腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法
【專利摘要】腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法，包括如下步驟：先用過(guò)氧化氫和冰乙酸的混合液離析液浸泡腫柄菊葉片，將處理過(guò)的腫柄菊葉片置于載玻片上撕下下表皮放入染色液中，再先后滴30％過(guò)氧化氫和30％冰乙酸的混合液與有效氯含量≥5.5％的安替福民原液于帶有葉肉的上表皮上，處理1～2min。用鑷子將葉肉除去，制片，在光學(xué)電鏡下觀察。本發(fā)明采用過(guò)氧化氫—冰醋酸混合液離析液處理和次氯酸鈉處理結(jié)合，解決了腫柄菊葉片上表皮制作玻片難的問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】
腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物非切片制片的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]腫柄菊是菊科腫柄菊屬植物，原產(chǎn)于中美非洲地區(qū)，曾做為觀賞植物、綠肥和防止土壤侵蝕，被廣泛引種至亞洲、非洲、北美、澳洲的許多國(guó)家和地區(qū)。目前，在東南亞、南非、 太平洋的一些國(guó)家和地區(qū)，腫柄菊已經(jīng)成為一種入侵草地、河岸、道路綠化的雜草。在中國(guó)， 腫柄菊作為觀賞植物曾被引種至廣東和云南，現(xiàn)在已經(jīng)逃逸到其他的亞熱帶省份。
[0003]對(duì)于防治外來(lái)入侵植物的一個(gè)重要方法是研究和利用入侵的植物。根據(jù)目前所研究的報(bào)道，腫柄菊可以以其根、莖、葉入藥，具有清熱解毒、消暑利水、降低血糖之效，還可以用于治療急慢性肝炎、乙型肝炎、黃疽、膀胱炎、青春痘、癰腫毒瘡等降疾病。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，腫柄菊的水提物和80 %的醇提物能通過(guò)降低胰島素抵抗而改善體內(nèi)葡萄糖的代謝，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明腫柄菊可能具有對(duì)n型糖尿病具有治療作用。另外還有報(bào)道稱腫柄菊葉片的乙烷、乙酸乙酯和甲醇提取物具有抗微生物的活性，如:一定劑量的70%乙醇提取物具有明顯的抗癥活性;倍半砲內(nèi)酯類物質(zhì)(1；[￥6^1；1!'〇1；[11，(1；[￥6181；1!'〇1；[1111161:1171和1:；[1'〇1:1111(1；[11具有抗炎性;tagitinin具有化學(xué)防癌作用。
[0004]為了可以更好的利用腫柄菊，需要對(duì)其植物學(xué)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，而在其植物學(xué)結(jié)構(gòu)特征的研究過(guò)程中對(duì)于葉片的研究是不可或缺的。
[0005]葉片是植物的重要器官，在對(duì)植物的研究中，葉片的研究是很重要的組成部分。植物葉片的結(jié)構(gòu)特征可以用于植物的鑒定和分類，可以評(píng)估植物的適應(yīng)性和抗病性。其中植物葉片表皮的結(jié)構(gòu)是除了受基因的影響之外，還和植物所在的生長(zhǎng)環(huán)境息息相關(guān)。同種植物在不同的生活環(huán)境下，其表皮表現(xiàn)出相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)特征，如氣孔數(shù)量的多少，位置的深淺;表皮毛的多少和長(zhǎng)短，會(huì)體現(xiàn)出不同的抗旱耐澇性。因此，葉片表皮結(jié)構(gòu)上某些變量的研究，要求葉片表皮在制片的過(guò)程中保持葉片的完整性和清晰度。
[0006]在植物葉片的研究中，用于葉片解剖研究的方法從大類上可以分為切片法和非切片法。切片法一般用于觀察植物葉片橫切面結(jié)構(gòu)，大體上可以分為“石蠟切片法”、“冰凍切片法”、“徒手切片法”等方法，這些方法可以切出完整的葉片切面結(jié)構(gòu)，。而對(duì)于葉片表皮的研究，目前可以大致分為“掃描法”、“撕片法”、“離析法”以及“透明法”、“印跡法”以及“水煮法”。“掃描法”可以觀察到葉片表皮表面的立體結(jié)構(gòu)，目前多用的“掃描法”有“掃描電鏡法”?！八浩ā笨梢院芡暾墨@取葉片表皮結(jié)構(gòu)，但是適用范圍較小，僅適用于一些表皮易撕取的肉質(zhì)、膜質(zhì)和紙質(zhì)的植物葉片，而大部分的植物葉片表皮很難撕取，目前多應(yīng)用的是 “徒手撕片法”?！半x析法”主要是運(yùn)用具有氧化性或是強(qiáng)酸強(qiáng)堿性的化學(xué)藥品將葉肉細(xì)胞和其他物質(zhì)溶解掉，使葉片表皮自動(dòng)脫離，目前常用的“離析法”有“有效氯含量多5.5%的安替福民原液法”、“過(guò)氧化氫一醋酸法”、“重鉻酸鉀一硝酸法”、“鹽酸法”、“碳酸鈉法”以及 “氫氧化鈉法”。