基于免疫熒光技術的檢測和定位花粉致敏原蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于免疫熒光技術的檢測和定位花粉致敏原蛋白的方法。該方法以花粉過敏IgE陽性血清作為抗體，利用生物素標記的抗人IgE抗體可特異性地識別IgE，Alexa Flour 488標記的鏈霉親和素能與生物素特異結合，通過抗原抗體的特異結合以及對信號的級聯(lián)放大效應，能使花粉中微弱的致敏原信號被凸現(xiàn)出來，以利于用激光共聚焦顯微鏡（LSM710）對花粉致敏原蛋白的相關熒光信號進行檢測和定位。便于在花粉顆粒上直觀地觀察其致敏原的分布、強弱情況。本發(fā)明為研究花粉中致敏蛋白的識別，定位提供了更為直觀有效的方法。所獲得數據可以為分析致敏蛋白的分布特征，了解其致敏特性，為防治人群花粉癥的頻發(fā)提供科學數據。
【專利說明】
基于免疫熒光技術的檢測和定位花粉致敏原蛋白的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種基于免疫熒光技術，激光掃描共聚焦顯微鏡熒光檢測技術，對花粉致敏原蛋白進行檢測和定位的方法。
【背景技術】
[0002]現(xiàn)在，花粉污染和人群過敏現(xiàn)象日益凸顯?，F(xiàn)有的資料表明，過敏性疾病的發(fā)病率大約為20%，城市人群中花粉過敏患者比例呈增加趨勢，并多見在中青年人群中。我國花粉過敏患者的平均發(fā)病率約為2%，在高發(fā)地區(qū)，人群中的花粉過敏及輕度鼻炎過敏的發(fā)病率可以尚達17.8%。花粉中含有豐富的蛋白質，其中的部分油質和多糖蛋白被人吸入后，會被鼻腔的分泌物消化，隨后釋放多種抗體。有花粉過敏史的人再吸入花粉時，會產生過敏反應。
[0003]鑒于潷草、懸鈴木花粉在上海區(qū)域有著廣泛的分布，在上海春秋季大氣中亦有發(fā)現(xiàn)。同時也有研究表明，飛散的花粉在大氣中容易成為各種污染物(大氣細粒子、S0x、N0x等)的載體，由此使得花粉污染導致的疾病機理變得異常復雜；且對人體健康產生嚴重危害，關于花粉致敏現(xiàn)象的研究也引起了越來越多的關注。然而目前對對花粉致敏原的研究多為體外的蛋白與抗體的免疫法分析，常用動物的IgG抗體，結合WESTERNBL0T，ELISA，dotblot等方法，目前為止還沒有關于花粉中致敏原蛋白的定位及檢測相關報道。因此花粉致敏原蛋白的監(jiān)測和在花粉中定位方法的建立，對于研究花粉過敏機制以及預防和減少花粉致敏病癥具有重大的意義。
[0004]免疫焚光技術(Immunofluorescence Technique，IF)是根據抗原抗體特異反應原理，將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢測細胞或組織內的相應抗原(抗體)。使細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上帶有熒光信號，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以檢測熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal)是以激光為照明光源，經過照明針孔對樣品實現(xiàn)點照明，該點所發(fā)射的的熒光信號通過探測針孔被探測器檢測，被照射點以外的發(fā)射光和非焦平面的發(fā)射光均被探測針孔阻擋，因此其可對標本的在焦平面實現(xiàn)點照明、點掃描，最終成像為點成像。通過振鏡在X/Y方向的連續(xù)掃描，Confocal控制軟件將掃描的像素點組成共聚焦圖像，通過電動載物臺沿Z軸方向的連續(xù)掃描，可以獲得樣品不同層面的光切圖像。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于免疫熒光技術的檢測和定位花粉致敏原蛋白的方法。
[0006]免疫熒光技術在測定細胞因子，細胞表面抗原、腫瘤標志物等研究領域有著廣泛應用，但是目前花粉及花粉致敏的研究中還沒有相關報道。本文選用了已經專業(yè)檢測的陽性過敏病人的血清(含有IgE)為抗體，可以更為真實地模擬致敏反應過程，從而更為直觀精確地識別結合花粉過敏原蛋白，原理參見圖1。本文創(chuàng)新性地將免疫熒光技術及花粉過敏病人的血清(含有IgE抗體)相結合，利用抗原抗體的免疫作用，使得熒光信號特異性地標記花粉致敏原蛋白。通過抗原抗體的特異結合以及對信號的級聯(lián)放大效應，能使花粉中微弱的致敏原信號被凸現(xiàn)出來，再利用激光共聚焦掃描顯微鏡進行熒信號光觀察，進而直觀地對花粉里中的花粉致敏原蛋白進行檢測和定位。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案，實驗流程如圖2，具體為:
