(chǎn)物與鏈親和素標(biāo)記的磁珠充分反應(yīng)并用NaOH解鏈,地高辛標(biāo)記 的單鏈DNA游離在上清中;
[0084] 5)富集寡核苷酸適配子文庫的測(cè)序結(jié)果與分析:
[0085] a.將最后的富集文庫擴(kuò)增為雙鏈,連接pEGM-T載體,轉(zhuǎn)化E. coli DH5a,隨機(jī)挑取 70個(gè)陽性克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定,其中24個(gè)為可用序列,見SEQ ID NO: 1-24所示;
[0086] 實(shí)施例3結(jié)合特性驗(yàn)證
[0087] 將適配子分別取1.5iig,用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh,純化回收去磷酸 化的DNA;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[y-32P]ATP于去磷酸化的DNA分子末端。lOnmol放射性 標(biāo)記的DNA適配子分別與不同濃度的菌體37°C孵育30min,各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾 過,洗滌濾膜,干燥濾膜,液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射量,同一樣品平行做兩次測(cè)定。 計(jì)算各個(gè)適配子與菌體的解離常數(shù)。結(jié)果如下:
[0090] 從以上結(jié)果可以看出,本發(fā)明的24個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性,現(xiàn)有技術(shù)中 也沒有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合所述的菌體。
[0091] 實(shí)施例5菌體的鑒定
[0092]寡核苷酸適配子SEQ ID NO: 1-24的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 標(biāo)記羥基熒光素(FAM)。
[0093] 取5'FAM熒光標(biāo)記的寡核苷酸適配子SEQ ID N0:l-24(100nM)各300此,分別與腸 致病性大腸桿菌EPEC,腸出血性大腸桿菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌(1.5 X108)于37°C孵育lh,用lXBB(50mM Tris-HCl(pH7.4),5mM KCl,I00mM NaCl,ImMMgCl2)洗 滌2次后,將菌體重懸于500yLlX B B,用BD FACSC alibur流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)結(jié)合上FAM 標(biāo)記的適配子的菌體百分率(測(cè)三次取平均值),結(jié)果顯示腸致病性大腸桿菌寡核苷酸適配 子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合腸致病性大腸桿菌的能力為99.1 %,而針對(duì)腸侵襲性大腸桿菌,腸出血性大腸 桿菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌沒有結(jié)合率。
[0094]這充分說明,本發(fā)明的適配子具有較好的特異性和穩(wěn)定性。
[0095]以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已,并不用于限制本發(fā)明,對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測(cè)的試劑盒,其含有能特異性結(jié)合的核酸適 體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述核酸適體序列如SEQ ID No: 1-24任一 所示。3. -種檢測(cè)食品中腸致病性大腸桿菌的方法,其特征在于利用權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所 述的試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK105929158SQ201610483757
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】楊國林
【申請(qǐng)人】楊國林
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