其中“有效氯含量彡5.5%的安替福民原液法”、“過(guò)氧化氫一醋酸法”、“重鉻酸鉀一硝酸法”主要是利用其強(qiáng)氧化性，“過(guò)氧化氫一醋酸法”多用于離析木材，而在葉片表皮研究過(guò)程中多用“有效氯含量彡5.5%的安替福民原液法”和“重鉻酸鉀一硝酸法”。但是 “有效氯含量多5.5%的安替福民原液法”和“重鉻酸鉀一硝酸法”均存在的缺陷有:它不僅可以將細(xì)胞間隙的物質(zhì)分解掉，還會(huì)分解部分表皮細(xì)胞，難以避免葉片表皮結(jié)構(gòu)被破壞，在操作過(guò)程中需要謹(jǐn)慎注意離析的時(shí)間。有效氯含量多5.5%的安替福民原液法在處理過(guò)程中容易將葉片氧化成碎末，難以得到完整表皮，同時(shí)有效氯含量多5.5 %的安替福民原液具有漂白性，用有效氯含量多5.5%的安替福民原液處理時(shí)間越久，葉片就越難染上顏色?！胞}酸法”、“碳酸鈉法”、“氫氧化鈉法”主要利用其強(qiáng)酸強(qiáng)堿性。
[0007]而在以上的方法中，由于葉片性質(zhì)不同，所需要的藥品濃度和處理時(shí)間都不同。并且在離析過(guò)程中葉片上表皮離析的時(shí)間和葉片表皮的完整性相互矛盾。處理時(shí)間短不能離析出葉片表皮，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)一些表皮結(jié)構(gòu)被破壞，不能獲取完整葉片上表皮或是葉片上表皮難以離析。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法，能夠簡(jiǎn)單方便地獲得清晰的腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)，為腫柄菊的分類鑒定和研究利用做出貢獻(xiàn)。
[0009]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法，包括以下步驟:
[0010](1)、將新鮮的腫柄菊葉片切成1?〇.5cmXl?0.5〇11，用?44固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，置于裝有30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液的指形瓶中，在 80°C烘箱中烘烤7?24小時(shí)；目的是將葉肉細(xì)胞物質(zhì)溶解，使葉片下表皮分離。[〇〇11](2)、將離析好的腫柄菊葉片置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用鑷子和解剖針將腫柄菊葉片下表皮撕下，
[0012](3)、在蒸餾水中，將除去下表皮的腫柄菊葉片置于干凈的載玻片上，使帶有葉肉面貼近載玻片；
[0013](4)、向載玻片上的腫柄菊葉片先滴加30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合液0.5? 2ml，再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml處理1?2min;目的是利用酸性條件下過(guò)氧化氫與有效氯含量多5.5%的安替福民原液反應(yīng)產(chǎn)生氧氣，進(jìn)一步將葉肉細(xì)胞處理干凈。
[0014](5)、將處理之后的載玻片全部浸泡在蒸餾水中，浸泡過(guò)程需要搖動(dòng)蒸餾水1? 2min，再倒掉蒸餾水，重復(fù)操作2?3次;確保完全除去有效氯含量多5.5%的安替福民原液、 過(guò)氧化氫、醋酸的殘留物，防止藥品與固綠、番紅反應(yīng)產(chǎn)生黑色物質(zhì)，影響染色效果；同時(shí)也能將反應(yīng)產(chǎn)生的氣泡趕走，防止封片后材料上粘附氣泡。[〇〇15](6)、將清洗干凈的葉片置于干凈的載玻片上，使葉肉面貼近載玻片，表皮面朝上；[〇〇16](7)、向載玻片上的葉片滴上100%酒精lml，再滴上固綠染色液0.5?2ml，染色1?2min，再傾斜載玻片，然后緩慢滴加70%酒精，以清洗多余的固綠染色液；[〇〇17](8)、向已經(jīng)染好固綠的葉片上滴加番紅染色液0.5?2ml，染色8?10分鐘，傾斜載玻片，緩慢滴加蒸餾水，將番紅染色液清洗干凈；[〇〇18](9)、向葉片中滴加50%甘油lml，用蓋玻片封片，光學(xué)顯微鏡下觀察葉片上表皮結(jié)構(gòu)。
[0019]步驟(1)所述離析液還能夠用10 %鹽酸替代。
[0020]步驟(1)所述在烘箱中烘烤還能夠變換在60 °C烘箱中烘烤36?48小時(shí)。[〇〇21]本發(fā)明人用30%過(guò)氧化氫和30%醋酸法離析羅傘樹(shù)、銅錘玉帶草、九龍、腫柄菊、 勝紅薊時(shí)發(fā)現(xiàn)，30%過(guò)氧化氫和30%醋酸混合液能將大部分植物葉片下表皮自動(dòng)離析出來(lái)，但是對(duì)于上表皮只有羅傘樹(shù)可以自動(dòng)離析，其他的都需要手動(dòng)撕片獲取。其中，腫柄菊葉片的葉肉較厚，且其上表皮與葉肉細(xì)胞黏附牢固，手動(dòng)也不能撕下其上表皮。