一種基于免疫熒光技術的檢測和定位花粉致敏原蛋白的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.花粉粒預處理:將花粉用PBS緩沖液浸洗，混勻1min，離心，得到經預處理的花粉；
b.花粉致敏原蛋白與血清中的IgE抗體結合:將步驟a所得經預處理的花粉與過花粉過敏病人的血清按WwVViw=I g: (I?5)ml的質量體積比混勻，避光22-26°C下孵育30min;離心去除上清，再用PBS緩沖液清洗，得到結合IgE抗體的花粉，該結合IgE抗體的花粉用緩沖液清洗；
c.1 gE抗體(一抗)與生物素標記的抗I gE抗體(二抗)結合:將步驟b所得結合I gE抗體的花粉與生物素標記的抗人IgE抗體溶液混勻，生物素標記的抗IgE抗體的溶液濃度為2.4mg/L，結合IgE抗體的花粉與生物素標記的抗人IgE抗體溶液的質量體積比為Wi?/V二抗=1 g:(20?50 )ml，避光22-26 °C孵育I h，離心去除上清，得到結合有抗I gE抗體的花粉，該花粉用PBS緩沖液清洗；
d.生物素標記的抗IgE抗體(二抗)與AlexaFlour 488標記的鏈霉親和素識別:用緩沖液稀釋Alexa Flour 488標記鏈霉親和素至工作濃度為0.5?2yg/ml，得到Alexa Flour488標記鏈霉親和素工作液;后將步驟c所得花粉與該Alexa Flour 488標記鏈霉親和素工作液按WwyVAF488工嫌=1 g: (10?50)ml的質量體積比混勻，避光22?26°C孵育Ih，用PBS緩沖液清洗;所述的緩沖液的組成為:0.005M磷酸鈉，0.125M氯化鈉，pH 7.6;
Alexa Flour 488熒光信號的分布觀察:激光共聚焦掃描顯微鏡，在波長488nm的激發(fā)光下對步驟d所得花粉進行熒光信號檢測。
[0007]本發(fā)明選取新鮮花粉為研究對象，利用已知過敏病人的陽性血清(含IgE抗體)為一抗，標記有生物素的抗人IgE抗體(二抗)特異結合一抗，之后用Alexa Flour 488標記的鏈霉親和素特異性結合生物素，用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM710)觀察熒光信號，從而對花粉致敏原蛋白進行檢測和定位。
[0008]利用此方法，對上海市兩種主要致敏花粉(懸鈴木花粉及潷草花粉)進行了熒光觀察，并對花粉致敏原進行花粉粒上的原位檢測及統(tǒng)計，結果發(fā)現(xiàn)，懸鈴木花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉粒的胞質內，如圖3所示;而潷草花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉粒的外壁上，內部胞質有少量分布，如圖4所示。
[0009]本方法的優(yōu)點及創(chuàng)新之處如下:本文主要是創(chuàng)新性地利用免疫熒光技術的方法，使用花粉過敏病人陽性血清(含IgE)作為抗體，利用激光共聚焦掃描顯微鏡在花粉不同層面檢測花粉中的熒光信號，可以直觀高效地分析致敏蛋白的分布特征，了解其致敏特性，為防治人群花粉癥的頻發(fā)提供科學數據。同時，花粉的直徑大多在20un-30um之間，其粒徑大小符合篩選型流式細胞儀的樣品要求，也可以利用流式細胞儀對花粉的熒光信號強弱等特征，得出對花粉致敏強度的分析。其次，在收集的大氣中，也含有花粉成分，可以應用于大氣污染物中花粉致敏原蛋白的檢測和定位?？偠灾@種基于熒光免疫技術的檢測和定位花粉致敏原蛋白的方法，既可以直觀高效地檢測到花粉中的花粉致敏原蛋白并可以進行精準定位，同時在致敏花粉的數據統(tǒng)計分析，大氣污染物中花粉致敏原的鑒定及分析的研究中具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0010]圖1為花粉致敏原蛋白檢測和定位的原理圖。
[0011]圖2為花粉致敏蛋白檢測和定位的技術路線圖。
[0012]圖3為懸鈴木花粉粒中花粉致敏原蛋白的檢測及定位圖。A488nm下觀察到的熒光信號圖B熒光信號在懸鈴木花粉中的分布圖。
[0013]圖4為潷草花粉粒匯總花粉致敏原蛋白的檢測及定位圖。A488nm下觀察到的熒光信號圖B熒光信號在潷草花粉中的分布圖。
[0014]具體方法步驟I，花粉粒預處理:
取0.05g的花粉(潷草花粉，懸鈴木花粉)置于500ul的離心管中，加入lOOulPBS緩沖液浸洗花粉，震蕩搖勻lOmin。室溫2000rpm離心2min，用移液槍盡量除盡離心管中的上清。