因此，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)先后滴加30 %過(guò)氧化氫和30 %醋酸混合液與有效氯含量多5.5 %的安替福民原液處理腫柄菊葉肉，可以將其葉肉溶解掉，獲取完整的腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)。[〇〇22]在本發(fā)明中，先用常規(guī)離析液將腫柄菊葉片下表皮離析脫離，然后再先后用30% 過(guò)氧化氫和30%醋酸混合液與有效氯含量多5.5%的安替福民原液處理腫柄菊葉片上表皮黏附的葉肉，使腫柄菊葉片上表皮中粘附的葉肉氧化溶解，進(jìn)而獲取腫柄菊葉片上表皮，為腫柄菊葉片表皮結(jié)構(gòu)的研究做出貢獻(xiàn)，進(jìn)而為腫柄菊的分類鑒定做出貢獻(xiàn)，還可用于腫柄菊的抗性研究。[〇〇23]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:
[0024]1、在腫柄菊葉片上表皮的制片過(guò)程中通過(guò)過(guò)氧化氫一醋酸和次氯酸鈉對(duì)葉片上表皮的處理，簡(jiǎn)單方便地獲得清晰的腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)。[〇〇25]2、步驟(3)主要是為了讓葉肉盡可能的與所滴加的30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合液和有效氯含量多5.5 %的安替福民原液原液接觸，加速葉肉的氧化分解過(guò)程。[〇〇26]3、步驟(4)先后滴加30 %過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合液與有效氯含量彡5.5 %的安替福民原液處理葉片主要是去除黏附于腫柄菊葉片上表皮的葉肉；先加30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合液0.5?2ml，然后再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5? 2ml，除了利用安替福民原液的漂白性使葉片透明之外，主要還是利用在酸性條件下，過(guò)氧化氫與次氯酸鈉反應(yīng)產(chǎn)生的氧氣，使葉肉細(xì)胞氧化速度加快。且由于腫柄菊葉肉組織結(jié)構(gòu)是棉絮狀的，所以在過(guò)氧化氫與次氯酸鈉產(chǎn)生氧氣的時(shí)候，氣泡也同時(shí)能將腫柄菊葉肉組織結(jié)構(gòu)從腫柄菊葉片上表皮中帶離，便于用鑷子清理難以被氧化分解的腫柄菊葉肉組織結(jié)構(gòu)。[〇〇27]4、步驟(5)用蒸餾水清洗有效氯含量多5.5%的安替福民原液是為了防止有效氯含量彡5.5%的安替福民原液與番紅、固綠染色液反應(yīng)，使葉片結(jié)構(gòu)粘上黑色雜質(zhì)。
[0028]5、步驟(6)主要是為了讓葉片上表皮結(jié)構(gòu)朝上，便于清楚觀察到表皮結(jié)構(gòu)?！靖綀D說(shuō)明】[〇〇29]圖1是10x10倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)；
[0030]圖2是10x10倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊下葉片表皮結(jié)構(gòu)；
[0031]圖3是10x40倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊上表皮非腺毛結(jié)構(gòu)；[〇〇32]圖4是10x40倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊上表皮結(jié)構(gòu)；[〇〇33]圖5是10x40倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)；
[0034]圖6是10x10倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊葉片下表皮結(jié)構(gòu)；
[0035]圖7是10x40倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊葉片下表皮結(jié)構(gòu)；
[0036]圖8是10x10倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)；[〇〇37]圖9是10x40倍光學(xué)顯微鏡觀察圖片;腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)。[〇〇38]下面結(jié)合附圖，對(duì)附圖做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。[〇〇39]圖1、圖2是先將固定24小時(shí)以上的葉片置于放有30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液的指形瓶中，在80°C烘箱中處理7?24小時(shí)，然后再先后滴加30%過(guò)氧化氫和30% 冰乙酸混合液與有效氯含量多5.5%的安替福民原液處理后，所獲得的腫柄菊葉片在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察到的上表皮結(jié)構(gòu)，圖中可以清楚觀察到腫柄菊葉片表皮上的表皮毛，但是由于放大倍數(shù)太小所以表皮細(xì)胞看不清。
[0040]圖3、圖4先將固定24小時(shí)以上的葉片置于放有30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液的指形瓶中，在80 °C烘箱中處理7?24小時(shí)，然后再先后滴加30 %過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸混合液與有效氯含量多5.5%的安替福民原液處理后，所獲得的腫柄菊葉片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察到的上表皮結(jié)構(gòu)。圖中可以清楚觀察到腫柄菊葉片表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及葉片表皮上的非腺毛結(jié)構(gòu)。非腺毛結(jié)構(gòu)上的四個(gè)細(xì)胞形狀清晰可見(jiàn)。[0041 ]圖5是僅用30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸混合液處理，所獲得的腫柄菊葉片在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察到的上表皮結(jié)構(gòu)，圖中僅僅是可以觀察到葉片表皮上的非腺毛結(jié)構(gòu)，葉肉組織較多，還有很多葉脈的的痕跡，葉片染色不均勻。[〇〇42]圖6是僅用30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸混合液處理，所獲得的腫柄菊葉片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察到的上表皮結(jié)構(gòu)，圖中可以觀察到葉片結(jié)構(gòu)不完整，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊， 葉片整體染色不均勻。[〇〇43]圖7是先用30 %過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合離析液，水浴98?100 °C加熱處理5 ?7h，然后再先后滴加30 %過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸混合液與有效氯含量多5.5 %的安替福民原液處理后，所獲得的腫柄菊葉片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察到的表皮結(jié)構(gòu)。從圖中可以辨認(rèn)出細(xì)胞和氣孔，表皮細(xì)胞和氣孔都保持完整，但是表皮細(xì)胞和氣孔的結(jié)構(gòu)都不清晰。 [〇〇44]圖8是僅用有效氯含量彡5.5%的安替福民原液，水浴98?100°C加熱處理5?7h 后，所獲得的腫柄菊葉片在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察到的下表皮結(jié)構(gòu)。圖中僅可以觀察到腫柄菊葉片下表皮上著附的非腺毛，非腺毛結(jié)構(gòu)不不清晰，不能觀察到組成非腺毛的四個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu);從圖中還可以觀察得到腫柄菊葉片中表皮中的許多結(jié)構(gòu)已經(jīng)被溶解掉，結(jié)構(gòu)已經(jīng)不完整。
[0045]圖9是僅用有效氯含量彡5.5%的安替福民原液，水浴98?100°C加熱處理5?7h， 所獲得的腫柄菊葉片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察到的下表皮結(jié)構(gòu)。圖中可以僅僅可以觀察到腫柄菊葉片下表皮上的氣孔輪廓和非腺毛著生的基座，細(xì)胞的整體結(jié)果模糊，下表皮細(xì)胞看不清楚?！揪唧w實(shí)施方式】
[0046]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。[〇〇47] 實(shí)施例1[〇〇48]本發(fā)明所述的腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法的一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0049] 將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，置于裝有30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液的指形瓶中，在80°C烘箱中烘烤7?24小時(shí);取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中， 