[0015]2，花粉致敏原蛋白與血清中的I gE抗體(一抗)結合: 向離心管中加入花粉過敏病人的血清80111，混勻室溫(22-26°(:)孵育301^11，；室溫
2000rpm離心2min，用移液槍盡量除盡離心管中的上清。后用I3BS緩沖液清洗離心管中的花粉5次，每次用300ulPBS，每次3min。
[0016]注:此步加用PBS緩沖液處理的花粉樣品做空白對照。
[0017]3，I gE抗體(一抗)與生物素標記的抗I gE抗體(二抗)結合:
向離心管中加入ΙΟΟμΙ生物素標記的抗人IgE抗體溶液，混勻室溫(22-26 °C)孵育Ih;室溫2000rpm離心2min，用移液槍盡量除盡離心管中的上清。后用I3BS緩沖液清洗離心管中的花粉5次，每次用300ulPBS，每次3min。
[0018]4，生物素標記的抗IgE抗體(二抗)與Alexa Flour 488標記的鏈霉親和素識別: 用緩沖液稀釋Alexa Flour 488標記鏈霉親和素至工作濃度0.5-2^^/^1，后向離心管中加入10ul的Alexa Flour 488標記鏈霉親和素工作液，避光室溫(22_26°C)孵育lh，用PBS緩沖液清洗離心管中的花粉；
5,Alexa Flour 488熒光信號的分布觀察:
用激光共聚焦掃描顯微鏡(型號LSM710)，在波長488nm的激發(fā)光下對步驟4所得花粉進行熒光信號檢測。
[0019]6，分析熒光信號分布，得出結論。(圖3，圖4)
在激光共聚焦掃描顯微鏡觀察潷草和懸鈴木后，我們發(fā)現(xiàn)懸鈴木花粉上的綠色熒光信號主要集中在花粉內部的胞質部分，而潷草花粉上的熒光信號主要集中在花粉壁上。而空白對照的花粉僅有極微弱的熒光信號。
[0020]根據結果，我們得到懸鈴木花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉內部的胞質中，而潷草花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉壁上，出現(xiàn)熒光信號的花粉表示其致敏性較強，而為出現(xiàn)信號的花粉則表示其致敏性較弱，或者不會引起致敏，熒光信號的強弱可以作為花粉致敏性強弱的參考?？瞻自囼灥慕Y果驗證了此方法的特異性識別，部分出現(xiàn)的微弱的熒光信號可能是植物體內的自發(fā)熒光。
【主權項】
1.一種基于免疫熒光技術的檢測和定位花粉致敏原蛋白的方法，其特征在于該方法的具體步驟為: a.花粉粒預處理:將花粉用PBS緩沖液浸洗，混勻1min，離心，得到經預處理的花粉； b.花粉致敏原蛋白與血清中的IgE抗體結合:將步驟a所得經預處理的花粉與過花粉過敏病人的血清按WwVViw=I g: (I?5)ml的質量體積比混勻，避光22-26°C下孵育30min;離心去除上清，再用PBS緩沖液清洗，得到結合IgE抗體的花粉，該結合IgE抗體的花粉用緩沖液清洗； c.1gE抗體(一抗)與生物素標記的抗IgE抗體(二抗)結合:將步驟b所得結合IgE抗體的花粉與生物素標記的抗人IgE抗體溶液混勻，生物素標記的抗IgE抗體的溶液濃度為2.4mg/L，結合IgE抗體的花粉與生物素標記的抗人IgE抗體溶液的質量體積比為Wi?/V二抗=1 g:(20?50 )ml，避光22-26 °C孵育I h，離心去除上清，得到結合有抗I gE抗體的花粉，該花粉用PBS緩沖液清洗； d.生物素標記的抗IgE抗體(二抗)與AlexaFlour 488標記的鏈霉親和素識別:用緩沖液稀釋Alexa Flour 488標記鏈霉親和素至工作濃度為0.5?2yg/ml，得到Alexa Flour488標記鏈霉親和素工作液;后將步驟c所得花粉與該Alexa Flour 488標記鏈霉親和素工作液按WwyVAF488工嫌=1 g: (10?50)ml的質量體積比混勻，避光22?26°C孵育Ih，用PBS緩沖液清洗;所述的緩沖液的組成為:0.005M磷酸鈉，0.125M氯化鈉，pH 7.6; e.AlexaFlour 488熒光信號的分布觀察:激光共聚焦掃描顯微鏡，在波長488nm的激發(fā)光下對步驟d所得花粉進行熒光信號檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK105929174SQ201610277279
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月1日
【發(fā)明人】王偉倩, 潘瑞琪, 孫賀偉, 夏群芳, 呂森林, 李水軍, 張衛(wèi), 周樹敏, 王青躍
【申請人】上海大學