展開(kāi)葉片，再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下;在蒸餾水中，將去除下表皮的葉片置于干凈的載玻片上，使帶有葉肉面貼近載玻片；向裝載玻片上的葉片先滴加30 %過(guò)氧化氫和 30%冰乙酸的混合液0.5?2ml，再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml處理1 ?2min;將處理之后的載玻片全部浸泡在蒸餾水中，浸泡過(guò)程需要搖動(dòng)蒸餾水1?2min，再倒掉蒸餾水，重復(fù)操作2?3次;將清洗干凈的葉片置于干凈的載玻片上，使葉肉面貼近載玻片，表皮面朝上；向載玻片上的葉片滴上100%酒精lml，再滴上固綠染色液0.5?2ml，染色1 ?2min，再傾斜載玻片，然后緩慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固綠染色液；向已經(jīng)染好固綠的葉片上再滴加番紅染色液0.5?2ml，染色8?12min，再傾斜載玻片，緩慢滴加蒸餾水，將番紅染色液清洗干凈；向葉片中滴加50 %甘油lml，用蓋玻片封片;光學(xué)顯微鏡下觀察葉片上表皮結(jié)構(gòu)。由此方法所得到的圖片結(jié)構(gòu)清晰，可以清楚的觀察到葉片上表皮細(xì)胞的形狀，表皮上的附屬物非腺毛的結(jié)構(gòu)。如圖1至圖5所示。
[0050]實(shí)施例2
[0051]本發(fā)明所述的腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法的另一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟: [〇〇52] 將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，置于裝有30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液的指形瓶中，在 80°C烘箱中烘烤36?48小時(shí)；取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，展開(kāi)葉片，再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下；在蒸餾水中，將除去下表皮的葉片置于干凈的載玻片上，使帶有葉肉面貼近載玻片；向裝載玻片上的葉片先滴加30%過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合液0.5?2ml，再滴加有效氯含量彡5.5 %的安替福民原液0.5?2ml處理1?2min;將處理之后的載玻片全部浸泡在蒸餾水中，浸泡過(guò)程需要搖動(dòng)蒸餾水1?2min， 再倒掉蒸餾水，重復(fù)操作2?3次;將清洗干凈的葉片置于干凈的載玻片上，使葉肉面貼近載玻片，表皮面朝上；向載玻片上的葉片滴上100%酒精lml，再滴上固綠染色液0.5?2ml，染色1?2min，再傾斜載玻片，然后緩慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固綠染色液；向已經(jīng)染好固綠的葉片上再滴加番紅染色液0.5?2ml，染色8?12min，再傾斜載玻片，緩慢滴加蒸餾水，將番紅染色液清洗干凈；向葉片中滴加50 %甘油lml，用蓋玻片封片;光學(xué)顯微鏡下觀察葉片上表皮結(jié)構(gòu)。僅用30 %過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合離析液處理，即使是延長(zhǎng)處理時(shí)間也不能直接獲取腫柄菊上表皮結(jié)構(gòu)，撕下下表皮后，再用先后滴加30%過(guò)氧化氫和30% 冰乙酸的混合離析液和有效氯含量多5.5%的安替福民原液處理，所觀察到的結(jié)果與實(shí)施例1相似。
[0053] 實(shí)施例3[〇〇54]本發(fā)明所述的腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法的再一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0055] 將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，置于裝有10 %的鹽酸溶液的指形瓶中，水浴95?100°C處理3?4小時(shí);取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，展開(kāi)葉片，再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下;在蒸餾水中，將除去下表皮的葉片置于干凈的載玻片上，使帶有葉肉面貼近載玻片；向裝載玻片上的葉片先滴加30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合液0.5? 2ml，再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml處理1?2min;將處理之后的載玻片全部浸泡在蒸餾水中，浸泡過(guò)程需要搖動(dòng)蒸餾水1?2min，再倒掉蒸餾水，重復(fù)操作2?3次;將清洗干凈的葉片置于干凈的載玻片上，使葉肉面貼近載玻片，表皮面朝上；向載玻片上的葉片滴上100%酒精lml，再滴上固綠染色液0.5?2ml，染色1?2min，再傾斜載玻片，然后緩慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固綠染色液；向已經(jīng)染好固綠的葉片上再滴加番紅染色液0.5?2ml，染色8?12min，再傾斜載玻片，緩慢滴加蒸餾水，將番紅染色液清洗干凈； 向葉片中滴加lml50%甘油，用蓋玻片封片;光學(xué)顯微鏡下觀察葉片上表皮結(jié)構(gòu)。僅用鹽酸處理的葉片僅僅能獲取腫柄菊葉片下表皮，同樣也還需要用30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液和有效氯含量多5.5%的安替福民原液處理才能獲得腫柄菊葉片上表皮，由此方法所得到的圖片與實(shí)施例1相似。
[0056] 對(duì)照例1[〇〇57] 將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，裝有30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液的指形瓶中，在80°C 烘箱中烘烤7?24小時(shí);取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，展開(kāi)葉片，再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下，用鑷子將葉片中的葉肉刮去;將獲取的腫柄菊葉片上表皮置于干凈的載玻片上，使葉肉面貼近載玻片，上表皮面朝上；向載玻片上的葉片滴上100%酒精lml，再滴上固綠染色液0.5?2ml，染色1?2min，再傾斜載玻片，然后緩慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固綠染色液；向已經(jīng)染好固綠的葉片上再滴加番紅染色液0.5 ?2ml，染色8?12min，再傾斜載玻片，緩慢滴加蒸餾水，將番紅染色液清洗干凈；向葉片中滴加lml50%甘油，用蓋玻片封片;光學(xué)顯微鏡下觀察葉片上表皮結(jié)構(gòu)。僅用30%過(guò)氧化氫和30%醋酸混合液處理的腫柄菊葉片，只能獲取葉片的下表皮，需要刮去葉肉組織才能觀察辨別出腫柄菊葉片上表皮細(xì)胞。但是由此方法所得到的腫柄菊葉片上表皮結(jié)構(gòu)不清晰， 而腫柄菊葉片的上表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)是幾乎觀察不到的，只能在葉肉組織比較薄的地方辨別出上表皮細(xì)胞。如圖8、圖9所示。[〇〇58] 對(duì)照例2
[0059] 將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，裝有30%過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合離析液指形瓶指形瓶中，水浴98?100°C加熱處理5?7h;取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，展開(kāi)葉片，再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下；在蒸餾水中，將去除下表皮的葉片置于干凈的載玻片上，使帶有葉肉面貼近載玻片；向裝載玻片上的葉片先滴加30%過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合液0.5?2ml，再滴加有效氯含量彡5.5 %的安替福民原液0.5?2ml處理1?2min;將處理之后的載玻片全部浸泡在蒸餾水中，浸泡過(guò)程需要搖動(dòng)蒸餾水1?2min， 再倒掉蒸餾水，重復(fù)操作2?3次;將清洗干凈的葉片置于干凈的載玻片上，使葉肉面貼近載玻片，表皮面朝上；向載玻片上的葉片滴上100%酒精lml，再滴上固綠染色液0.5?2ml，染色1?2min，再傾斜載玻片，然后緩慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固綠染色液；向已經(jīng)染好固綠的葉片上再滴加番紅染色液0.5?2ml，染色8?12min，再傾斜載玻片，緩慢滴加蒸餾水，將番紅染色液清洗干凈；向葉片中滴加50 %甘油lml，用蓋玻片封片;光學(xué)顯微鏡下觀察葉片上表皮結(jié)構(gòu)。用30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液處理后的葉片能撕下下表皮，再用30 %過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合離析液和有效氯含量多5.5 %的安替福民原液處理也可以獲得葉片上表皮結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下觀察到的葉片上表皮結(jié)構(gòu)不如實(shí)例1所觀察到的結(jié)構(gòu)清晰完整。如圖5所示。
[0060] 對(duì)照例3[0061 ] 將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，置于裝有效氯含量多5.5%的安替福民原液指形瓶中，水浴98?100 °(:加熱處理5?7h;取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，展開(kāi)葉片，再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下。而經(jīng)效氯含量多5.5%的安替福民原液處理的腫柄菊葉片被漂白透明，用鑷子輕輕劃過(guò)葉片表面葉片也會(huì)變成碎末，可以獲得下表皮，但是結(jié)構(gòu)不完整，完全不能獲取上表皮，制片之后無(wú)論在哪個(gè)顯微鏡的倍數(shù)下都只能觀察到葉片下表皮的結(jié)構(gòu)，而且其結(jié)構(gòu)不清晰。如圖6、圖7所示。
[0062] 對(duì)照例4[〇〇63] 將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，置于裝有10 %重鉻酸鉀和10 %硝酸混合液的指形瓶中，水浴85?90 °C處理3?6小時(shí);取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，展開(kāi)葉片， 再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下。由于重鉻酸鉀和硝酸的氧化性較強(qiáng)，除了能把葉肉溶解掉之外，還能將部分的葉片表皮溶解掉，使葉片表皮結(jié)構(gòu)不清晰，也很難在處理出葉片上表皮。
[0064]對(duì)照例5
[0065]將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，將固定24 小時(shí)以上的葉片取出，置于裝有10 %的氫氧化鈉和10 %的碳酸鈉混合液的指形瓶中，水浴加熱1?2h;取出指形瓶，用鑷子將葉片夾出，置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，展開(kāi)葉片，再用鑷子和解剖針將葉片下表皮撕下。用此方法腫柄菊葉片變黑，可以獲得葉片下表皮，但是很難撕取;葉片上表皮不能撕取，即使再用30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液和有效氯含量多5.5%的安替福民原液處理也不能獲取葉片上表皮結(jié)構(gòu)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1 )、將新鮮的腫柄菊葉片切成1?0.5cm X 1?0.5cm，用FAA固定液固定，將固定24小時(shí) 以上的葉片取出，置于裝有30%過(guò)氧化氫和30%冰乙酸的混合離析液的指形瓶中，在80°C 烘箱中烘烤7?24小時(shí)；(2)、將離析后的腫柄菊葉片置于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用鑷子和解剖針將腫柄菊葉 片下表皮撕下，(3)、在蒸餾水中，將除去下表皮的腫柄菊葉片置于干凈的載玻片上，使帶有葉肉面貼 近載玻片；(4)、向載玻片上的腫柄菊葉片先滴加30 %過(guò)氧化氫和30 %冰乙酸的混合液0.5?2ml， 再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml處理1?2min;(5)、將處理之后的載玻片全部浸泡在蒸餾水中，浸泡過(guò)程需要搖動(dòng)蒸餾水1?2min，再 倒掉蒸餾水，重復(fù)操作2?3次；(6)、將清洗干凈的葉片置于干凈的載玻片上，使葉肉面貼近載玻片，表皮面朝上；(7)、向載玻片上的葉片滴上100 %酒精lml，再滴上固綠染色液0.5?2ml，染色1? 2min，再傾斜載玻片，然后緩慢滴加70%酒精，以清洗多余的固綠染色液；(8)、向已經(jīng)染好固綠的葉片上滴加0.5?2ml番紅染色液，染色8?10分鐘，傾斜載玻 片，緩慢滴加蒸餾水，將番紅染色液清洗干凈；(9)、向葉片中滴加50%甘油lml，用蓋玻片封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察葉片上表皮結(jié) 構(gòu)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法，其特征在于，步驟(1)所 述離析液還能夠用1 〇 %鹽酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫柄菊葉片上表皮離析制片的方法，其特征在于，步驟(1)所 述在烘箱中烘烤還能夠在60 °C烘箱中烘烤36?48小時(shí)。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK105954083SQ201610481889
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】周瓊, 裴艷艷, 陸志森, 陳書(shū)權(quán), 韋遠(yuǎn)濤
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)